人工血管表現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞種植研究的進(jìn)展

1、人工血管表現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞種植研究的進(jìn)展關(guān)鍵詞：人工血管內(nèi)皮細(xì)胞血液相溶性 摘要材料植入機(jī)體誘導(dǎo)的血栓形成是人工血管臨床應(yīng)用最為主要的限制因素之一，在材料表現(xiàn)種植內(nèi)皮細(xì)胞可能是目前解決這一問題最有效的方法，本文試就血管內(nèi)皮細(xì)胞的促凝及抗凝功能、內(nèi)皮細(xì)胞在材料表現(xiàn)生長分化的影響因素和人工血管內(nèi)皮細(xì)胞種植的實(shí)驗(yàn)室研究與臨床等方面的最新進(jìn)展及其應(yīng)用前景作為簡(jiǎn)要介紹。 關(guān)鍵詞人工血管內(nèi)皮細(xì)胞血液相溶性 1引言 血栓形成是人工血管尤其是微小血管臨床應(yīng)用的最為主要的限制因素之一，為了改善血管材料的血液相容性，人們?cè)群筮M(jìn)行了多方面的嘗試，如新材料的合成、材料表現(xiàn)的生物改性等，遺憾的是目前的結(jié)果仍不能令人十分滿意

2、。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅僅是在血管表現(xiàn)的一層物理屏障，更為重要的是其在血管伸縮的調(diào)節(jié)，凝血一纖溶系統(tǒng)平衡的維系以及免疫系統(tǒng)的調(diào)控等方面起著不可缺少的功能和作用，同時(shí)它還參與機(jī)體的生物代謝、能量運(yùn)輸和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。現(xiàn)在人們已起來越明確地認(rèn)識(shí)到內(nèi)皮細(xì)胞襯層在改善血管材料血液相容性中的重要性1，在這方面的研究也日益引起人們的廣泛關(guān)注并已取得了可喜的進(jìn)展，本文試就近幾年的有關(guān)進(jìn)展加以綜述。 2 / 182血管內(nèi)細(xì)胞在凝血一纖溶系統(tǒng)中的功能和作用 血管內(nèi)皮細(xì)胞直接與血液接觸，既有促凝血功能，又有抗凝血功能，對(duì)調(diào)節(jié)凝血因子和抗凝血因子之間的動(dòng)態(tài)平衡和維持血液的正常流動(dòng)起著十分重要的作用，各種原因引起的這種平

3、衡的失調(diào)，都將導(dǎo)致血栓形成（凝血因子活性增強(qiáng)）或出血（抗凝血因子活性增強(qiáng)）。 2.1血管內(nèi)皮細(xì)胞的促凝血功能 血管內(nèi)皮細(xì)胞能合成和釋放多種促進(jìn)血小板聚集和血栓形成的因子以及部分凝血因子，主要有膠原蛋白、纖粘蛋白、組織因子、凝血因子、凝血因子、vWF因子及高分子量激肽原（highmolecularweightkininogen,HMWK）、纖溶酶原激活物抑制物（plasminogenactivatorinhibitor,PAI）、血小板激活因子（plateletactivitingfactor,PAF）和血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin，TSP）等。這些因子協(xié)同其他凝血因子參與凝血過

4、程的起始（如TF和HMWK）、凝血酶原激活物的形成（如因子和因子）、血小板的粘附、聚集和血栓形成（如膠原蛋白、纖粘蛋白和PAI等）等過程。 2.2血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝血功能 血管內(nèi)皮細(xì)胞除了合成、分泌上述各種促凝血因子以外，還具有抗凝血的功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝血功能主要通過合成下列三類主要的抗凝血因子得以實(shí)現(xiàn)。第一類物質(zhì)主要是包被在內(nèi)皮細(xì)胞表面，這里面主要有蛋白聚糖（proteoglycan）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin），內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)的蛋白聚糖能通過與抗凝血酶結(jié)合從而促進(jìn)其滅活凝血酶及其他凝血因子的活性；而血栓調(diào)節(jié)蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞表面的凝血酶結(jié)合后，可以激活蛋白C，活化的蛋白C

