HBVx基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響

1、HBVx基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響 作者：郭雙平王文亮翟宇強(qiáng) 【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒x基因 關(guān)鍵詞: 乙型肝炎病毒x基因;真核表達(dá)載體;肝癌細(xì)胞 摘 要:目的 構(gòu)建乙型肝炎病毒x基因真核表達(dá)載體并在肝癌細(xì)胞中表達(dá)，以研究其對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響. 方法 應(yīng)用PCR、基因克隆等方法構(gòu)建乙型肝炎病毒x基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HBX，用基因轉(zhuǎn)染的方法將pcD-NA3.1-HBX轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞HCC-9204，篩選穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細(xì)胞.MTT比色實(shí)驗(yàn)、平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞惡性表型. 結(jié)果 成功構(gòu)建了乙型肝炎病毒x基因真核表達(dá)載體pcDNA3.

2、1-HBX并獲得了穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細(xì)胞系HCC-9204細(xì)胞克隆，且MTT比色實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細(xì)胞惡性度增高. 結(jié)論 乙型肝炎病毒X蛋白具有生長(zhǎng)因子樣作用，可刺激肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，在肝癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌細(xì)胞惡性表型. Keywords:HBV x gene;eukaryotic expression vector;hepa-tocellular carcinoma cell 1 / 18Abstract:AIM To construct and express the eukaryotic ex-pression

3、vector of HBV x gene and study its effect on the ma-lignant phenotype of hepatocellular carcinoma cells.METHODS Polymerase chain reaction（PCR）and other molecular biological methods were used to construct theeukaryotic expression vector of HBV x gene pcDNA3.1-HBX.Then gene transfection mediated by th

4、e lipofectamine was used to introduce the eukaryotic expression vector of HBV x gene into human hepatocellular carcinoma cell line HCC-9204.The selective medium containing G418was used to select the cell clones which express the X protein of HBV constantly.MTT colorimetric analysis experiment and ag

5、arose colony-forming were used to study the role of the X protein in the malignant phenotype and growth of hepatocel-lular carcinoma cells.RESULTS The eukaryotic expression vector of HBV x gene was successfully constructed.The cell clones which expressed the X protein constantly were ob-tained by th

6、e selective medium containing G418.Cells which constitutively expressed the X protein had a relatively higher malignant phenotype.CONCLUSION The X protein has growth factor-like activities and can stimulate the growth of hepatocellular carcinoma cells and enhance its malignant phe-notype. 0 引言 乙型肝炎病

7、毒（HBV）相關(guān)的原發(fā)性肝癌發(fā)病率和死亡率都很高，HBV與原發(fā)性肝癌之間存在著密切的關(guān)系.闡明二者的關(guān)系將對(duì)探討HBV相關(guān)的原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防及治療具有重要意義.為此，本研究首先構(gòu)建了HBV x基因真核表達(dá)載體，并通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至人HCC-9204肝癌細(xì)胞，經(jīng)過(guò)藥物篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)HBV X蛋白的細(xì)胞克隆，觀察肝癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染外源性HBV x基因后細(xì)胞惡性表型的變化. 1 材料和方法 1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HCC-9204為病理學(xué)教研室建株.肝癌細(xì)胞取自60歲男性肝癌患者手術(shù)標(biāo)本，病理診斷為肝細(xì)胞肝癌級(jí).MTT購(gòu)自Sigma公司，Taq DNA聚合酶、G418購(gòu)自Promeg

8、a公司，EcoR I，Kpn I，BamH I，T4 DNA連接酶為華美公司產(chǎn)品，兔抗HBx多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Fox Chase癌癥中心，地高辛DNA隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司，HBV x基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成. 1.2 HBV x基因克隆及序列測(cè)定 1.2.1 PCR法從質(zhì)粒pTTHK中擴(kuò)增HBV x基因 模板為含HBV DNA的質(zhì)粒pTTHK，分別在PCR引物的上游引物和下游引物的5端加上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I酶切位點(diǎn)，引物順序如下:上游引物5ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3;下游引物5GGAGAATTCAT-GATTAG

