細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)

1、2021/8/142021/8/141 1醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室中心實(shí)驗(yàn)室谷景義谷景義2021/8/142021/8/142 2主要內(nèi)容：1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)2、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件3、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)2021/8/142021/8/143 3 把取得的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。2021/8/142021/8/144 4 貼附型、懸浮型2021/8/142021/8/145 5 體外培養(yǎng)的細(xì)胞既保持了一定的體內(nèi)細(xì)胞的基本特性，但也具有本身的一些特點(diǎn)。 貼附-伸展 接觸抑制-增殖的密度抑制2021/

2、8/142021/8/146 62021/8/142021/8/147 7接觸抑制 當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞導(dǎo)致無(wú)處可去而保持接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)，在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜活動(dòng)將停止。 因此，一般正常細(xì)胞并不相互重疊于其上生長(zhǎng)。2021/8/142021/8/148 8細(xì)胞增殖密度抑制 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合形成單層時(shí)，細(xì)胞變得比較擁擠，這時(shí)其分裂停止，這種細(xì)胞可在靜止?fàn)顟B(tài)下維持存活一段時(shí)間，但不會(huì)繼續(xù)分裂生殖。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，他們的接觸抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至較高的終末細(xì)胞密度。2021/8/142021/8/149 9 單個(gè)細(xì)胞增殖：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞增殖：2021/8/

3、1410 高等生物體，細(xì)胞周期時(shí)間的長(zhǎng)短變化主高等生物體，細(xì)胞周期時(shí)間的長(zhǎng)短變化主要集中在要集中在G1期，期，S，G2和和M期基本保持穩(wěn)期基本保持穩(wěn)定。定。 Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h2021/8/142021/8/141111一群細(xì)胞的增殖：一群細(xì)胞的增殖：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 接種后，每天進(jìn)行檢測(cè)計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為接種后，每天進(jìn)行檢測(cè)計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制成曲線。縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制成曲線。 測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本活力的重要指標(biāo)

4、，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。參數(shù)之一。 飽和密度：在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群體停止繁殖。群體停止繁殖。2021/8/142021/8/141212 潛伏期/滯留期 指數(shù)增長(zhǎng)期 平臺(tái)期/停滯期 退化或死亡2021/8/142021/8/141313從原代細(xì)胞或細(xì)胞從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得具有系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞。的細(xì)胞。2021/8/142021/8/141414 有限細(xì)胞系：如果不能如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限，繼續(xù)傳代或傳代有限，可稱為有限細(xì)胞

5、系?？煞Q為有限細(xì)胞系。 連續(xù)細(xì)胞系：能夠連續(xù)能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做傳代的細(xì)胞叫做“連續(xù)連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系。細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系。可培養(yǎng)可培養(yǎng)5050代以上并無(wú)限代以上并無(wú)限培養(yǎng)下去。培養(yǎng)下去。 大多數(shù)的二倍體細(xì)胞為大多數(shù)的二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞有限細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系大多已發(fā)生變異。系大多已發(fā)生變異。2021/8/142021/8/141515從機(jī)體取得組織材料，在體外從機(jī)體取得組織材料，在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)，到第一次傳代前。培養(yǎng)生長(zhǎng)，到第一次傳代前。 傳代細(xì)胞：當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)繁殖一段當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)繁殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后傳代的細(xì)胞。時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后傳代的細(xì)胞。

6、2021/8/142021/8/141616方法：方法： 將培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再放將培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響。的影響。2、可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色等操作，、可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色等操作，以及永久保存。以及永久保存。3、增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。、增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。2021/8/142021/8/141717方法：將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)方法：將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)培養(yǎng)量較小也

7、稱為內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)培養(yǎng)量較小也稱為微量培養(yǎng)。微量培養(yǎng)。2021/8/142021/8/141818也稱植塊懸滴培養(yǎng)法，是最早也稱植塊懸滴培養(yǎng)法，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)建立的體外培養(yǎng)技術(shù)基本要點(diǎn)：基本要點(diǎn)：將組織或器官植塊接種在一張蓋將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營(yíng)養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再放置于一凹植塊及營(yíng)養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再放置于一凹形載片之上，最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中形載片之上，最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)。2021/8/142021/8/141919 1907 1907 年年 -Harrison

8、-Harrison用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個(gè)難題用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個(gè)難題 蓋玻片覆蓋凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法蓋玻片覆蓋凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法2021/8/142021/8/142020懸滴培養(yǎng)法基本步驟懸滴培養(yǎng)法基本步驟1、在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿和、在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿和植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。2、在凹載片周圍涂凡士林。將凹載片向、在凹載片周圍涂凡士林。將凹載片向下壓向蓋玻片下壓向蓋玻片3、將凹載片反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂溶蠟。、將凹載片反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂溶蠟。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2021/8/142021/8/142121 1910 191

9、0 至至 19231923年年 Carrel Carrel 和早期的組織和早期的組織培養(yǎng)培養(yǎng) 卡氏瓶培養(yǎng)法2021/8/142021/8/142222 19431943年年EarleEarle、DulbeccoDulbecco等創(chuàng)建單層細(xì)胞培等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法，首建長(zhǎng)期傳代的養(yǎng)法，首建長(zhǎng)期傳代的L-L-細(xì)胞系。細(xì)胞系。 19511951年年GeyGey首建人腫瘤細(xì)胞首建人腫瘤細(xì)胞HelaHela細(xì)胞系。細(xì)胞系。 從從5050年代末開(kāi)始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入年代末開(kāi)始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和了一個(gè)繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域。醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域

10、。2021/8/142021/8/142323無(wú)血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加個(gè)別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。組分兩大部分。觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)

11、物。往往針對(duì)性很強(qiáng)，價(jià)格偏高。2021/8/142021/8/142424三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng), , 使細(xì)胞能使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng)長(zhǎng), , 構(gòu)成三維的細(xì)胞構(gòu)成三維的細(xì)胞- -載體復(fù)合物。載體復(fù)合物。2021/8/142021/8/142525 普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在

12、了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)進(jìn)行, , 但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化相互影響而變得復(fù)雜化, , 難以研究單一過(guò)程，且難以研究中難以研究單一過(guò)程，且難以研究中間過(guò)程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)間過(guò)程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢(shì)。 應(yīng)用：應(yīng)用： 軟骨和骨組織軟骨和骨組織（軟骨細(xì)胞和

13、干細(xì)胞，再生損傷的軟骨、骨） 循環(huán)系統(tǒng)和心臟循環(huán)系統(tǒng)和心臟（有目的地改變血管形成）2021/8/142021/8/142626 目前常用的三維培養(yǎng)模型：目前常用的三維培養(yǎng)模型： 基質(zhì)覆蓋培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng) 微載體培養(yǎng) 預(yù)置支架培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 自發(fā)性細(xì)胞聚集2021/8/142021/8/142727優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1）研究的條件可以人為控制）研究的條件可以人為控制2）研究的樣本均一）研究的樣本均一3）研究?jī)?nèi)容方便觀察、檢測(cè)、記錄）研究?jī)?nèi)容方便觀察、檢測(cè)、記錄4）研究的費(fèi)用相對(duì)于經(jīng)濟(jì)）研究的費(fèi)用相對(duì)于經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：體外培養(yǎng)的細(xì)胞不能完全等同于體缺點(diǎn)：體外培養(yǎng)的細(xì)胞不能完全等同于體內(nèi)的細(xì)胞。內(nèi)的細(xì)

14、胞。2021/8/142021/8/142828 病毒學(xué)：病毒鑒定，病毒抗原作用，疫苗生產(chǎn) 免疫學(xué)：雜交瘤-單克隆抗體 遺傳學(xué)：染色體分析 腫瘤學(xué)：篩選重要的抗腫瘤藥物 分化及發(fā)育：刺激使細(xì)胞群體發(fā)生改變 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)：藥效測(cè)試 臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù)：干細(xì)胞培養(yǎng)定向誘導(dǎo)分化后移植；組織工程軟骨損傷修復(fù)；試管嬰兒2021/8/142021/8/142929營(yíng)養(yǎng)需要營(yíng)養(yǎng)需要環(huán)環(huán) 境境 要要 求求無(wú)毒及無(wú)污染無(wú)毒及無(wú)污染2021/8/142021/8/143030 （1 1）氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子）氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子 （2 2）促生長(zhǎng)因子等）促生長(zhǎng)因子等 完全培養(yǎng)基的組成

15、：完全培養(yǎng)基的組成： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8080一一9595 血清血清 5 5一一2020 碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 2.0 g/Lg/L 青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單單位毫升位毫升2021/8/142021/8/143131基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇參考：參考： (1(1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞株時(shí)咨詢?；？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞株時(shí)咨詢。 (2) (2) 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種

16、細(xì)胞。種細(xì)胞。 (3) (3) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-F12 DMEM-F12 等等2021/8/142021/8/143232血清 熱滅活

17、：熱滅活：56, 30 56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清分鐘加熱已完全解凍的血清( (目前少用）目前少用） 熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。 熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清質(zhì)量。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度，且細(xì)胞貼壁質(zhì)量。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度，且細(xì)胞貼壁率降低。率降低。 血清中的沉淀物血清中的沉淀物 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些

18、絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm, 5 3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理分鐘去除，也可不用處理 顯微鏡下顯微鏡下“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”，常，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批長(zhǎng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號(hào)的血清號(hào)的血清202

19、1/8/142021/8/143333 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 常用血清：常用血清： 胎牛血清、小牛血清胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，、兔血清、馬血清等，以胎牛血清質(zhì)量最好。以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)： 透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。病毒污染。2021/8/142021/8/143434 一種一種弱酸弱酸，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性 主要作用主要作用: :防止培養(yǎng)基防止培養(yǎng)基pHpH迅速變動(dòng)。迅速變動(dòng)。 在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下，

20、觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO25%CO2的的環(huán)境，環(huán)境，CO2CO2氣體迅速逸出，氣體迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此，此時(shí)可以維持時(shí)可以維持pH7.0pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPESHEPESmmol/Lmmol/L使用時(shí)可向使用時(shí)可向100ml100ml培養(yǎng)液中加入培養(yǎng)液中加入2ml 2ml 濃縮液，終濃度為濃縮液，終濃度為20mmol/L 20mmol/L 2021/8/142021/8/143535 抗菌素的使用：抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，

21、培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。 最終使用濃度為每毫升最終使用濃度為每毫升100100單位。單位。 2021/8/142021/8/143636 RPMI 1640 RPMI 1640 干粉培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基10.4g10.4g（1 1包）包） 超純水超純水 400ml 400ml 磁力攪拌至完全溶解磁力攪拌至完全溶解 加超純水定容至加超純水定容至1000ml 1000ml 在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下，用滅菌后的并置有在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下，用滅菌后的并置

22、有 0.22m 0.22m 孔徑濾膜的過(guò)濾器除菌，孔徑濾膜的過(guò)濾器除菌，分裝分裝200ml/200ml/瓶，瓶，-20-20保存?zhèn)溆谩１４鎮(zhèn)溆谩?用前取一瓶溶解，每用前取一瓶溶解，每200ml200ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為加滅活的小牛血清至終濃度為10%10%，即加，即加22ml22ml。加青霉素和鏈霉素至終濃度各為加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml100U/ml。2021/8/142021/8/143737 分離組織和分散細(xì)胞 常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA) 單獨(dú)或混合使用2021/8/142021/8/143838： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相

23、連胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶液消化時(shí)間：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-102-10分鐘。分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 2021/8/142021/8/1439392021/8/142021/8/1440402021/8/142021/8/1441412021/8/142021/8/1442

24、422 2、 環(huán)境要求環(huán)境要求 細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性 （1 1）溫度）溫度 （2 2）氣相）氣相 （3 3） PH PH2021/8/142021/8/144343溫度溫度 體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要在保持一定恒溫的環(huán)境中才能生長(zhǎng)。在達(dá)到最適溫度（37）前，一般細(xì)胞繁殖率因溫度的升高而增加，但是，溫度逐步升高并超過(guò)最適溫度時(shí)，繁殖會(huì)被抑制。 當(dāng)溫度在25- 35，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度很慢，但能夠生存；細(xì)胞在4也能存活數(shù)天；只要溫度不低于0，細(xì)胞都能生存；加了保護(hù)劑還能放到液氮中保存。 當(dāng)高溫時(shí)，在41

25、- 42中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，43以上，則多數(shù)細(xì)胞死亡。 高溫比低溫對(duì)細(xì)胞的影響更為明顯。2021/8/142021/8/144444氣相和氣相和PHPH 5% CO2 + 95%空氣混合氣體（O2）。 CO2既是細(xì)胞生長(zhǎng)所需，同時(shí)又是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的PH有關(guān)。 最適PH 7.2 7.4 低于PH 6.8或高于PH7.6可能對(duì)細(xì)胞有害，甚至死亡。酚紅指示劑：黃酚紅指示劑：黃 6.6 橙橙 8.0 紅紅2021/8/142021/8/1445453、無(wú)毒無(wú)污染無(wú)無(wú) 毒：毒：無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與 細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須細(xì)胞直接或間

26、接接觸的東西都必須 是無(wú)毒的。若具細(xì)胞毒性，細(xì)胞容是無(wú)毒的。若具細(xì)胞毒性，細(xì)胞容 易導(dǎo)致死亡。因此，選用器皿和材易導(dǎo)致死亡。因此，選用器皿和材 料時(shí)必須注意。料時(shí)必須注意。2021/8/142021/8/144646無(wú)無(wú)微生物的污染微生物的污染不同細(xì)胞類型的交叉污染不同細(xì)胞類型的交叉污染細(xì)菌細(xì)菌霉菌霉菌支原體支原體體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng)，無(wú)防御能力，體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng)，無(wú)防御能力，一旦發(fā)生細(xì)菌等污染，細(xì)胞最終會(huì)死亡。一旦發(fā)生細(xì)菌等污染，細(xì)胞最終會(huì)死亡。交叉污染容易使細(xì)胞系失去原有特性。交叉污染容易使細(xì)胞系失去原有特性。2021/8/142021/8/144747三、細(xì)胞培養(yǎng)

27、基本技術(shù) 1、原代細(xì)胞培養(yǎng) 2、傳代細(xì)胞培養(yǎng) 3、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察 4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、運(yùn)輸2021/8/142021/8/144848 在無(wú)菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔在無(wú)菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔 操作前操作前, ,無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射30 30 分分鐘滅菌，以鐘滅菌，以75% 75% 或或70% ethanol 70% ethanol 擦拭無(wú)菌操作臺(tái)擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 10 分鐘分鐘 操作時(shí)操作時(shí)，小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。

28、勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約4545角取用角取用 操作過(guò)程中注意操作過(guò)程中注意，有菌意識(shí)，無(wú)菌操作！，有菌意識(shí)，無(wú)菌操作！2021/8/142021/8/1449491 1、原代細(xì)胞培養(yǎng)、原代細(xì)胞培養(yǎng) 原理：原理： 將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用膠原酶）或組織貼壁法處理，得到單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群，膠原酶）或組織貼壁法處理，得到單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群，置合適的

29、培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。 儀器、材料及試劑：儀器、材料及試劑： CO2CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器械、計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（器械、計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（3737） 1640/DMEM F121640/DMEM F12培養(yǎng)基（含培養(yǎng)基（含10%10%血清），血清）， 2% 2%膠原酶膠原酶IIII，PBSPBS，酒精，酒精2021/8/142021/8/145050組織消化法組織消化法 1.1.準(zhǔn)備：準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化取各種已消毒的培養(yǎng)用

30、品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒臺(tái)面，紫外線消毒3030分鐘。開(kāi)始工作前先洗分鐘。開(kāi)始工作前先洗手、手、75%75%酒精擦拭手至肘部。酒精擦拭手至肘部。 2.2.處理組織：處理組織：采集的標(biāo)本必須在采集的標(biāo)本必須在4H4H內(nèi)完成。內(nèi)完成。取出取出6-10cm6-10cm長(zhǎng)臍帶，置于燒杯或平皿中，用長(zhǎng)臍帶，置于燒杯或平皿中，用PBSPBS液漂洗液漂洗2323次，去除血污；如懷疑組織可次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30603060分鐘。分鐘。2021/8/142021/8/145151 3.3.剪切：剪切：用手術(shù)剪將組織塊剪成用手術(shù)

31、剪將組織塊剪成2323立方毫立方毫米大小，然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成米大小，然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成1 1立立方毫米的小塊，以便于消化。加入與組織塊方毫米的小塊，以便于消化。加入與組織塊總量總量1 1：1 1的的2%2%膠原酶膠原酶IIII，然后一并倒入瓶中，然后一并倒入瓶中，封口。，封口。 4.4.消化：消化：或用恒溫水浴，或置于或用恒溫水浴，或置于3737溫箱消溫箱消化均可，消化中每隔化均可，消化中每隔2020分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間依組用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。織塊的大小和組織的硬度而定。 37 37

32、 空氣搖床空氣搖床100100轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/min/min，1.5-2h1.5-2h2021/8/142021/8/145252 5.5.分離：分離：待組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)待組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，并倒入至少胞，立即終止消化，并倒入至少5 5倍體積倍體積的的PBSPBS稀釋消化液，隨即通過(guò)稀釋消化液，隨即通過(guò)200200目的不銹目的不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊。鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊。2500rmp2500rmp離心消化離心消化2020分鐘，吸出上清，加分鐘，吸出上清，加入入8-10ml PBS8-10ml PBS，1000rmp1000rmp離心離心5mi

33、n5min，吸出，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。 6. 6. 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過(guò)大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝胞密度過(guò)大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。入培養(yǎng)瓶中。 7.7.換液換液：24-48H24-48H后觀察細(xì)胞是否貼壁，如后觀察細(xì)胞是否貼壁，如已有部分細(xì)胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。已有部分細(xì)胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。2021/8/142021/8/1453532、傳代細(xì)胞培養(yǎng) 傳代前的準(zhǔn)備傳代前的準(zhǔn)備 1. 1. 酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試管，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或

34、板，管，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或板，計(jì)時(shí)器，筆計(jì)時(shí)器，筆 2. 0.25%2. 0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 3. 3. 含血清培養(yǎng)基，含血清培養(yǎng)基，PBSPBS2021/8/142021/8/145454傳代步驟（貼壁細(xì)胞）：傳代步驟（貼壁細(xì)胞）： 1. 鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài) 2. 吸出舊的培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)液或PBS清洗兩次（切記要清洗干凈）。 3. 消化細(xì)胞：最常用的方法是在培養(yǎng)瓶中添加1ml 0.25%含EDTA的胰酶，培養(yǎng)箱中37消化5-15s。可根據(jù)不同的細(xì)胞類型調(diào)整消化時(shí)間及程度。 在電鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞之間間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形即可。2021/8/1420

