糖生物學論文 糖基轉(zhuǎn)移酶與糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑

1、 糖基轉(zhuǎn)移酶與糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑摘要：糖基轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)催化活化的糖連接到不同的受體分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的產(chǎn)物具有很多生物學功能。其是糖蛋白、糖脂中糖鏈生物合成的關(guān)鍵酶之一。與此同時，對糖基化抑制劑的研究也是必要的。兩者在治療一些因為糖基轉(zhuǎn)移酶非正常表達引起的疾病有很大作用。關(guān)鍵詞：糖基轉(zhuǎn)移酶；糖基化；糖基化抑制劑前言：糖基轉(zhuǎn)移酶是廣泛存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的一大類酶，參與體內(nèi)重要生物活性物質(zhì)如糖蛋白和糖脂中糖鏈的合成，其作用是把相應(yīng)的活性供體(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的單糖部分轉(zhuǎn)移至糖、蛋白質(zhì)、脂類和核酸等，完成后者的糖基化加工，實現(xiàn)其生物學功能。因此糖基轉(zhuǎn)移

2、酶的表達和活性的變化與許多疾病聯(lián)系在一起，并可作為某些疾病的診斷標志，如-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性在體內(nèi)的再現(xiàn)會引發(fā)自身免疫反應(yīng)，導致類風濕，并在器官異體移植中引起排斥反應(yīng)；N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶等在成熟細胞中活性的明顯升高被視為腫瘤發(fā)生的重要標志，并且被認為是腫瘤遷移惡化的重要原因。因此設(shè)計合成糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，對于尋找抗腫瘤、抗免疫系統(tǒng)等新藥研究有重要意義。1 糖基轉(zhuǎn)移酶的存在糖蛋白是通過蛋白質(zhì)的糖基化組裝實現(xiàn)的，而糖基化過程則通過多種糖基轉(zhuǎn)移酶完成在肽鏈合成的同時或合成后，在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，糖鏈被連接到肽鏈的特定糖基化位點上。糖基轉(zhuǎn)移酶具有高度的底物專一性，即同

3、時對糖基的供體和受體具有專一性。對糖基轉(zhuǎn)移酶進行研究，是糖基化研究的第1步。目前已對多種糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)以及編碼它們的基因研究清楚,并認為糖鏈的合成沒有特定的模板，而是通過糖基轉(zhuǎn)移酶將糖基由其供體轉(zhuǎn)移到受體上。糖鏈可以認為是基因的次級產(chǎn)物,一個基因編碼一個糖基轉(zhuǎn)移酶,一個糖基轉(zhuǎn)移酶專一地催化一個糖苷鍵的合成；這樣一條糖鏈的合成就需要一個多酶系統(tǒng),也就對應(yīng)了一個基因組。下文簡要介紹幾類重要的糖基轉(zhuǎn)移酶。1.1 N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosa-minyl-transferase,Gnt) 糖蛋白中糖鏈通過還原端的N-乙酰氨基葡萄糖以-1,4糖苷鍵與蛋白質(zhì)肽鏈上A

4、sn-XXX-Ser/Thr序列(XXX為除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn殘基上的氨基(-NH2)相連，被稱為N-糖鏈。真核細胞中N-糖鏈的合成途徑高度保守，其第1步合成由GnT完成。1999年, Strasser等依據(jù)動物GnT保守區(qū)序列設(shè)計簡并引物，從煙草文庫中分離到編碼GnT的基因GnTI，這也是植物中第1個被鑒定的GnT基因。隨后利用同樣的方法從擬南芥、馬鈴薯中分離和鑒定出一系列GnT基因, 這些基因與動物GnT基因均有較高的序列相似性。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)GnTI定位于植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，而減弱了GnTI活力的植株并不對其下游的其它糖基轉(zhuǎn)移酶活力構(gòu)成影響，說明植物體內(nèi)具