9、GCAGAGGTG3. 應(yīng)用上述引物對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR，按下列條件在PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR.945min591min741min，循環(huán)30次后，74延伸10min.陰性對(duì)照除不含模板DNA外，其他成分與實(shí)驗(yàn)組相同. 1.2.2 PCR產(chǎn)物與克隆載體pT7Blue連接 先用EcoR V將克隆載體pT7Blue切成線性，然后將回收的PCR產(chǎn)物HBx DNA片段接于克隆載體pT7-Blue.取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5大腸桿菌，挑選單菌落，篩選重組體. 1.2.3 篩選重組體pT7Blue-HBX 取上述質(zhì)粒用EcoRI和KpnI雙酶切鑒定. 1.2.4 序列測(cè)定 選擇酶切結(jié)果正確的細(xì)菌

10、菌落，提取質(zhì)粒DNA并純化.用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，將510g質(zhì)粒DNA溶于三蒸水，用DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定. 1.2.5 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HBX的構(gòu)建 將已經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的重組質(zhì)粒pT7Blue-HBX及真核表達(dá)載體pcDNA3.1分別用EcoRI和KpnI雙酶切，用DNA回收試劑盒回收并純化HBx和pcDNA3.1片段，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接.EcoRI和KpnI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HBX. 1.3 基因轉(zhuǎn)染及篩選 用脂質(zhì)體載體法將經(jīng)聚乙二醇6000純化的pcDNA3.1-HBX和pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCC-9204肝癌細(xì)胞，參照GIB

11、CORL說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.接種細(xì)胞于選擇性培養(yǎng)液含G418700mg・L-1 ，培養(yǎng)1wk后換于含G418500mg・L-1 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).同時(shí)設(shè)對(duì)照，用選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞. 1.4 HBV x基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 原位雜交法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBX質(zhì)粒的第四代肝癌細(xì)胞中HBV x mRNA，探針用DNA隨機(jī)引物法進(jìn)行標(biāo)記.對(duì)照實(shí)驗(yàn):設(shè)未轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞為陰性對(duì)照，不加探針的空白對(duì)照.免疫熒光法檢測(cè)經(jīng)G418篩選的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBX或pcDNA3.1質(zhì)粒的第四代 肝癌細(xì)胞中X蛋白.對(duì)照實(shí)驗(yàn):空白對(duì)照分別用PBS代替

12、一抗或二抗.陰性對(duì)照為未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的HCC-9204肝癌細(xì)胞爬片. 1.5 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1HBX質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響 1.5.1 四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn) 將未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的HCC-9204肝癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的肝癌細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)X蛋白的肝癌細(xì)胞，阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底時(shí)，將培養(yǎng)板移入4冰箱放置1h，分別用200L濃度為5，10，20，40和80mol・L-1 阿霉素作用于細(xì)胞，每3孔為1組，濃度相同，37，5mL・L-1 CO2 及飽和濕度下培養(yǎng).3h后，吸棄藥液，培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，換新的完全培養(yǎng)

13、液200L繼續(xù)培養(yǎng)6h.每孔加新鮮配制的MTT（5g・L-1 ）20L作用4h，加二甲基亞砜（DMSO）150L，振蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔在490nm波長(zhǎng)的吸光度，記錄結(jié)果. 1.5.2 平板集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBX，pcDNA3.1質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞及未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞HCC-9204，制成單細(xì)胞懸液;按每個(gè)培養(yǎng)皿含2000個(gè)細(xì)胞的密度分別接種.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)細(xì)胞隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率并進(jìn)行2 檢驗(yàn). 2 結(jié)果 2.1 HBV x基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1HBX的構(gòu)建 2.1.1

14、 HBV x基因的克隆及序列測(cè)定 應(yīng)用HBV x基因的引物，對(duì)含HBV DNA的質(zhì)粒pTTHK模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳結(jié)果顯示僅在480bp處有單一條帶，陰性對(duì)照為陰性（Fig1）. 圖1 略 2.1.2 HBV x DNA與克隆載體pT7Blue的連接及重組體的鑒定 回收并純化480bp大小的HBV x DNA與克隆載體pT7Blue的連接復(fù)合物，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI和KpnI雙酶切鑒定，結(jié)果表明HBV x DNA已克隆到pT7Blue載體，構(gòu)建成重組體pT7Blue-HBX（Fig2）. 圖2 略 2.1.3 重組體pT7Blue-HBX序列測(cè)定 將已經(jīng)酶切鑒定的pT7Blu

15、e-HBX重組質(zhì)粒，經(jīng)DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列分析，表明克隆到pT7Blue中的PCR產(chǎn)物是HBV x基因，屬adw2型. 2.1.4 HBV x基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 取經(jīng)過(guò)測(cè)序的重組質(zhì)粒pT7Blue-HBX用EcoRI和KpnI雙酶切，將HBV x片段定向克隆于真核表達(dá)載體pcD-NA3.1，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5大腸桿菌，篩選重組質(zhì)粒，酶切鑒定，電泳結(jié)果見(jiàn)Fig3.表明HBV x基因已被定向克隆于真核表達(dá)載體，構(gòu)建成了HBV x基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HBX. 圖3 略 2.2 HBV x基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 2.2.1 基因轉(zhuǎn)染 用脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別將經(jīng)聚乙二醇6000純化的pc

16、DNA3.1-HBX和pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人HCC-9204肝癌細(xì)胞，3d后用G418篩選抗 G418肝癌細(xì)胞，2wk后絕大多數(shù)細(xì)胞都死亡，僅殘留少數(shù)貼壁細(xì)胞.貼壁細(xì)胞逐漸呈克隆性生長(zhǎng)（Fig4），待細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底面積60%時(shí)，將部分細(xì)胞凍存，部分細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng).對(duì)照組結(jié)果，未轉(zhuǎn)染基因的肝癌細(xì)胞，經(jīng)相同濃度G418作用2wk后，細(xì)胞全部死亡，初步說(shuō)明基因轉(zhuǎn)染成功. 2.2.2 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)肝癌細(xì)胞中HBV x基因的表達(dá) 原位雜交法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中HBV X mRNA，按常規(guī)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBX質(zhì)粒的第四代肝癌細(xì)胞中HBV X mRNA，未轉(zhuǎn)染基因的肝癌細(xì)胞為陰性對(duì)照.在實(shí)驗(yàn)組細(xì)

17、胞，結(jié)果可見(jiàn)藍(lán)紫色顆粒樣物位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均無(wú)陽(yáng)性信號(hào)（Fig5）.說(shuō)明HBV x基因被轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄成mRNA. 2.2.3 免疫熒光法檢測(cè)X蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 按常規(guī)方法檢測(cè)X蛋白在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBX質(zhì)粒的第四代肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞為陰性對(duì)照.熒光顯微鏡下觀察，在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可見(jiàn)黃綠色熒光，對(duì)照組細(xì)胞無(wú)黃綠色熒光.說(shuō)明，轉(zhuǎn)染HBV x基因的肝癌細(xì)胞表達(dá)X蛋白. 2.3 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1HBX對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響 2.3.1 MTT比色試驗(yàn) 取每組3個(gè)孔數(shù)據(jù)均數(shù)，進(jìn)行方差分析，兩兩比較.5

18、，10和20mol・L-1 阿霉素作用各組細(xì)胞時(shí)，穩(wěn)定表達(dá)X蛋白肝癌細(xì)胞的A490nm 值顯著高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染空載體及未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞（P<0.05）.轉(zhuǎn)染空載體及未轉(zhuǎn)染基因的肝癌細(xì)胞比較，各個(gè)濃度阿霉素作用后，A490nm 值差異均無(wú)顯著性（P>0.05，Tab1）. 表1 阿霉素誘導(dǎo)HCC-9204細(xì)胞凋亡的MTT試驗(yàn)結(jié)果略 2.3.2 平板集落形成實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定表達(dá)X蛋白的肝癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染空載體的肝癌細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染基因的親本細(xì)胞各2000個(gè)/每皿，接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2wk后可見(jiàn)細(xì)胞集落形成，姬姆薩染色（Fig6，7），計(jì)算克隆形

19、成率，分別為75.6%，38.9%和41.7%.2 檢驗(yàn)顯示，穩(wěn)定表達(dá)X蛋白的肝癌細(xì)胞克隆形成率較其他兩種細(xì)胞高，并且差異有顯著性（P<0.05），轉(zhuǎn)染空載體的肝癌細(xì)胞克隆形成率與親本細(xì)胞克隆形成率相近，差異無(wú)顯著性（P>0.05）. 圖4 圖7 略 3 討論 原發(fā)性肝癌的發(fā)生和HBV感染密切相關(guān)，是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一.研究表明，HBV感染與原發(fā)性肝癌之間存在著密切的關(guān)系，特別是HBV x基因編碼的X蛋白具有反式激活作用，可激活病毒和細(xì)胞基因，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，與病毒復(fù)制和慢性感染狀態(tài)的維持相關(guān)，在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用1 .為研究X蛋白的功能，已建立了不少

20、HBV x基因表達(dá)體系，有在大腸桿菌表達(dá)融合蛋白的，有在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的，也有在人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的.不論那種表達(dá)體系和檢測(cè)形式X蛋白均具有活性，說(shuō)明X蛋白功能域穩(wěn)定，在各種細(xì)胞內(nèi)其活性均不受影響.為研究X蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響，本研究首先構(gòu)建了HBV x基因真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞HCC-9204，并經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)X蛋白的肝癌細(xì)胞克隆.MTT比色試驗(yàn)、平板集落形成試驗(yàn)表明穩(wěn)定表達(dá)X蛋白的肝癌細(xì)胞惡性程度增高，克隆形成率高于未轉(zhuǎn)染基因的親本細(xì)胞.細(xì)胞生長(zhǎng)力旺盛、分裂相極多見(jiàn)，完全失去接觸性抑制呈多層生長(zhǎng).表明X蛋白具有生長(zhǎng)調(diào)控蛋白樣作用，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞生

21、長(zhǎng)，使肝癌細(xì)胞惡性程度增高. X蛋白屬于核蛋白，但在轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核.這與一些研究報(bào)道一致，在HBV急慢性感染的肝組織和肝癌組織中，X蛋白共存于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核2 .X蛋白在細(xì)胞中的位置與細(xì)胞種類，狀態(tài)及X蛋白的作用狀態(tài)有關(guān)，細(xì)胞中不同的X結(jié)合蛋白決定了X蛋白在細(xì)胞中的定位，而且不同定位的X蛋白在細(xì)胞中發(fā)揮的作用不同.細(xì)胞質(zhì)中的X蛋白可影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，已發(fā)現(xiàn)X蛋白可影響細(xì)胞Ras/Raf/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑3，4 ，X蛋白可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-B5，6 ，還可與p53形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合體7，8 ，影響p53介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)9 .X蛋白具有生長(zhǎng)調(diào)控蛋白樣作用，不恰當(dāng)?shù)丶せ钚?/p>

22、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)10 . 在HBV相關(guān)的原發(fā)性肝癌發(fā)生過(guò)程中，HBV x基因最常被整合入宿主細(xì)胞基因組，并且整合的x基因可編碼在體內(nèi)外都具有反式激活作用的X蛋白8 .隨著HBV復(fù)制，表達(dá)病毒膜抗原的肝細(xì)胞被機(jī)體免疫反應(yīng)識(shí)別并清除，而含有整合型病毒基因的肝細(xì)胞，由于病毒基因的缺陷可逃逸機(jī)體免疫反應(yīng)，并隨著肝細(xì)胞再生而呈克隆性增生，成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞 11 .在其他致癌因素協(xié)同作用下促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，這可能是HBV相關(guān)的原發(fā)性肝癌發(fā)生的重要機(jī)制之一. 參考文獻(xiàn): 1Seifer M，Hohne M，Schaefer S，Hoeijmakers JH，Curtis CH.In vitro tumo

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