分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告全解(有圖有真相)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告慕 藍(lán)有 志 班夢想學(xué)院33目 錄實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌的培養(yǎng)2實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提取4實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA7實(shí)驗(yàn)四 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定9實(shí)驗(yàn)五 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA11實(shí)驗(yàn)六 植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析14實(shí)驗(yàn)七 RNA分離與純化17實(shí)驗(yàn)八 RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNA19實(shí)驗(yàn)九 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)21實(shí)驗(yàn)十 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化23實(shí)驗(yàn)十一 克隆的篩選和快速鑒定25實(shí)驗(yàn)十二 地高辛標(biāo)記的Southern雜交27實(shí)驗(yàn)十三 阿拉伯糖誘導(dǎo)綠色熒光蛋白的表達(dá)31思考題32分子實(shí)驗(yàn)心得總結(jié)33實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌的培養(yǎng)一

2、、目的學(xué)習(xí)細(xì)菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。二、原理在基因工程實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌是不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料。質(zhì)粒的保存、增殖和轉(zhuǎn)化；基因文庫的建立等都離不開細(xì)菌。特別是常用的大腸桿菌。大腸桿菌是含有長約3000kb的環(huán)狀染色體的棒狀細(xì)胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上快速生長。當(dāng)大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其開始裂殖前，先進(jìn)入一個(gè)滯后期。然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，以2030min復(fù)制一代的速度增殖。最后，當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和氧耗盡或當(dāng)培養(yǎng)基中廢物的含量達(dá)到抑制細(xì)菌的快速生長的濃度時(shí)，菌體密度就達(dá)到一個(gè)比較恒定的值，這一時(shí)期叫做細(xì)菌生長的飽和期。此時(shí)菌體密度可達(dá)到1

3、15;1092×109/mL。培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)室中最常用的是LB培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與主要儀器（一） 實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌（二） 試劑1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化鈉4. 1mol/L NaOH5. 瓊脂粉6. 抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）（三）儀器1. 培養(yǎng)皿2. 帶帽試管3. 涂布器4. 滅菌鍋5. 無菌操作臺(tái)（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等）6. 恒溫?fù)u床四、操作步驟（一）LB培養(yǎng)基的配制配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950m1去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5gNaCl 10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用1

4、mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH位至7.0。加入去離子水至總體積為lL，在15 lbfin2 (1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20分鐘。這樣得到是LB液體培養(yǎng)基。LB固體培養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加瓊脂粉15g/L。（二）細(xì)菌的培養(yǎng)（）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.過夜培養(yǎng)取5ml液體培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個(gè)單菌落，接種于培養(yǎng)液中。蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37過夜培養(yǎng)。.大體積培養(yǎng)按1100（V/V）的比例將過夜培養(yǎng)物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應(yīng)該是培養(yǎng)液體積的5倍以上。于37，約200r/min劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)。（）在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)

5、 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。平板劃線法分離單菌落采用無菌技術(shù)，用接種環(huán)將接種物從平板的一側(cè)開始劃線。重新消毒接種環(huán)，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復(fù)劃線直至覆蓋整個(gè)平板。（見下圖）于37培養(yǎng)直至長出單菌落。實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提取一、目的學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理二、原理質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，具有雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。它具有自主復(fù)制能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。目前，經(jīng)人工改造的質(zhì)粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運(yùn)載工具載體。質(zhì)粒DNA的提取是依據(jù)質(zhì)粒DNA分子較染色體DNA分子小，且具有超螺旋共價(jià)閉合環(huán)

6、狀的特點(diǎn)，從而將質(zhì)粒DNA與大腸桿菌染色體DNA分離?，F(xiàn)在常用的方法有：堿裂解法、密度梯度離心法、煮沸裂解法等。實(shí)驗(yàn)室普遍采用的堿裂解法具有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。其主要原理：利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在堿變性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔眩p螺旋也有部分解開，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)pH=4.8的乙酸鈉將其pH調(diào)到中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA與大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一

7、起沉淀下來而被除去。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與主要儀器（一）實(shí)驗(yàn)材料含質(zhì)粒的大腸桿菌DH5（二）試劑1. LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至7.0。高壓滅菌20分鐘。2. LB平板培養(yǎng)基：在每1000mL LB液體培養(yǎng)基中中加入15g瓊脂，高壓滅菌20分鐘。3. 溶液：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。4.溶液：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必須新鮮配制）5.溶液：pH4.8的醋酸鉀溶液（5mo1L乙酸鉀 60 ml，冰乙酸11.5 ml