5、可滅活a因子和a因子，并可抑制血小板受體進(jìn)而抑制血小板聚集和纖維蛋白凝結(jié)。第二類物質(zhì)是由內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放到血液中去的因子，這些因子可以影響凝血因子、血小板和血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)凝血過程，在這一類因子中有前列環(huán)素（prostacyclin）、纖溶酶原激活物（plasminogenactivator,PA）、內(nèi)皮依賴性舒張因子（endothelium-dervedrelaxingfactor,EDRF）和組織因子途徑抑制因子（tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI）等，當(dāng)纖維蛋白形成并沉積于內(nèi)皮細(xì)胞表面時(shí)可誘發(fā)PA的釋放，PA的功能是活化纖溶酶原使其轉(zhuǎn)化為纖溶酶，

6、清除纖維蛋白；前列環(huán)素和EDRF協(xié)同作用除可張血管外，還可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞合成血小板粘附蛋白進(jìn)而抑制血小板的粘附與聚集；TFPE分子含有三個(gè)Kunitz功能區(qū)，分別可以和組織因子-因子復(fù)合物、Xa因子及肝素結(jié)合，從而抑制外源性凝血途徑的初始過程2。第三類物質(zhì)是一些在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)起作用的因子如13-羥基-9，11-十二烷基二烯酸（13-hydroxy-9,11-octadecodienoicacid）3。除了上述三類因子以外，其它一些非內(nèi)皮細(xì)胞來源的抗凝血因子（如抗凝血酶等）也可特異地吸附在內(nèi)皮細(xì)胞表面并連同一些內(nèi)皮細(xì)胞來源的其他物質(zhì)組成一些抗凝表面。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞還可攝取和滅活一些對(duì)小板聚集有促

7、進(jìn)作用的活性物質(zhì)如5-羥色胺、組織胺、兒茶酚胺、緩激肽、血管緊張素和血小板激活因子等，間接起到了抗凝血的作用。 3血管內(nèi)皮細(xì)胞種植的研究 現(xiàn)在我們已經(jīng)知道內(nèi)皮細(xì)胞在凝血及纖維系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用和功能，因此從理論上講，在人工合成血管材料表現(xiàn)鋪被一層內(nèi)皮細(xì)胞將會(huì)明顯改善其血液相容性。最早在這方面開展研究的Herring，在1978年首先報(bào)導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞種植于Dacron人工血管后植入狗的動(dòng)脈系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后四周種植內(nèi)皮細(xì)胞的人工血管表現(xiàn)無血栓面積大約為70%，而單純的人工血管表面無血栓面積則僅為22%4。隨后Stanley和Sharefkin等分別報(bào)導(dǎo)了各自研究的結(jié)果，證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞種

8、植能夠明顯改善Dacron人工血管植入動(dòng)物內(nèi)后的通暢率和減少血小板聚集5，6。Douville及Hirko各自的研究結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞種植對(duì)聚四氟乙烯（PTFE）人工血管植入動(dòng)物體內(nèi)后的通暢率也有明顯的改善作用7，8。Meinhart等長達(dá)8年的臨床研究中將病人分成兩組，一組移植內(nèi)皮細(xì)胞化的ePTFE血管（A組），而另一組則移植普通ePTFE血管（B組），結(jié)果顯示手術(shù)3年、5年及7年后A組病人的血管暢通率分別為84.7%、73.8%和73.5%，而B組病人的血管暢通率則分別為55.4%、20.8%和0%。他們的研究提示，內(nèi)皮細(xì)胞化的血管材料的移植效果與自體動(dòng)脈移植的臨床效果無明顯區(qū)別9。相關(guān)的

