「畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選」

1、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選菌體的準(zhǔn)備：1. 挑取酵母單菌落，接種至含有5 ml YPD 培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30C、2 50 300r/min培養(yǎng)過(guò)夜；2. 取100-5 0 0 口（W 1:100）的培養(yǎng)物接種至含有 50ml新鮮培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶 中，2830C、250-30 0 r/m i n 培養(yǎng)過(guò)夜 （約 20h）,至 OD60O 達(dá)到 1.31.5;3. 將細(xì)胞培養(yǎng)物于4 C, 1500g離心5 mi n ,用50ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；4 . 按步驟3離心，用2 5ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸5 . 按步驟3離心，用2 -5ml,1M的冰預(yù)冷

2、山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；6 .按步驟3 離心，用1 60 d的冰預(yù)冷的1mo 1的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為240 ul;備注：可將其分裝為8 0。一份的包裝-70冷凍起來(lái)，2周之內(nèi)使用，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率。 比如常見(jiàn)的pPIC9K的載體轉(zhuǎn)GS 115 一般先用MD平板初篩，然后長(zhǎng)出的克隆子可以挑到不 同濃度的含 G4 1 8抗性的 YPD平板上篩選高拷貝。對(duì)正確篩選出的單菌落接YPD小瓶搖活后，轉(zhuǎn)大瓶B MGY搖瓶發(fā)酵。一般對(duì)于甲醇誘導(dǎo)菌株，搖瓶一天左右后開(kāi)始補(bǔ)加甲醇， 就類(lèi)似BMMY的功能了。? KM71比GS 11 5生長(zhǎng)的要慢。畢赤酵母都應(yīng)該是白色菌落的? 對(duì)于LOX家族

3、蛋白的表達(dá)，可嘗試在酵母培養(yǎng)基中加入C u 2+離子，提高表達(dá)量和蛋白活性?菌種保存：挑單克隆到Y(jié)PD中培養(yǎng)1 8 -2 4 h ,然后取菌液以1 :1加入30%M菌甘油，-8 0 °Cul/管凍存（一般用10ug以上質(zhì)粒用S alI酶切，然后直接加乙醇沉淀，7 0 %乙醇洗一遍，約20ul d dH2O重溶。轉(zhuǎn)化效率一般大于 100個(gè)克隆每ugDNA。建議你不要用膠回收 kit,回收的D NA可能還有鹽，導(dǎo)致電擊時(shí)放電時(shí)間很短。乙醇沉淀主要步驟如下：1）酶切體系（8 0 ul）中2倍體積的無(wú)水乙醇加 1/1 0體積的PH5.2 NaAC,混勻？2）-20C 20 分鐘沉淀？ 3 ）

4、1 3 2 0 0rpm, 2 0min,離心后棄上清4?） 7 5%乙酉I 3 0 0u 1輕輕洗，同上離心5 m in,棄上清5）3 7度烘箱至無(wú)乙醇?xì)馕叮ɑ蚴怯?搔壓的出風(fēng)口吹出的暖風(fēng)吹）。20）6?ul ddH2O重溶） 電擊轉(zhuǎn)化：8 . 將5 20 2的線(xiàn)性化DNA溶解在5-10科l TE溶液中，與80 d的上述步驟6 所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；9 .將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5mi n ;10 .根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊；1 1.電擊完畢后，馬上加入1ml 1M的冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻

5、，轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中；（置于30度搖床低速培養(yǎng)1h,再涂板）12 .將菌體懸液涂布于 M D平板上，每2 0 0 6 00 pl涂布一塊平板；13 .將平板置于30 c倒置培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)（3-4天）。推薦：電壓1.5kV ;電容2 5F電阻2 0 0 Qo電擊時(shí)間為 4 10msec=P i chia酵母表達(dá)直接PCR鑒定重組子的方法1.平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)（約12小時(shí)）；2,取1ml酵母懸液4000rmp離心，pbs重懸，煮沸5 mins,放到冰上5 mins，直接就可以 用做pc r的模板了3,將除了模板之外的其它PCR反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好，并分裝。3.用滅菌的牙簽挑取菌

6、落，在PCR管中涮一下，PCR擴(kuò)增，禾I用5AOX 1和3'AOX 1引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 PCR復(fù)篩，同時(shí)檢測(cè)基因插入（如果重組質(zhì)粒以 單交換的方式整合到P ich ia pas tor i s基因組，則會(huì)擴(kuò)增到兩條帶，一條為 2.2k b （KM7 1為3 .6k b）宿主茵AOXI基因，另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-facto r信號(hào)肽序列的片段。）Ea ch 50皿 aliq u ot of competen t Pichia c ells with3g由nearizedp1asmidD NA wi 1 ly ield 50 co 1 on i es on selecti

7、v e medium.M u t s 表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)As a g en er a l ru 1 e whe n i n ducing exp ression,neverallowculturest o be more than 10-30% of y o ur total f laskvolume.1,挑選一單菌落，置于裝有5 0ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的50 0 ml搖瓶中，于28 -30 C /2 5 0- 3 00 r pm 培養(yǎng)至 OD600 = 2 6 （-1 6 - 1 8 h）;2, 室溫下1 5 0 0300 0 g離心5 m i n，收集菌體，用1 /