5、有GnTI的功能類似物。 不同的糖基轉(zhuǎn)移酶所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)1.2 多肽N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（polypeptide-N-acetylgalactos aminyltrase,ppGalNAc） O-連接糖鏈有多種形式，在動物中研究最深入的是O-乙酰氨基半乳糖(O-GalNAc)連接糖鏈，該糖鏈通過還原端的N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)以-1,4糖苷鍵與蛋白質(zhì)肽鏈上Ser或Thr的氧原子連接。ppGalNAc催化O-GalNAc連接糖鏈合成的第1步，將UDP-GalNAc上的GalNAc基團轉(zhuǎn)移至多肽鏈上特定序列中的Ser或Thr的羥基上，從而合成GalNAc-O-Ser/Thr糖蛋白

6、片段。但植物中與O-GalNAc連接糖鏈相關(guān)的研究十分罕見，僅有2篇報道：1999年Kishimoto等人報道水稻的谷蛋白中含有O-GalNAc連接糖鏈；最近Kilcoyne等(2009)發(fā)現(xiàn)在醇溶的水稻蛋白中也存在O-GalNAc連接的糖蛋白，但尚未鑒定出此蛋白質(zhì)。目前研究者尚未得到植物中的任何ppGalNAc基因，這也將是今后開展植物糖生物學研究的一個較好切入點。1.3 O-乙酰氨基葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase，OGT) 與前述2種糖基化多發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體不同，近年來在細胞核和細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)存在另一種O連接N-乙酰氨基葡萄糖糖基化(O-GlcNA

7、c)過程。O-GlcNAc糖基化修飾在細胞內(nèi)分布廣泛，指通過OGT將單個N-GlcNAc添加到蛋白質(zhì)的Ser或Thr殘基上。這種作用與蛋白磷酸化作用類似，O-GlcNAc修飾很可能通過改變蛋白的細微結(jié)構(gòu)或形成空間位阻從而抑制該肽鏈臨近位置的磷酸化，從而共同參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等生命活動。這種被稱作“陰陽調(diào)控”的關(guān)系在全細胞水平和特定蛋白的特定位點上都已得到驗證。2. 糖基化 糖基化是蛋白質(zhì)的一種重要的翻譯后修飾。根據(jù)糖鏈和肽鏈的連接方式的不同,蛋白質(zhì)的糖基化可分為N-糖基化和O-糖基化。 N-糖基化是通過糖鏈的還原端的N-乙酰氨基葡萄糖(Glc-NAc)和肽鏈中某些Asn側(cè)鏈酰氨基上的氮原子

8、相連。能接有糖鏈的Asn必須處于Asn-X-Ser/Thr3殘基構(gòu)成的基序(motif)中,其中X可為除Pro的任意的氨基酸殘基。O-糖基化的結(jié)構(gòu)比N-糖基化簡單,一般糖鏈較短,但是種類比N-糖基化多得多。肽鏈中可以糖基化的主要是Ser和Thr,此外還有酪氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸,連接的位點是這些殘基側(cè)鏈上的羥基氧原子。2.1 蛋白質(zhì)糖基化過程蛋白質(zhì)分子表面的糖鏈可對蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生深遠的影響，由此衍生了一種所謂的蛋白質(zhì)糖基化工程，其是通過對蛋白質(zhì)表面的糖鏈進行改造,從而改良蛋白質(zhì)性質(zhì)的一種技術(shù)。常用的對糖鏈進行改造的方法有：(1)通過定點突變技術(shù)增加或減少蛋白質(zhì)的糖基化位點,從而增加或減

9、少蛋白質(zhì)表面的糖鏈。(2)在體外通過化學或酶法對糖鏈進行修飾。(3)細胞內(nèi)由一系列糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶組裝成糖基化途徑(glycosy lation pathway)來催化蛋白質(zhì)的糖基化。通過基因工程手段改變宿主細胞內(nèi)糖基化途徑中糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的表達，即可改變在該系統(tǒng)中表達的糖蛋白的糖基化形式。目前已通過該方式對釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、昆蟲細胞、CHO細胞及轉(zhuǎn)基因植物等多個表達系統(tǒng)進行了糖基化工程的改造。(4)研究表明，糖基化還受到細胞培養(yǎng)條件的影響。可通過改變細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的糖分、激素及氨離子濃度等條件來改變蛋白質(zhì)的糖基化。3. 糖基化抑制劑目前糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的設(shè)計主要是基于其典