9、研究提示，傳統(tǒng)的聚氨酯材料不太支持內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與生長，因此用其進(jìn)行的內(nèi)皮細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn)效果不明顯。 通常采用的將內(nèi)皮細(xì)胞種植到人工血管表面的方法分為兩種：第一種稱為接種法（seeding），即將內(nèi)皮細(xì)胞與全血管或血漿混合后注入人工血管腔，使內(nèi)皮細(xì)胞沉積于人工血管內(nèi)腔表面；另一種方法稱為鋪坪方法（sodding），即將自體內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后與人工血管培養(yǎng)，使內(nèi)皮細(xì)胞直接鋪展在人工血管內(nèi)腔表面。前一種方法的優(yōu)點(diǎn)在于所需時(shí)間短，缺點(diǎn)是內(nèi)皮細(xì)胞與血管材料表面的結(jié)合不牢固，缺點(diǎn)是細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間過長，污染機(jī)會(huì)多。Williams等采用的加壓鋪坪法（pressuresodding）值得我們借鑒。他們

10、的方法是將微孔狀的聚四氟乙烯人工血管的一端堵住，另外一端通過T形管分別與壓力計(jì)和注射器相連。在管腔壓力維持在5psi的狀況下將細(xì)胞懸浮液通過注射器注入人工血管內(nèi)，并用注射器緩慢推進(jìn)4倍于人工血管容積的鋪坪液，以確保細(xì)胞能完全進(jìn)入血管材料的網(wǎng)孔內(nèi)。他們將通過這種方法處理的4mm內(nèi)徑的聚四氟乙烯血管植入狗的頸動(dòng)脈并于術(shù)后12周檢查血管通暢情況，結(jié)果顯示，有86%的移植血管保持通暢，而未經(jīng)細(xì)胞處理的移植血管則已全部閉塞10。 為了改善內(nèi)皮細(xì)胞在人工血管表面的粘附和生長，人們先后嘗試了在血管材料表面加附各種細(xì)胞粘附因子如膠原（collagen）、纖粘蛋白（fibronectin）、層粘聯(lián)蛋白（lami

11、nin）、玻聯(lián)蛋白（vironectin）及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）等并取得比較滿意的效果。后來，Pierschbacher和Rouslahti發(fā)現(xiàn)RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）三肽是許多細(xì)胞膜和ECM中的粘附蛋白（如玻聯(lián)蛋白、纖粘蛋白、vonwillebrand因子、纖維蛋白原及膠原等）所共有的細(xì)胞間識(shí)別的最小序列，而這一序列在介導(dǎo)細(xì)胞粘附和鋪展方面起著非常重要的作用11，12?，F(xiàn)已證明細(xì)胞表面的某些受體如整聯(lián)蛋白（integrin）通過識(shí)別粘附因子的RGD序列介導(dǎo)細(xì)胞間的聚集及細(xì)胞在ECM上的粘附和鋪展。隨著對(duì)含RGD多肽與整聯(lián)蛋白相互作用機(jī)制的深入

12、了解，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，將含RGD三肽序列的合成多肽共價(jià)連接到合成材料表面應(yīng)可促進(jìn)細(xì)胞的粘附與生長。含RGD序列的合成多肽固定在生物材料表面能明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與鋪展，這已在多種生物材料的有關(guān)研究中得到證實(shí)13，14。同時(shí)在材料表面交聯(lián)某些生長因子如堿纖維細(xì)胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）及內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（endothelialcellgrowthfactor,ECGF），也能明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞在材料表面的生長狀況。在這方面工作中所面臨的最主要的挑戰(zhàn)是尋求一種有效的交聯(lián)方法，即在最大限度地保持RGD多肽或各種細(xì)胞生長因子的細(xì)胞結(jié)合活性的前提下，交

13、聯(lián)盡可能多的分子到材料表面。 除了在材料表面加附各種有利于細(xì)胞粘附、鋪展及生長的各種細(xì)胞活性因子外，人們還發(fā)現(xiàn)，賦予材料表面一種必要的三維結(jié)構(gòu)也是促進(jìn)細(xì)胞粘附及生長，尤其是保持細(xì)胞功能分化的不可缺的因素之一。人們?cè)缫寻l(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞在不同鋪展形態(tài)時(shí)其功能分化程度是不同的。有的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)的相互作用所產(chǎn)生的基質(zhì)機(jī)械力可以明顯影響細(xì)胞的表型分化（phenotypicdifferentiation），如細(xì)胞的生長、細(xì)胞的形態(tài)、胞內(nèi)的pH、及膠原與纖粘蛋白的合成等15-17。某些研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞化材料表面仍經(jīng)常有血栓形成，推測(cè)其原因可能與內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝血功能方面的分化缺陷有關(guān)。Goodma