8、，水 28.5ml）。6. TE緩沖液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。7. 無水乙醇和70%乙醇。（三）儀器1. Eppendorf管、離心管架2. 10，100，1000 l微量加樣器3. 臺(tái)式高速離心機(jī)4. 搖床、高壓滅菌鍋四、操作步驟（一）培養(yǎng)細(xì)菌將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB平板培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)24小時(shí)，然后從平板上挑取單菌落，接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)12小時(shí)。（二）提取步驟1. 將兩種菌液1.4ml移入1.5ml離心管，離心60秒（12000rpm），倒去上清液，如收集2.8ml菌液，重復(fù)一次，倒轉(zhuǎn)于濾紙除凈殘液。2.G

9、EP、P38各加入100l預(yù)冷的溶液（懸浮液體），用渦旋震蕩器充分懸浮。再P38加入10g/l RNAase。3.加入150l溶液，快速顛倒溫和混勻，室溫放置2-3分鐘。此時(shí)溶液應(yīng)非常粘稠。4.加入150l 預(yù)冷的溶液，溫和混勻（此時(shí)應(yīng)有可見沉淀），在冰浴中5分鐘。5.12000rpm離心3分鐘。轉(zhuǎn)移上清液400l至另一1.5ml離心管中。6.加800 l乙醇到上清液中，混勻，水浴5min，12000rpm離心5分鐘，除去上清（盡可能除去殘液）。7.用1ml 70%乙醇洗DNA沉淀一次，離心2分鐘，除去乙醇（盡可能除去殘液）。8.離心干燥DNA。9.GEP、P38各加40l、20l TE溶解D

10、NA，待用（或-20保存）。（三）電泳檢測1.按照實(shí)驗(yàn)三各步驟制好膠，安裝好電泳儀，準(zhǔn)備點(diǎn)樣。2.分別取5lP38、GFP質(zhì)粒的TE溶解液，加入1/5（1l的溴酚藍(lán)）體積的點(diǎn)樣緩沖液，混勻后小心的進(jìn)行點(diǎn)樣，記錄樣品點(diǎn)樣順序和點(diǎn)樣量。3.電泳完染色、拍照觀察。具體步驟見實(shí)驗(yàn)三。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.GFP質(zhì)粒電泳圖如下：·圖中箭頭所指即為我組的GFP質(zhì)粒點(diǎn)樣條帶2.P38質(zhì)粒的電泳結(jié)果圖如下所示：圖中箭頭所指為我組P38質(zhì)粒點(diǎn)樣電泳條帶六分析與討論根據(jù)對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在點(diǎn)樣孔的下方均有明亮可見的條帶出現(xiàn)，說明提取的質(zhì)粒純度還算較高。而且對(duì)比可見，GFP質(zhì)粒的亮度明顯強(qiáng)于P38質(zhì)粒

11、的條帶，這個(gè)原因可能有：一是實(shí)驗(yàn)室所提供的兩種質(zhì)粒的菌液濃度可能存在差異，故而質(zhì)粒DNA的含量也就存在差異；二是菌液加樣量的差別也直接關(guān)系到提取的質(zhì)粒含量變化；三是提取過程中沒有去除干凈殘液，導(dǎo)致質(zhì)粒中帶入雜質(zhì)，所以影響了質(zhì)粒的純度。與其他組相比，本組的提取結(jié)果還是比較成功。在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)該注意的問題是：1.點(diǎn)樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿，也不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。 2.在處理樣品時(shí)，盡量用移液槍將液體移進(jìn)離心管底部，避免液體殘留在管壁，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。3.溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，為一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使

12、用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。勿將溶液滴灑在臺(tái)面或地面上，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用水徹底沖洗干凈。 實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA一.目的學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA純度，DNA的構(gòu)型，含量以及分子量的大小。二.原理瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，它簡單易行，只需少量的DNA就能檢測。其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物；使得DNA發(fā)射的熒光，增強(qiáng)幾十倍。而熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對(duì)照，就可比較出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂糖凝

13、膠塊直接在紫外光下照射拍照，只需510ng DNA，就可以從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測到0.010.1ng的DNA。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷。在電場中向著正極移動(dòng)，在用電泳法檢測DNA分子時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡量減少電荷效應(yīng)。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應(yīng)，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時(shí)適當(dāng)降低電泳時(shí)的電壓，也可以使分子篩效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)而提高分辨率。當(dāng)然也可