10、型的糖基化反應(yīng)過渡態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1)， 兩種過渡態(tài)模式，一種是構(gòu)型翻轉(zhuǎn)模式，一種是構(gòu)型保持模式來進行的, 該反應(yīng)過渡態(tài)包含四個部分(糖供體、受體、金屬離子Mn2、核苷)共同作用的復雜體系。 此外，由于糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性和多樣性，以及酶的立體結(jié)構(gòu)和催化機制仍不十分明確， 大大增加了酶抑制劑設(shè)計合成的難度。盡管如此，近年來糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究取得了顯著進展，有些抑制劑的活性達到nmol/L級。下文就現(xiàn)有的幾類抑制劑，每類選取一種抑制劑進行敘述。  3.1 亞氨基糖衍生物  亞氨基糖(Iminosugar)是一類糖環(huán)上氧原

11、子被氮取代的糖類衍生物，又稱為氮雜糖(Azasugar)，由于該類化合物與單糖結(jié)構(gòu)相似，且在體內(nèi)更易質(zhì)子化形成陽離子中間體，與酶活性中心的酸負離子結(jié)合，組成穩(wěn)定的過渡態(tài)，從而表現(xiàn)出強的糖苷酶抑制活性。 而糖基轉(zhuǎn)移酶與糖苷酶有類似的反應(yīng)過渡態(tài)(作用機制)，因此亞氨基糖作為糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究較多，已有多篇綜述報道，圖2列出了部分活性較高的亞氨基糖?；衔?是一類結(jié)構(gòu)簡單但活性很高的選擇性-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，而化合物24具有很好的選擇性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制活性。化合物4在2 µmol/L的GDP(鳥嘌呤核苷-5'-二磷酸二鈉)的參與下，表現(xiàn)出更強的協(xié)同抑制

12、效果。真核細胞內(nèi)部通常含有µmol級的GDP， 在使用亞氨基糖作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的體內(nèi)測試時，也能觀察到協(xié)同抑制作用。這表明GDP與亞氨基糖可能在酶活性中心形成了復合體共同參與酶反應(yīng)過程25。2005年, Behr等在尋找抗真菌藥物的研究中發(fā)現(xiàn)多羥基吡咯化合物5 (6-deoxy-homo DMDP)對啤酒酵母的幾丁質(zhì)合成酶(該酶催化N-乙?；?D-氨基葡萄糖聚合形成幾丁質(zhì)，其抑制劑可用于抗真菌藥物的開發(fā))有很強的抑制作用， 進而考察了其異構(gòu)體6的活性，并在該類化合物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成了兩類化合物，以探討其幾丁質(zhì)合成酶抑制活性和構(gòu)

13、效關(guān)系。結(jié)果顯示，兩類化合物的抑制活性(表1)較化合物5的要低，其原因可能是由于化合物結(jié)構(gòu)或構(gòu)型的改變，使其不能更好的被酶識別。3.2  碳糖苷衍生物 碳苷(C-glycosides)是糖環(huán)異頭碳直接與碳原子相連接的糖苷衍生物，由于其對酸和酶催化水解的卓越穩(wěn)定性，自20世紀70年代初，引起糖化學家和生物有機化學家的濃厚興趣，廣泛用作糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和糖類藥物設(shè)計合成的先導化合物。3.2.1 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化UDP(尿嘧啶核苷-5'-二磷酸鈉)-半乳糖上的半乳糖基連接到N-乙酰氨基葡萄糖3位或4位羥基上。由于半乳糖基

14、轉(zhuǎn)移酶催化許多重要的細胞表面的低聚糖如血型抗原和腫瘤、免疫過程涉及到的E-selectin凝集素Sialy Lewis X等的生物合成而受到廣泛關(guān)注，其抑制劑可用于治療器官移植排異等免疫系統(tǒng)疾病。Vidal等29根據(jù)酶催化反應(yīng)過渡態(tài)特點，設(shè)計合成了碳苷化合物17，化合物對-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶很好的抑制活性(IC5040 µmol/L)，與酶天然底物UDP-半乳糖(Km51 µmol/L) (Km為米氏常數(shù))相當。化合物18沒有抑制活性說明核苷部分對保證抑制劑活性是必須的。分別以巖藻糖基和2-N-乙酰氨基葡萄糖基代替17中