14、n等通過兩步法制備了一種模擬正常血管基底組織三維構(gòu)象的聚氨酯人工血管材料，他們研究提示，血管內(nèi)皮細(xì)胞在這種三維材料上的鋪展及生長比平面形態(tài)表面明顯得到改善，并且內(nèi)皮細(xì)胞的形成更接近生理狀態(tài)時(shí)的形成18。Tunstall等的研究比較了血管內(nèi)皮細(xì)胞在具有不同表面結(jié)構(gòu)的Dacron材料表面上生長時(shí)組織因子和前列環(huán)素的表達(dá)情況，他們的研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞在紡織人工血管表面生長時(shí)，其組織因子的表達(dá)水平明顯低于生長于光滑表面Dacron膜的內(nèi)皮細(xì)胞，而前列環(huán)素的表達(dá)水平在兩組之間則無顯著區(qū)別19。Genni等研究了內(nèi)皮細(xì)胞在編織Dacron材料表面生長時(shí)各種粘附分子的表達(dá)情況，他們的結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞在接觸

15、材料24小時(shí)后，其表面表達(dá)血小板和內(nèi)此細(xì)胞粘附分子（platelet/endotheliumcelladhesionmolecule,PECAM-1）的細(xì)胞數(shù)明顯減少，而表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞粘附分子（endothelium-leukocyteadhesionmolecule,ELAM-1）的細(xì)胞數(shù)明顯增多，材料對(duì)細(xì)胞表達(dá)血管細(xì)胞粘附分子（vascularcelladhesionmolecule,VCAM-S）和細(xì)胞間粘附分子（intercellularadhesionmolecule,ICAM-1）幾乎不產(chǎn)生影響。他們認(rèn)為這種情況的出現(xiàn)有利于白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，而不利于內(nèi)皮細(xì)胞與材料間及

16、內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附，因而阻礙了材料表面的內(nèi)皮細(xì)胞化20。Fields等制備了一種稱為肽-雙親體（peptideamphile）的結(jié)構(gòu)分子，其一端為親脂性基團(tuán)，可以和材料的疏水性表面結(jié)合，而另一端為親水基團(tuán)，可以和蛋白及多糖等親水性分子結(jié)合，他們?cè)谄溆H水端引入一個(gè)三螺旋結(jié)構(gòu)（triplehelicalmotif），其在生理溫度下相當(dāng)穩(wěn)定。用這種分子處理的材料可以明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、生長和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞21。 4結(jié)束語 通過對(duì)上述研究工作的了解，可以看出，血管材料表面內(nèi)皮細(xì)胞化能夠明顯改善移植后的血管通暢率，因而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但要使血管內(nèi)皮細(xì)胞化人工血管真正進(jìn)入臨床廣泛使用，還有幾

17、個(gè)問題迫切需要解決；一是如何縮短內(nèi)皮細(xì)胞的種植時(shí)間從而減少污染的機(jī)會(huì)；二是要徹底了解影響內(nèi)皮細(xì)胞在材料表面粘附、鋪展、生長及功能分化等方面的各種因素，為日后材料的制備提供理論基礎(chǔ)。更為理想的是研制這樣一種血管材料，當(dāng)其植入體內(nèi)后能誘導(dǎo)鄰近血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞向其表面遷移并進(jìn)行鋪展，從而形成一種完整的具有正常生理功能的內(nèi)皮細(xì)胞層，這樣將會(huì)使其臨床應(yīng)用更為簡(jiǎn)易。此外在體外培養(yǎng)條件下進(jìn)行血管誘導(dǎo)再生的研究也應(yīng)引起我們足夠的重視。 參考文獻(xiàn) 1VonAppenK,IvanovichP,MujaisSetal.EndothSetal.Endothelium:Thenextfrontierinbioc

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