肝糖原的提取、鑒定與定量

1、生物化學實驗報告姓 名： 汪煜靈 學 號： 3130010071 專業(yè)年級： 2013級臨床醫(yī)學 組 別： 第2實驗室 生物化學與分子生物學實驗教學中心實驗名稱肝糖原的提取、鑒定、分離實驗日期2014-12-25實驗地點第2實驗室合作者陳海玲 指導老師朱利娜評分教師簽名批改日期1、 實驗目的1、 掌握組織樣品的制備方法，了解其注意事項。2、 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鑒定與蒽酮比色測定糖原含量的原理和注意事項，掌握其操作方法。3、 正確操作使用刻度吸管和可調(diào)微量取液器。4、 熟練運用溶液混勻的各種方法。5、 正確掌握溶液轉(zhuǎn)移的操作。6、 正確操作使用分光光度計。2、 實驗原理l 肝糖原的提取

2、糖原儲存于細胞內(nèi)，采用淹沒勻漿等方法可使細胞破碎，低濃度的三氯醋酸能使蛋白質(zhì)變性，破壞肝組織中的酶且沉淀蛋白質(zhì)，而糖原仍穩(wěn)定地保存于上清液中，從而使糖原與蛋白質(zhì)等其他成分分離開來。糖原不溶于乙醇而溶于熱水，故先用95%乙醇將綠葉中糖原沉淀，再溶于熱水中。l 糖原的鑒定糖原水溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色。這是糖原中葡萄糖長鏈形成的螺旋中，依靠分子間引力吸附碘分子后呈現(xiàn)的顏色。糖原還可被酸水解為葡萄糖，利用呈色反應和葡萄糖的還原性，可判定肝組織中糖原的的存在。CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)22Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 +

3、H2O2CuOH = H20 + Cu2O (紅色)Cu(OH)2 = H2O + CuO (黑色)l 肝糖原的定量糖原在濃酸中可水解為葡萄糖，濃硫酸能使葡萄糖進一步脫水生成糠醛衍生物5-羥甲基呋喃甲醛，此化合物再與蒽酮脫水縮合生成藍色的化合物。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收。糖含量在10100mg范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。利用此反應與同樣處理的已知葡萄糖含量的標準溶液比色，通過標準對照法即可計算出樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定，故在顯色之前，肝組織先置于濃堿中加熱，以破壞其他成分，而保留肝糖原。3、 實驗材料l 儀器：1、 普通離心機，室溫-100恒溫水浴箱（x

4、2），722型分光光度計，精度為 10mg級電子天平2、 剪刀、鑷子、研缽3、 試管架，離心管，試管4、 刻度吸量管（2ml ,5ml），1000l微量可調(diào)取液器5、 100ml容量瓶6、 白瓷反應板l 試劑：雞肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、濃HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘試劑、班氏試劑、30%KOH溶液、標準葡萄糖液（50mg/L）蒽酮顯色劑4、 實驗步驟l 肝糖原的提取+5%CCl3COOH 1ml+5%CCl3COOH 3ml+蒸餾水2ml雞肝約1.5g，剪碎 研磨至乳狀研磨成肝勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中，離心3mi

5、n（4000r/min）取上清液+5ml 95%乙醇，混勻，靜置10min離心5min（4000r/min）取沉淀沸水浴2min，溶解沉淀+50% NaOH 0.2ml+班氏試劑0.2ml(4d)+濃HCl 0.2ml 糖原溶液1ml白瓷板中 沸水浴加熱15min，冷卻 加碘試劑0.1ml 加碘試劑0.1ml 糖原溶液0.1ml糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液呈色對比 混勻沸水浴2min，觀察變化l 注意事項：1、 提取肝糖原時，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必須混勻。由于上清液為水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成兩層。加之上清液已4ml多，加上等量乙醇，總量接近9ml，混勻操作

6、比較困難，最好用傾倒混勻，或用玻璃棒攪拌混勻。2、 糖原中葡萄糖螺旋鏈吸附碘產(chǎn)生的顏色與葡萄糖殘基數(shù)的多少有關(guān)。葡萄糖殘基在20個以下的會使碘呈現(xiàn)紅色，20-30個之間使碘呈現(xiàn)紫色，60個以上的會使碘呈現(xiàn)藍色。淀粉中分支鏈較長，故呈藍色，而肝糖原分枝中的葡萄糖殘基在20個以下（通常8-12個葡萄糖殘基），吸附碘后呈現(xiàn)紅棕色。3、 糖原水解液中鑒定葡萄糖時，加班氏試劑不能過量，否則反應液呈黑色渾濁，觀察不到應有的結(jié)果。l 肝糖原定量測定雞肝 0.15 g+30% KOH 1.5ml沸水浴15min冷卻，全部轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中加水至標線，仔細混勻，獲得糖原提取液取3支干凈的試管，按下表操作：試

7、劑（ml）空白管標準管樣品管蒸餾水1.0標準葡萄糖溶液1.0糖原提取液1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混勻，沸水浴10min，冷卻。在722型或721型分光光度計620nm波長處，用空 白管溶液調(diào)零，測定各管溶液的吸光度（A）.計算：肝糖原（g/100g肝組織）= X 0.05 X X X 1.115、 實驗現(xiàn)象與結(jié)果討論l 糖原水解液加班氏試劑沸水浴后無明顯變化。l 糖原溶液加碘試劑后呈紅棕色，但與碘試劑原來顏色區(qū)別不大。l 雞肝加堿沸水浴后分層，上層為紅棕色，下層無色。l 加入蒽酮溶液并且水浴過后的空白管、標準管、樣品管（由左至右）對比l 將空白管在620nm處的A值設定為0，測得標準管、樣品管的A值如下：空白管標準管樣品管100.6100.085200.6120.085300.6160.091平均值00.6130.087肝糖原（g/100g肝組織）= X 0.05 X X X 1.11 0.525從肝糖原的定量試驗中可知雞肝樣品中含有糖原，但在定性實驗中結(jié)果不明顯，可判斷實