15、的半乳糖基得到的化合物19和20， 對巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fut3)和N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(LgtA)的抑制活性卻并不高， 分別為IC502 mmol/L和IC503.5 mmol/L(相應(yīng)天然底物的Km值分別為43和540 µmol/L)。3. 3氧糖苷衍生物3.3.1  巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 研究表明2位N-乙酰氨基乳糖是大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶的受體底物，而其2'和6位羥基在許多酶識別過程中并不必要，但有可能與酶活性結(jié)合部位以外的其它部位作用， 所以在這兩個位置進行結(jié)構(gòu)修飾有可能獲得活性

16、更高的化合物，以作為低聚糖生物合成及代謝過程中的選擇性抑制劑. Galan等合成了乙酰氨基乳糖類似物5062，作為受體底物探討2'和6位不同取代基對不同的糖基轉(zhuǎn)移酶(人重組-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶VI和鼠肝重組-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶)的活性影響。結(jié)果表明，電子效應(yīng)可能比立體效應(yīng)更能影響酶活性，而6位游離的氨基以及2'和6位的甲基取代會導致酶活性降低?；衔?348是N-乙酰氨基乳糖的2'差向異構(gòu)體，作為底物它不能被-2,3-, -2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶III，IV，V和VI識別，但可以選擇性的抑制-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的

17、活性(Ki0.475 mmol/L)。這是第一個對不同的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶有選擇性抑制效果的低聚糖化合物，這表明，酶活性中心結(jié)構(gòu)上的區(qū)別可能是決定抑制劑選擇性的重要原因。Von Ahsen等通過改進的小型高通量篩選的方法(miniaturized high-throughput screening assay)，對798131個化合物進行了活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)高效的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶VII (FucTVII)的抑制劑。結(jié)果表明，與該酶特異性受體底物結(jié)構(gòu)極為類似的三糖化合物表現(xiàn)出良好的抑制活性, 其中化合物64 的抑制活性最高

18、，IC5010 µmol/L。3.4  非糖基供體過渡態(tài)類似物 3.4.1  巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 一些新的合成手段，如點擊化學(click chemistry)也應(yīng)用在糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的合成上，其中最成功的例子當屬Wong等利用該方法合成的化合物98，它對-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶有很好的選擇性抑制活性，個別達到nmol/L級，而相對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，濃度在600µmol/L時沒有活性。酶活性中心部位以外的額外結(jié)合力，如疏水作用力，可能是提高抑制劑活性的重要原因。最近，Sun等60獲得了來源于微生

19、物Helicobacter pylori的-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FucT)的晶體結(jié)構(gòu)，推測酶反應(yīng)過程中,GDP與酶的結(jié)合力高于巖藻糖與酶的結(jié)合，因此保留GDP部分，以其氨基衍生物與80個結(jié)構(gòu)各異的羧酸以酰胺鍵連接，合成了過渡態(tài)類似物99(Eq.1)，化合物未經(jīng)純化，直接測試了對H.pylori FucT的抑制活性。結(jié)果表明，所有化合物具有較高的抑制活性。Ki在10100µmolL1之間。他們還測試了化合物98對該酶的抑制活性，Ki0.59µmolL1。3.5  其它 以連有熒光基團的供體為探針，運用高通量篩選技術(shù)可以獲得多個不同結(jié)構(gòu)特點的糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。Hu等針對核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(MurG，負 責將UDP-GlcNAc的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移至類脂以合成胞壁質(zhì)，以熒光探針化合物F1為供體，對組合化學合成的近64000個化合物進行了高通量篩選。結(jié)果表明，含4種核心雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物對MurG都有較高的抑制活性。Gross等運用類似的探針F1及其衍生物，對O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT,