骨髓增生異常綜合征惡性轉(zhuǎn)化過程中cmyc和MMP9表達(dá)的變化及其意義

1、骨髓增生異常綜合征惡性轉(zhuǎn)化過程中c-myc和MMP-9表達(dá)的變化及其意義【摘要】 目的 探討c-myc和MMP-9在骨髓增生異常綜合征（MDS）惡性轉(zhuǎn)化中的意義。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測c-myc mRNA和MMP-9 mRNA在MDS低危（RA, RARS）、高危（RAEB，RAEB-t）及MDS-AML變組患者骨髓單個核細(xì)胞中的表達(dá)，并與10例正常對照進(jìn)行比較。結(jié)果 MDS高危組、MDS-AML變組c-myc表達(dá)高于MDS低危組及正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），高表達(dá)c-myc的MDS患者易轉(zhuǎn)化成急性白血病。MMP-9在MDS中的表達(dá)與正常對照差異

2、無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），但3例骨髓原始細(xì)胞數(shù)在70%以上的MDS-AML變患者骨髓仍高水平表達(dá)MMP-9。結(jié)論 c-my在MDS的發(fā)展、轉(zhuǎn)化過程中起重要作用，并對判斷預(yù)后有一定的臨床意義；MMP-9在MDS惡性轉(zhuǎn)化中的作用有待進(jìn)一步研究。 【關(guān)鍵詞】 骨髓增生異常綜合征；c-myc基因；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；美法侖 【Abstract 】 Objective To investigate the role of MMP-9 and c-myc in the transformation from myelodysplastic syndromes(MDS) to acute myeloid

3、leukemias(AML). Methods The expression of MMP-9 and c-myc in bone marrow mononuclear cells (BM-MNCs) of patients with low-risk stage of myelodysplastic syndromes（RA, RARS），high-risk stage of myelodysplastic syndromes（RAEB，RAEB-t） acute myeloid leukemia secondary to MDS and normal control were examin

4、ed by using the revert transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)method.Results The expression level of c-myc in BM-MNCs of patients with RAEB or RAEB-t were significantly higher than that in RA or RARS（P0.05）,and displayed an increasing tendency with transformation to leukemia. The expression

5、level of MMP-9 mRNA had no significant changes（P0.05）, however three patients with acute myeloid leukemia secondary to MDS,in which the ratio of blast cells exceed 70% , also presented high expression level of MMP-9.Conclusion c-myc may play an important role in myelodysplastic syndromes progression

6、，however，the role of MMP-9 remains to be studied further. 2 / 14 【Key words】 myelodysplastic syndromes,c-myc gene,matrix metalloproteinases-9,melphalan 骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組異質(zhì)性克隆性疾病，其基本病變?yōu)樵煅?祖細(xì)胞發(fā)育異常和高風(fēng)險向白血病轉(zhuǎn)化。原癌基因c-myc作為調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因之一，其過度表達(dá)參與多種腫瘤的發(fā)生，而MDS的發(fā)病與細(xì)胞凋亡及增殖的異常改變有關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）主要功能之一是降解細(xì)胞外基質(zhì)，骨

7、髓微環(huán)境中MMP-9與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的紊亂可以破壞造血細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，影響造血細(xì)胞的生長、增殖、分化和正常功能的發(fā)揮。我們用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測了MDS患者骨髓單個核細(xì)胞c-myc基因和MMP-9的表達(dá)，探討二者在MDS惡性轉(zhuǎn)化過程中的表達(dá)及意義。 1 資料與方法 1.1 臨床資料 所有病例來自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院血液腫瘤中心、山東省千佛山醫(yī)院、濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院、濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院2004年10月2007年5月的住院患者。MDS患者23例，男13例，女10例；年齡5475歲，中位年齡62歲。其中難治性貧血（RA）6例，難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞（RAS）5例，難治性貧血

8、伴原始細(xì)胞增多（RAEB）5例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多轉(zhuǎn)變型（RAEB-t）7例；將RA和RAS分入低危組，RAEB和RAEB-t分入高危組，所有患者均為初治；MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病7例，診斷標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)1。正常對照10例，年齡2555歲，中位年齡33歲，均為健康志愿者。所有患者均給予支持治療。低?；颊呤走x免疫抑制劑，如環(huán)孢素A、沙利度胺等；高危組且年齡75歲不適合AML樣化療者，給予美法侖口服（2 mg/d,連服24個月），年齡55歲的高危和MDS-AML變患者給予AML方案化療，如DA方案（柔紅霉素+阿糖胞苷）、TA方案（拓?fù)涮婵?阿糖胞苷）等。 1.2 試劑與儀器 PTC-150型PCR

9、擴(kuò)增儀為美國MJ Research公司產(chǎn)品，EC250-90多功能電泳儀為美國EC公司產(chǎn)品，ID Image Analysis software 凝膠分析系統(tǒng)為美國Kodak公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。 13 實驗方法 13.1 標(biāo)本采集：均在無菌條件下抽取骨髓液34 ml，注入EDTA抗凝試管中，加入4ml PBS（pH7.4）緩沖液稀釋。采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，80保存?zhèn)溆谩?13.2 總RNA提?。悍謩e將上述收獲的MDS患者骨髓單個核細(xì)胞按相同比例混合，加入Trizol(Invitrogen,USA)試劑，按照公司提供的步驟進(jìn)

10、行總RNA的提取。RNA的濃度及質(zhì)量通過1的瓊脂糖凝膠電泳測定。 13.3 引物：引物由上海生工生物工程公司合成。 c-myc引物序列： P1 5-GATTCTCTGCTCTCCTCGAC-3，P2 5-TCCAGACTCTGACCTTTTGC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物180 bp。 MMP-9引物序列： P1 5-GAGATGCGTGGAGAGTCGAA-3，P2 5-CCGAGTTGGAACCACGACGC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物489 bp。 GAPDH引物序列： P1 5-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3，P2 5-CATCTCTTGCTCGAA-3，擴(kuò)增產(chǎn)物317 bp。 13.4 逆轉(zhuǎn)錄

11、反應(yīng)：于經(jīng)DEPC處理過的0.5 ml Eppendor管中建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：細(xì)胞總RNA 1 l，MMLV 1 l，dNTP 1 l，DTT 2 l，5×buffer 4 l，下游引物1 l，去RNase水10 l，2 000 r/min快速離心，混勻，37 1 h，95 10 min，滅活MMLV，2 000 r/min快速離心，使蒸氣沉于管底。 13.5 聚合酶鏈反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄成功后，在上述20l RT產(chǎn)物的0.5 ml Eppendorf管中，建立下列反應(yīng)體系：dNTP 1l，buffer 10 l，MgCl2 28 l，Taq polynase 2 l，上游引物1 l，超純

12、水（D.D.W）58 l，快速離心混勻，95 5 min，冰浴冷卻，然后3 000 r/min快速離心，使蒸氣沉于管底，加入2 l TaqDNA聚合酶，3 000 r/min快速離心，加入60 l液體石蠟油。94，1 min，58，1 min，72，1 min，共35個循環(huán)，最后72延長7 min。 13.6 定量分析：取10 l PCR產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳圖像輸入Kodak凝膠分析系統(tǒng)，應(yīng)用ID Image Analysis software 進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析，結(jié)果判斷以同時擴(kuò)增的內(nèi)參照GAPDH的表達(dá)強(qiáng)度為基準(zhǔn)，c-myc/GAPDH、MMP-9/GAPDH代表c-myc和M

13、MP-9的相對表達(dá)量。 1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果。結(jié)果用x±s表示，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié)果 21 c-myc基因在MDS和MDS-AML變患者中的表達(dá)結(jié)果見表1。MDS高危組、MDS-AML變組患者c-myc基因表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。MDS-AML變組c-myc基因表達(dá)高于MDS高危組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。MDS高危組、MDS-AML變組患者c-myc基因表達(dá)水平明顯高于MDS低危組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。MDS低危組c-myc基因

14、表達(dá)水平高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 表1 c-myc基因在MDS不同臨床階段及對照組中的表達(dá)情況注：#與高危組比較P0.05；*與MDS-AML組比較P0.05；與對照組比較P0.05；與對照組比較P0.05 22 MMP-9在MDS和MDS-AML變患者中的表達(dá)結(jié)果見表2。MDS低危組、高危組、MDS-AML變組MMP-9表達(dá)與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），MDS低危組、MDS高危組、MDS-AML變組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。但3例骨髓原始細(xì)胞數(shù)在70%以上的MDS-AML變患者骨髓仍高水平表達(dá)MMP-9，平均表達(dá)水平為0.4168。表2

15、 MMP-9在MDS不同臨床階段及對照組中的表達(dá)情況注：與高危組比較P0.05； 與MDS-AML組比較P0.05；與對照組比較P0.05 23 c-myc、MMP-9表達(dá)在MDS惡性轉(zhuǎn)化過程中的變化 對23例MDS患者進(jìn)行了25個月的隨訪觀察，1例RAEB16個月后轉(zhuǎn)化為急性白血病，2例RAEB-t分別于7、20個月后轉(zhuǎn)化為白血病，以上3例患者c-myc表達(dá)分別為0.4821、0.4933、0.5056，轉(zhuǎn)化為白血病后c-myc表達(dá)分別為0.7031、0.7278、0.7234,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。MMP-9表達(dá)在上述3例MDS轉(zhuǎn)化為白血病前后變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。

16、 24 初治MDS、MDS-AML變患者c-myc、MMP-9表達(dá)與治療的關(guān)系 RAEB 2例，RAEB-t 3例，MDS-AML 2例，口服小劑量美法侖2 mg/d，連用2月，達(dá)CR 2例，NR 1例。RAEB-t 4例，MDS-AML 5 例用DA或TA方案化療，達(dá)CR 4 例，NR 5 例。CR患者c-myc平均表達(dá)水平為0.1524，NR患者c-myc 平均表達(dá)水平為0.6193，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。CR患者M(jìn)MP-9平均表達(dá)水平為0.3961，NR患者M(jìn)MP-9表達(dá)水平為0.4116。差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 3 討論 MDS是一組造血干細(xì)胞克隆性疾病，以骨髓病態(tài)

17、造血、外周血細(xì)胞減少和高風(fēng)險向急性白血病轉(zhuǎn)化為特征。MDS發(fā)展過程中凋亡受抑和過度增殖，使異常增生的單克隆造血進(jìn)一步惡變而向急性白血病轉(zhuǎn)化。原癌基因c-myc作為調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因之一，在調(diào)控細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用，其過度表達(dá)可刺激細(xì)胞周期進(jìn)程，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生。Felsher等2研究證實，c-myc的表達(dá)導(dǎo)致髓系和淋巴系惡性腫瘤的形成，一些腫瘤的形成要求初始的c-myc基因的損傷。我們用RT-PCR方法對MDS和MDS-AML患者骨髓單個核細(xì)胞c-myc基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，MDS高危組、MDS-AML變組c-myc表達(dá)水平明顯高于正常對照和MDS低危組，MDS

18、-AML變組明顯高于MDS高危組，初步提示c-myc表達(dá)增高與MDS的病情進(jìn)展及轉(zhuǎn)化有關(guān)，這與陳萍等3的研究報道一致。同時發(fā)現(xiàn)MDS高危組患者轉(zhuǎn)化為白血病后c-myc表達(dá)水平明顯升高，MDS-AML患者經(jīng)治療CR后c-myc水平明顯下調(diào)，因此，c-myc可能對預(yù)測MDS的演變和判斷化療療效有一定意義。 基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）可降解形成基膜結(jié)構(gòu)的明膠和、型膠原及彈性蛋白等4。骨髓微環(huán)境中MMP-9與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的紊亂可以破壞造血細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，影響造血細(xì)胞的生長、增殖、分化和正常功能的發(fā)揮。正常情況下，在造血細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9的合成開始于髓系分化的后期階段5。研究6發(fā)現(xiàn)，

19、急性髓系白血病原始細(xì)胞和白血病細(xì)胞株K-562、KG-1、HEL、HL-60均可過早合成MMP-9。本研究結(jié)果顯示，但是3例骨髓原始細(xì)胞數(shù)在70% 以上的MDS-AML變患者仍高水平表達(dá)MMP-9 mRNA，提示MDS患者骨髓原始細(xì)胞中也存在過早合成MMP-9的現(xiàn)象，MMP-9可能與MDS的惡性轉(zhuǎn)化有一定聯(lián)系。 Omato等7首次報道小劑量美法侖可以有效治療高危老年MDS患者而且具有毒性作用小、骨髓抑制輕的優(yōu)勢。Robak等8用小劑量美法侖治療8例MDS和15例急性髓系白血病伴多系增生異?；颊撸?例獲CR，3例PR，中位總劑量為120 mg。國內(nèi)也有單用小劑量美法侖成功治療老年高危低增生MDS

20、的報道9。本次研究中，高危組且年齡75歲不適合AML樣化療者，其中MDS-RAEB 5例，MDS-RAEMB-t 6例，給予口服小劑量美法侖（2 mg/d,連服24個月）治療,2例達(dá)CR，3例達(dá)PR，所有患者均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。提示小劑量美法侖可能是一種有效的治療方法，尤其適用于一般狀況差的老年患者。但由于病例數(shù)量有限，尚不能得出肯定性結(jié)論，仍有待于收集大量病例進(jìn)行對照研究，并進(jìn)一步探討療效與骨髓增生程度、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)改變的關(guān)系?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1張之南, 沈悌. 血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn).第2版.北京：科學(xué)出版社，1999:171-173.2 Felsher DW,Bishop JM.

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