35、21/8/145555 4. 4. 終止消化：立即加入含有血清的終止消化：立即加入含有血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打分散細(xì)胞，吹打培養(yǎng)基，用吸管吹打分散細(xì)胞，吹打動(dòng)作不可過(guò)猛，力度要適中，否則容動(dòng)作不可過(guò)猛，力度要適中，否則容易損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡易損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。 5. 1000rmp5. 1000rmp離心離心5min5min，棄上清。，棄上清。 6. 6. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。細(xì)胞密度。2021/8/142021/8/1456563 3、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察常規(guī)觀察：常規(guī)觀察： 培養(yǎng)液顏色（是否變

36、黃）培養(yǎng)液顏色（是否變黃） 生長(zhǎng)增殖變化（經(jīng)歷到哪個(gè)時(shí)期，長(zhǎng)滿否）生長(zhǎng)增殖變化（經(jīng)歷到哪個(gè)時(shí)期，長(zhǎng)滿否） 形態(tài)變化（透明度、折光性、細(xì)胞輪廓）形態(tài)變化（透明度、折光性、細(xì)胞輪廓） 微生物污染（細(xì)菌、霉菌）微生物污染（細(xì)菌、霉菌） 可用顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動(dòng)態(tài)可用顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動(dòng)態(tài)2021/8/142021/8/145757細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。胞的細(xì)胞數(shù)目。2021/8/

37、142021/8/145858 1.1. 將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。 2.2. 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min3min，注意蓋片下不要有，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?。氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑小?3.3. 計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：方的。然后按公式計(jì)算： 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/mL=/mL=四大格細(xì)胞總四大格細(xì)胞總數(shù)數(shù)/4/4

38、104104 說(shuō)明：公式中除以說(shuō)明：公式中除以4 4，因?yàn)橛?jì)數(shù)了，因?yàn)橛?jì)數(shù)了4 4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以公式中乘以104104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為： 1.0mm1.0mm（長(zhǎng)）（長(zhǎng)）1.0mm1.0mm（寬）（寬）0.1mm0.1mm（高）（高）=0.1mm3=0.1mm3而而 1ml=1000mm3 1ml=1000mm3 （注意：鏡下偶見(jiàn)有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞（注意：鏡下偶見(jiàn)有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液以上，說(shuō)明分散不好，

39、需重新制備細(xì)胞懸液2021/8/142021/8/145959 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（細(xì)胞計(jì)數(shù)）（細(xì)胞計(jì)數(shù)） 細(xì)胞周期細(xì)胞周期（流式）（流式） 細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)（細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù) ） 細(xì)胞貼壁率細(xì)胞貼壁率2021/8/142021/8/1460604 4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及運(yùn)輸、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及運(yùn)輸 及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要：及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要： 細(xì)胞一旦離開(kāi)活體開(kāi)始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性細(xì)胞一旦離開(kāi)活體開(kāi)始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。條

40、件的變化而不斷有新的變化。 細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70-70冰箱中可以保存冰箱中可以保存3 3個(gè)月個(gè)月到一年之久；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)到一年之久；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)- -196196，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。2021/8/142021/8/146161原理：原理： 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融慢凍快融，可以最大限度的保存細(xì)胞活力?？梢宰畲笙薅鹊谋４婕?xì)胞活力。 目前細(xì)胞凍存多采用二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，這兩目前細(xì)胞凍存多采用二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜

41、對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。 復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化快速融化的方法。的方法。 這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。造成損傷。2021/8/142021/8/146262凍存步驟凍存步驟 1. 1. 配制含配制含10%DMSO10%DMSO或甘油、或甘油、

42、101020%20%血清血清的凍存的凍存培養(yǎng)液培養(yǎng)液； 2. 2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶胰酶把單層把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至直接將細(xì)胞移至15ml15ml離心管中；離心管中； 3. 3. 離心離心1000rpm1000rpm，5min5min； 4. 4. 去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為密度為5 510106 6/ml/ml1 110107 7/ml/ml； 2021/8/