14、以用同樣的方法檢測RNA。三、試劑與主要儀器（一）試劑1. DNA樣品2. TBE緩沖液（5×）：用時(shí)需稀釋10倍（配制見附錄）3. 點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油4. 溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶 （注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心）5. 瓊脂糖（二）儀器1. 電泳儀系統(tǒng)2. 紫外燈3. 恒溫水浴箱四、操作步驟1.選擇合適的水平式電泳儀，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢測穩(wěn)壓電源與正負(fù)極的線路。2.選擇孔徑大小適宜的點(diǎn)樣梳，垂直架在電泳槽負(fù)極的一端，使得點(diǎn)樣梳的底部與電泳槽水平面的距離為0.51.0mm。3.制備瓊脂糖凝膠

15、：按照被分離的DAN分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。一般情況下可參考下表：瓊脂糖的含量（%）分離線裝DNA分子的有限范圍(kb)0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1稱取1g瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，配制約100ml 凝膠液，置微波爐中反復(fù)幾次加熱，每次一分鐘，直至瓊脂糖融化均勻，看起來透明澄清。4.將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，并在一端插好梳子。待凝膠溶液冷卻至60左右時(shí)，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，然后小心地拔掉梳子保持點(diǎn)樣孔完整，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入TBE緩沖液）。注意：

16、緩沖液要高出凝膠面2。5.待測的DNA樣品中，加入1/5體積的點(diǎn)樣緩沖液，混勻后小心的進(jìn)行點(diǎn)樣，記錄樣品點(diǎn)樣順序和點(diǎn)樣量。6.開啟電源開關(guān)，電壓U=150V，I=200Ma. 不超過5V/cm。7.泳時(shí)間看實(shí)驗(yàn)的具體要求而異，在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA各條區(qū)帶分開后電泳結(jié)束。一般20分鐘至3小時(shí)，帶上雙層手套，取出電泳凝膠塊放入EB溶液盒中染色5分鐘，再取出放在凝膠成像儀里檢測拍照。拍照后清理凝膠以及儀器。注意：EB有致癌作用，操作時(shí)應(yīng)小心注意，帶上雙層手套，保持成像室清潔。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的電泳圖已附在相關(guān)實(shí)驗(yàn)之中，這里不做贅述。六注意事項(xiàng)1.凝膠的制備：凝

17、膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。 2.用移液槍將樣品加至點(diǎn)樣孔，吸取每一個(gè)樣品時(shí)，操作要穩(wěn)當(dāng)且細(xì)心。 3.在樣品中加入水溶性的陰離子追蹤染料（溴酚藍(lán)），用以看出樣品移動(dòng)的距離。 4.電泳一般是在追蹤染料泳動(dòng)到膠的80%部位時(shí)停止。注意電泳期間，電泳槽蓋要安全蓋好，以防止液體蒸發(fā)，又可以降低電擊的可能性。 5.電泳結(jié)束后，將膠浸沒在1mg/L的溴化乙錠（EB）中，5min后即可看到DNA帶。（EB有毒，戴手套操作）實(shí)驗(yàn)四 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定一、目的

18、學(xué)習(xí)質(zhì)粒的酶切及電泳分析。二、原理限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別雙鏈DNA特定位點(diǎn)，并產(chǎn)生特異的切割，形成粘性末端或平末端，這樣有利于DNA片段再連接。限制性內(nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切點(diǎn)，酶切后就能產(chǎn)生多少個(gè)片段。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切點(diǎn)的數(shù)目；從片段遷移率的大小可以判斷酶切片段大小的差別。用已知相對(duì)分子量DNA為對(duì)照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對(duì)分子質(zhì)量。質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)有三種構(gòu)象：共價(jià)閉環(huán)DNA，常以超螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成開環(huán)DNA；線狀DNA，雙鏈DNA斷開

19、成線狀。電泳時(shí)，三種構(gòu)象中，共價(jià)閉環(huán)DNA遷移率最大，其次是線狀DNA和開環(huán)DNA。因此在本實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒在電泳中呈現(xiàn)23條區(qū)帶。三、試劑與主要儀器（一）試劑1.EcoR酶2.DNA3.TBE緩沖液（5×）：用時(shí)需稀釋10倍4.點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油5.溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶 （注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心）6.瓊脂糖（二）儀器1.電泳儀系統(tǒng)2.紫外燈3.恒溫水浴箱四、操作步驟（一）質(zhì)粒DNA（P38質(zhì)粒）酶切管號(hào)質(zhì)粒DNA101010EcoR/µl11酶切Buffer（10×）/

20、µl222ddH2O/µl876RNA酶11. 按下表將各種試劑分別加入每個(gè)Eppendorf管中，要注意管號(hào)。2. 加樣后混勻，置于37水浴中，保溫2小時(shí)。然后每個(gè)管中加入4µl Loading buffer。（二）瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖凝膠的制備稱取1g瓊脂糖加入100ml 0.5×TBE緩沖液中，加熱熔解。2.膠板制備將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的瓊脂糖，待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入0.5× TBE緩沖液），拔掉梳子。注意：緩沖液要高出膠面2毫米。2. 加樣每個(gè)樣品中

21、加入1/10體積點(diǎn)樣緩沖液，混勻后小心地加入樣品槽中，要避免相互污染。3. 電泳觀察接通電源，電壓為150V，電泳1小時(shí)左右，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)下沿1-2處時(shí)，停止電泳。4. 觀察及照相將膠板拿出，在EB中染色5min，用凝膠成像系統(tǒng)照相。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果P38質(zhì)粒酶切電泳圖如下：圖中箭頭所示即為本組的P38質(zhì)粒酶切電泳圖六分析與討論上述電泳圖中包含了P38的PCR與本組的P38質(zhì)粒酶切電泳圖，圖中清晰可見的具有兩條帶的圖帶即為P38酶切圖。質(zhì)粒DNA酶切在瓊脂糖凝膠中一般為三條帶，最前面的條帶為超螺旋構(gòu)型，中間為線型，最后為單鏈有缺刻的構(gòu)型。而圖中酶切帶最前面的一條帶也沒有P38的PCR條帶跑的遠(yuǎn)，可

22、見此酶切電泳條帶里只有線狀DNA和開環(huán)DNA，無共價(jià)閉合環(huán)狀DNA存在。且酶切的條帶明顯暗于質(zhì)粒條帶。實(shí)驗(yàn)五 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA一、目的1.學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2.了解引物設(shè)計(jì)的一般要求。二、原理聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是體外酶促合成DNA片段的一種技術(shù)。利用PCR技術(shù)可在數(shù)小時(shí)之內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR進(jìn)行的基本條件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）引物dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）Taq DNA聚合酶反應(yīng)緩沖體系PCR循環(huán)由三個(gè)步驟組成：變

23、性 使模板DNA解離成單鏈；退火 使引物與模板DNA所需擴(kuò)增序列結(jié)合；延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成與模板堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，通過30個(gè)左右循環(huán)后，目的片段的擴(kuò)增可達(dá)106倍。引物設(shè)計(jì)：要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確，特異，有效的對(duì)引物DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下原則：引物長度：1525個(gè)核苷酸； GC含量為40%60%；Tm值為55（Tm=4（C+G）+2（A+T）計(jì)算；引物與非特異配對(duì)位點(diǎn)的配對(duì)率小于70%；引物自身配對(duì)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)小于3，兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)。由于影響引物的設(shè)計(jì)的因素比較多，所以常常利用計(jì)算機(jī)來輔助設(shè)

24、計(jì)。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)二中提取的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大量得到目的DNA片段。三、試劑與儀器（一）試劑1. Taq DNA聚合酶2.10×反應(yīng)緩沖液（含25mmol MgCl2）3.dNTP4.引物（P1、P2）5.溴乙啶 (EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心。6.點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油。（二）儀器1. PCR擴(kuò)增儀2.電泳儀3.臺(tái)式離心機(jī)4.紫外分析儀5.恒溫水浴6.凝膠成像系統(tǒng)四、操作步驟（一）PCR擴(kuò)增1.按下表加入試劑，并小心混勻。模板為實(shí)驗(yàn)一中提取的質(zhì)粒DNA(P38)

25、。試劑體積（20µl）ddH2O7µl2 x Mix Taq10µlPrimer M13D1µlPrimer M13R1µl模板(p38)1µl2.設(shè)置PCR程序： 94 300s 94 45s 32 cycles: 58 45s 72 60s 72 600s 10 forever3.運(yùn)行PCR程序 （二）PCR產(chǎn)物鑒定反應(yīng)結(jié)束后，取20l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 % 瓊脂糖電泳分析。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1基因組DNA的PCR的電泳圖如下：. 圖中箭頭所示即為本組基因組DNA的PCR電泳圖2.P38的PCR圖中箭頭所示即為本組P38的PCR電泳圖六

26、分析與討論這兩個(gè)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)對(duì)熟練掌握PCR的基本實(shí)驗(yàn)技能和原理意義重大，通過對(duì)所提取的DNA用 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)有一個(gè)宏觀的認(rèn)識(shí)。本組條帶清晰可見，這與科學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作和細(xì)心的實(shí)驗(yàn)態(tài)度密不可分，在做實(shí)驗(yàn)的過程中，不斷培養(yǎng)自身科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)素養(yǎng)，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)六 植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析一、目的掌握植物基因組DNA提取的一般方法及注意事項(xiàng)。大分子量DNA分子的酶切分析。二、原理十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度時(shí),從溶液中沉淀。在本實(shí)驗(yàn)方案中，首先通過含有

27、CTAB高鹽抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和細(xì)胞碎片沉淀，離心后，溶液分為三層，上層為CTAB與核酸的復(fù)合物的高鹽溶液，中層為蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，下層為氯仿。取出上清加入異丙醇使核酸沉淀。由于CTAB能溶解于乙醇，在洗滌過程中CTAB即可被除去。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與主要儀器（一）實(shí)驗(yàn)材料小麥幼苗（二）試劑1. DNA 抽提液用時(shí)將下述三種溶液按1:1:0.4 (V/V)比例混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g/L），即為抽提液。 DNA extraction（500ml）：31.885g sorbitol (山梨醇)6.05g Tris pH8.2 (一般不調(diào)) Nuclei lysis

28、buffer（500ml）: 100ml 1M Tris pH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH2O 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽) 500ml2.氯仿：異戊醇（24：1）3 70% 乙醇4.異丙醇5.HindIII酶6.EcoR酶（三）器材1.臺(tái)式離心機(jī)2.恒溫水浴3.紫外分析儀4.微量加樣器四、操作步驟（一）基因組DNA提取1.取0.6g左右小麥葉片，在液氮中研磨后分裝到四個(gè)1.5ml離心管中，每管加入700l抽提液（65預(yù)熱）混勻，放入65水浴中，裂解30分鐘，期間溫和混勻幾次。2.取出裂解好的DNA ，加

29、入700l 氯仿：異戊醇（24：1），猛烈混勻，離心（10000rpm，10分鐘）。3.取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍預(yù)冷異丙醇，緩慢混勻后，再猛烈混勻，使DNA成團(tuán)，-20放置半小時(shí)以上。4.將析出的DNA 離心，14000rpm，10分鐘。5.去掉上清，將沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，離心干燥，溶于50l TE中。（三） 酶切及電泳分析1. 按照下表加入各成分。管號(hào)植物基因組DNA/ l10EcoR/ml1EcoRBuffer（10×）2ddH2O/ l737反應(yīng)4h，迅速加入2 l EDTA 終止反應(yīng)2. 10000rpm離心20 S混勻，37反應(yīng)4h

30、。3. 0.8%瓊脂糖凝膠電泳（樣品全部點(diǎn)樣）。4.觀察并記錄結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、基因組提取電泳圖 箭頭所示即為本組基因組DNA的電泳條帶2、基因組DNA酶切電泳圖 箭頭所示即為本組基因組DNA酶切的電泳圖六分析與討論根據(jù)電泳條帶來看，基因組DNA的提取情況良好，但是基因組DNA的酶切條帶并不理想。正常情況下，酶切條帶應(yīng)該呈現(xiàn)分子量不同的多條帶，但是如圖所示，除了離點(diǎn)樣孔較近的地方有亮線外，其它地方都沒有明顯條帶，還有拖尾現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能有：1. 加入的限制性核酸內(nèi)切酶量過量；2. 所提取的DNA純度不高，導(dǎo)致酶切效果不明顯；3. 根據(jù)圖示發(fā)現(xiàn)marker條帶也不是很好，這可能是

31、電泳中的緩沖液濃度或者是電流大小有問題。4. 可能是所用的DNA酶被污染，或酶切時(shí)間過久。注意事項(xiàng)：拿到小麥幼苗，首先進(jìn)行稱量并用剪刀剪碎于研缽中，然后加入液氮進(jìn)行研磨。待液氮?jiǎng)倓偨]幼苗時(shí)，開始迅速研磨，到液氮揮發(fā)干凈時(shí)立刻停止研磨。操作反復(fù)進(jìn)行，直至幼苗呈現(xiàn)綠中透白的粉末為止，在液氮保護(hù)下迅速分裝至離心管。點(diǎn)樣時(shí)注意一次點(diǎn)到位。在將膠轉(zhuǎn)移到EB液里時(shí)，切忌皮膚接觸，戴手套操作。實(shí)驗(yàn)七 RNA分離與純化一、目的掌握RNA提取的基本技術(shù)，了解RNA提取過程中的各種注意事項(xiàng)。二、原理RNA提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中難度較大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。RNA提取和DNA提取有類似的地方，因?yàn)樗鼈兌际呛怂?，都具有較好的