8、5至U 1/1 0原培養(yǎng)體積的 MM, BMM 或 BMMY重懸菌體（約2.55ml ）;3, 將步驟2 所得的菌液置于100ml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于 2 8 -30 °C/ 2 5 0 - 300 rpm的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；4, 每24 h向培養(yǎng)基中添加1 00 %甲醇至終濃度為 0. 51.0 %;5,按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為1ml,置于1.5 ml EP 管中，最大轉(zhuǎn)速離心 23 min ，分別收集上清和菌體， 分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般?。?、2 4、48、72、96 和 1 2 0 h;6 . 對(duì)分泌表達(dá)，分離樣品的上清液；

9、對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測(cè)樣品用液氮或干冰速凍后，于80 ° C保存?zhèn)溆茫? , 可以用S DS-PAG E、Western-B lo t及活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與鑒定重組蛋白的表達(dá)。Mu t +表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)1. 挑選一單菌落，置于裝有25ml MG Y、BMG或BMGY培養(yǎng)基的2 50m l搖瓶中，于28-30 ° C/250-30 0 rpm培養(yǎng)至 OD6O0 = 2-6 （16-18 h）;2,室溫下15003 000 g離心5m i n,收集菌體，用M M、BMM或BMMY重懸菌體，使 O D600 =1. 0 左右（約 1 00200ml）;3.將

10、步驟2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30° C/250- 3 00 rpm的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；4,每2 4 h向培養(yǎng)基中添加1 00%甲醇至終濃度為0 .51.0%;5,按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品， 取樣量為Im l,置于1. 5ml EP管中，最大轉(zhuǎn)速離心23min, 分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般?。?、6、12、24、36、48、60、72、84 和 9 6h;6 .對(duì)分泌表達(dá)，分離樣品的上清液；對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測(cè)樣品用液氮 或干冰速凍后，于-80° C保存?zhèn)溆茫? . 可以用SD

11、S-PAGE、Wester n-Blot及活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與鑒定重組蛋白的表達(dá)。BMG Y和BM MY的換液方式有 2種：1. 一種是離心換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到滅菌大離心管中，4 0O0rpm室溫離心5 分鐘后，用B MMYfc下菌體，再轉(zhuǎn)移到搖瓶，整個(gè)過(guò)程均用滅菌移液管操作。2）另一種是靜止換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，將搖瓶在無(wú)菌室靜止 4小時(shí)后，直接在酒精燈 旁?xún)A倒培養(yǎng)液，再加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此種方法的缺點(diǎn)有少量生長(zhǎng)培養(yǎng)基殘留。是離心換液或者靜止換液，到底那個(gè)好，只有根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)考量。如果只是從防治污染的角度來(lái)說(shuō)，靜止換液也好一些，因?yàn)椴僮鳟吘股僖恍?，速度也快。用新開(kāi)啟的分析純甲

12、醇，一直放在無(wú)菌室里面，每次直接用滅菌T IP吸取加入搖瓶就可以了。也有人試過(guò)用膜過(guò)濾，結(jié)果膜都溶解了。菌體是在BMM件培養(yǎng)的，可以不用BMMY做對(duì)照，在6 0 0nm處測(cè)OD值，培養(yǎng)基和P B S 光吸收都很低，P B S更方便。麥芽浸提液培養(yǎng)酵母（不換液，補(bǔ)料），生長(zhǎng)階段結(jié)束后，密度可達(dá)到10-12,誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，密度可達(dá)到1 8左右。如果用1體積白M0,在生長(zhǎng)階段結(jié)束后，換液時(shí) ，加入1/10 1/2體積白MMYS行誘導(dǎo)培養(yǎng)（即濃縮培養(yǎng)），細(xì)胞密度也可達(dá)到20以上。通常，真正的高密度發(fā)酵只有在發(fā)酵罐里才能實(shí)現(xiàn)，OD 600可達(dá)到40- 6 0及以上。搖瓶很難達(dá)到那樣的密度，不過(guò)可以采取

13、濃縮培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)高密度。搖瓶不能像發(fā)酵罐那樣保證通氣量，但可以通過(guò)裝量來(lái)暫時(shí)替代這個(gè)指標(biāo)。,S Mu t +/Mu t 的篩選用Sac I,Sa 1 I or S t u I線(xiàn)性化插入HIS4位點(diǎn)的載體轉(zhuǎn)化 GS15 5后,多數(shù)轉(zhuǎn)化子應(yīng)為 Mut+,但也有 Hi s Mut '的轉(zhuǎn)化子存在(見(jiàn) Invitr ogen protocol p36), Not I o r Bgl 11線(xiàn)性化插入 AOX I位點(diǎn)的載體轉(zhuǎn)化 GS155后，用 MD/MM 平板可區(qū)分M ut+/Mu St 。Use the p 1 a t es c o nt a in i ng the H i s + t a

14、ans f orma n t s and scre e n f or the Mut+ and MutS ph e no type as d escrib e d below.2. U sing a st e ril e to othpick , pick one c o lony and s t reak o r patch one H i s+ tr a nsforman tin aregular patte r n on bot h an MM plate an danM D p late, m aking s ure topatcht h e MM p 1 ate firs t .3.

15、 U se a new to o thpick for eacht r a nsform ant and continueuntil1 00tr a n s form a nts have b ee n patch e d (23 p lates).4. T o different i a t eMut+ fro m MutS, make one patch forea chof the contr ols (GS11 5/His+ M u tSA 1 bumin andGS11 5 / H i s+ Mut+3 -gal) ont otheMD and M M pl a t es.5. Incu b ate t he p 1 ates at 30 for 2 days.6.