32、水溶性。提取RNA首先破碎細(xì)胞，然后用提取液將RNA溶出，反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)，加入乙醇沉淀RNA，將RNA沉淀溶解備用。那么如何區(qū)分DNA和RNA分開？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的鹽溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的鹽溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進(jìn)行區(qū)分。另外，RNA的分子量一般比較小，而DNA分子很大且和蛋白結(jié)合成復(fù)合體，所以DNA更容易隨蛋白沉淀，而RNA具有較好的溶解性。RNA提取的另一個(gè)關(guān)鍵問題就是如何抑制或去除環(huán)境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和鐵器具在180×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1的DEPC水37過夜浸泡，然后

33、濕熱滅菌80烘干備用。配制溶液所需的水也要用DEPC處理過的水，而配置Tris相關(guān)的緩沖液時(shí)Tris會(huì)與DEPC發(fā)生反應(yīng)，應(yīng)避免用DEPC處理。另外操作過程中應(yīng)戴手套。判斷RNA 的質(zhì)量主要有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，一是純度，二是完整性（是否被降解）。RNA的純度可以通過分光光度計(jì)進(jìn)行測定的A260A280值來判斷。RNA的完整性主要通過電泳分析來闡明，未降解的總RNA電泳時(shí)在凝膠中會(huì)出現(xiàn)18S和28SrRNA對(duì)應(yīng)的條帶（如果有DNA污染則在RNA后會(huì)發(fā)現(xiàn)基因組DNA對(duì)應(yīng)的條帶）。RNA電泳系統(tǒng)也要嚴(yán)格對(duì)RNA酶進(jìn)行處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，則用盡量減少電泳時(shí)間。三、試劑與器材 輔助方案：試劑盒提取法

34、（Trizol）（一）試劑： 1.Ttizol Reagent 2.氯仿3.異丙醇4.70%無水乙醇5.DEPC （二）器材：1.研缽2.離心機(jī)四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 稱取小麥葉片600mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移分裝到四只1.5ml離心管中。2. 加入1 ml Trizol Reagent，室溫放置5min。3. 加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 sec，室溫放置3min。4. 冷凍離心12 000 rpm×15min。5. 將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，加0.5ml預(yù)冷異丙醇,混勻，-20放置20min。6. 冷凍離心12 000 rpm×10min，棄上清。7.

35、 加入0.5ml 70%乙醇于RNA沉淀中并懸浮沉淀，10000 rpm×2min，除去乙醇。8. 加入30 l DEPC 處理過的ddH2O溶解RNA。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.RNA提取的電泳圖如下所示：如圖箭頭所示即為本組RNA提取的電泳圖六分析與討論根據(jù)電泳圖可知我們提取到了一部分RNA，但是和marker對(duì)比，發(fā)現(xiàn)我們的條帶整個(gè)發(fā)亮，而不是理想情況下僅有兩三條清晰可見的亮帶，造成這個(gè)現(xiàn)象的可能原因是：1. 跑RNA電泳時(shí)，我們所用的電壓很高，電泳時(shí)間過長；2. 整個(gè)條帶發(fā)亮，可能是提取到的RNA遭到了降解（RNA本身就容易降解）；3. 操作的時(shí)候未能夠保證完全的無RNA酶環(huán)境，造成RN

36、A的部分降解。提取RNA時(shí)，必須嚴(yán)格注意以下幾點(diǎn)：1. 研磨時(shí)不要凍傷小麥幼苗，并快速研磨，待液氮揮發(fā)干凈的時(shí)候停止研磨，迅速轉(zhuǎn)移；2. 操作時(shí)切勿說話，戴手套操作，防止RNA降解；3. 棄掉上清后，不要嗑，也不要讓吸水紙伸入離心管，因?yàn)槲埍旧砭秃忻割?，易造成RNA降解。實(shí)驗(yàn)八 RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNA一、目的學(xué)習(xí)從細(xì)胞或組織的RNA中用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增目的基因的技術(shù)及操作。二、原理普通PCR方法可以以DNA為模板擴(kuò)增基因，但真核生物的基因組中通常分為可轉(zhuǎn)為mRNA的外顯子和不轉(zhuǎn)錄的成mRNA的內(nèi)含子，所以從染色體DNA用PCR方法擴(kuò)增出的基因是內(nèi)含子和外顯子相間排列的DNA分子

37、，不能用于基因工程的直接表達(dá)。如果用人工的方法把內(nèi)含子去除，是極其煩瑣費(fèi)力的事。逆轉(zhuǎn)錄PCR利用逆轉(zhuǎn)錄病毒依賴于RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄合成酶，在反義引物或oligo（d T）的引導(dǎo)下合成mRNA互補(bǔ)的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，擴(kuò)增出不含內(nèi)含子的可編碼完整蛋白的基因。這一DNA的5，和3，端經(jīng)改造可直接用于基因工程的表達(dá)，因此逆轉(zhuǎn)錄PCR成為了目前獲取目的基因的一條重要途徑。三、試劑與器材（一）試劑1. RNA模板2. cDNA引物3. 反轉(zhuǎn)錄緩沖液4. dNTP5. MMLV反轉(zhuǎn)錄酶6. RNA抑制劑（RNasin）7. Taq

38、酶及10×PCR緩沖溶液8. 引物（P1、P2）（二）器材1.PCR擴(kuò)增儀2.電泳儀3.臺(tái)式離心機(jī)4.恒溫水浴四、操作步驟1. RNA的反轉(zhuǎn)錄 在PCR管中依次加入RNA模板 5 lOlig（dT）18引物 1LDEPC H2O 6 L混合后，70水浴5 min（破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)），迅速冰浴5min。 在管中依次加入 (反應(yīng)體系為20 L)：5×RT buffer 4LRNasin 1L10mM dNTP 2L混勻，37保溫5min。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 1 L置于 42水浴，1h。 70保溫5min（使酶失活）。2. PCR擴(kuò)增DNA在滅菌的0.2ml PCR管中，（30l體系

39、）依次加入10l cDNA1l RT引物I1l RT引物II15l 2×Taq Mix3l ddH2OPCR程序： 94 300s 94 45s 32 cycles: 58 45s 72 60s 72 600s 10 forever3. PCR產(chǎn)物的鑒定取20l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳分析。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.RT-RNA的PCR電泳圖如下箭頭所示即為本組RT-RNA的PCR電泳圖六分析與討論 上圖中左半邊是P38的酶切電泳條帶，右半部分是RT-RNA的PCR電泳圖。根據(jù)圖示，與marker對(duì)比，本組條帶清晰明亮，效果較好。但是其他組條帶微弱甚至不可見，這個(gè)原因可能是：1.在實(shí)驗(yàn)操

40、作時(shí)，沒有嚴(yán)格按照無菌操作，導(dǎo)致所提取的RNA遭到降解；2.點(diǎn)樣量不足；3.未加反轉(zhuǎn)錄酶或者加入量少。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該注意的問題：由于RNA極易被環(huán)境中的酶所降解，因此，在提取RNA時(shí)，一定要保證操作的無菌，具體體現(xiàn)在：操作時(shí)切勿說話，戴手套操作，所有與RNA提取相關(guān)的儀器和用品皆應(yīng)該用DEPC液處理（配置Tris相關(guān)的緩沖液除外，因?yàn)門ris會(huì)與DEPC發(fā)生反應(yīng)）。 實(shí)驗(yàn)九 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)一、目的掌握DNA體外連接的基本技能，了解連接反應(yīng)的注意事項(xiàng)。二、原理DNA片段之間的連接是通過DNA連接酶的催化實(shí)現(xiàn)的。DNA連接酶催化具有平末端或互補(bǔ)粘性末端的DNA片段間相鄰堿基通過3,

41、5磷酸二酯鍵連接起來，該反為需能反應(yīng)，通常需要加入ATP或NADH，DNA連接酶對(duì)粘性末端的連接效率要遠(yuǎn)高于對(duì)平末端的連接效率。在基因基因工程實(shí)驗(yàn)中，最常用的來源于T4噬菌體的T4DNA連接酶。對(duì)于平末端或互補(bǔ)的粘性末端可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。一個(gè)片段是平末端，另一片段為粘性末端或兩個(gè)片段都是粘性末端但不配對(duì)，則需要通過各種方式使其可一匹配或通過平末端進(jìn)行連接。通常采用末端補(bǔ)平、加同聚物尾、加接頭等方式是目的片段之間能夠匹配。進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，為了減少片段的自連，通常要進(jìn)行去磷酸化，去磷酸化可通過堿性磷酸酶完成。比如將目的片段和載體進(jìn)行時(shí)通常要將載體去磷酸化，以減少載體的自連。同要進(jìn)行連接反應(yīng)也經(jīng)常

42、對(duì)目的片段進(jìn)行磷酸化以增強(qiáng)目的片段的連接，在相鄰堿基間如果沒有磷酸在連接效率大幅下將，如果載體進(jìn)行了去磷酸化，目的片段可進(jìn)行磷酸化，以增強(qiáng)目的片段和載體的連接。在連接反應(yīng)中，目的DNA片段和載體的比例是一個(gè)關(guān)鍵問題，對(duì)于長度為1kb的片段和3kb的載體而言，通常目的片段和載體的比例設(shè)為2：1或3：1，如果目的片段越長該比例應(yīng)再升高，因?yàn)橹饕紤]的是載體和目的片段之間的分子數(shù)的比例。反應(yīng)體系中核酸的濃度也是一個(gè)重要問題，通常反應(yīng)體系中反應(yīng)物濃度應(yīng)保持在25-100ng/l。連接反應(yīng)和其它酶不同，需要在較低的溫度下進(jìn)行，通常在1216過夜，也可在4過夜連接，如果是平末端連接，可適當(dāng)提高連接溫度。除

43、上述因素外，DNA樣品的純度、鹽濃度等會(huì)影響連接效率。三、試劑與器材（一）試劑1.目標(biāo)DNA片段（實(shí)驗(yàn)九RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）2.載體（pGEM-T Easy）3. 2×ligation 緩沖液4. T4 DNA連接酶（二）器材1.臺(tái)式離心機(jī)2.恒溫水浴3.微量移液器四、操作步驟1. 取一個(gè)1.5ml離心管依次加入下列試劑:2×ligation buffer： 5lpGEM-T Easy： 0.5l目的片段： 2.5lT4 DNA連接酶： 1lddH2O 1l 2. 離心機(jī)離心30s，使反應(yīng)體系充分混合。3. 4過夜連接。五、分析與討論1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)

44、有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。2、在連接反應(yīng)中，如不對(duì)載體分子進(jìn)行去5"磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)十 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、目的掌握感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化的基本方法。二、原理受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法, 化學(xué)試劑法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。三、試劑與器材（一）試劑1.0.1mol/L CaCl2取20l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。2.L

45、B液體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）3.LB固體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）4.氨芐青霉素（100mg/mL）（二）器材1.冷凍離心機(jī)2.平衡天平3.無菌操作臺(tái)4.微量移液器四、操作步驟（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備(0.1M CaCl2方法)1.從LB固體平板挑單克隆于5ml LB液體培養(yǎng)基中(不加抗生素)，37×200rpm×12-16h，可過夜培養(yǎng)。2. 將活化菌體按15接種到LB中，擴(kuò)大培養(yǎng)37×200rpm×2h，至OD600約為0.4。3. 取培養(yǎng)好的菌液1.5 ml于一離心管中，4 離心4 000rpm×2 min。 4. 棄上清，加500 l 0.1M Ca

46、Cl2 (滅菌預(yù)冷)洗菌體，4冷凍離心4000rpm×2 min。5. 徹底除去殘液, 加200 l 0.1M CaCl2 (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體。6. 冰浴靜置 30 min ，4冷凍離心4000rpm×2 min。7. 棄上清，加100 l 0.1M CaCl2 (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體，即為制備好的感受態(tài)細(xì)胞。注意事項(xiàng)： 整個(gè)過程注意無菌操作和保持低溫。 培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)生長期是制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵。 如果要求高轉(zhuǎn)化效率，不建議使用簡單深凍保存的感受態(tài)細(xì)胞。 LB液體培養(yǎng)基建議用不加抗生素和加抗生素的兩種培養(yǎng)基，檢查菌體是否污染。 D600值指細(xì)胞密度，用于判斷培養(yǎng)物是否

47、處于對(duì)數(shù)生長期。OD600值在0.4 - 0.5時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)在20min內(nèi)加倍。（二）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化1. 將連接產(chǎn)物加入100 l制備好的感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min。2. 42熱激90s。3. 迅速冰浴3min。4. 加入300 l LB液體培養(yǎng)基，37輕搖培養(yǎng)45min。5. 加入30 l X-gal和6 l IPTG,混勻。6. 取100 l涂布在含有50 g/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基中。7. 37倒置，避光培養(yǎng)16-20 h。8. 藍(lán)白斑篩選，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果將經(jīng)過避光培養(yǎng)的培養(yǎng)基取出，觀察到皿內(nèi)有大量的菌落生長，其中白斑居于大多數(shù)，

48、藍(lán)斑零星分布在白斑附近。六分析與討論根據(jù)藍(lán)白斑篩選原理知：未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長；轉(zhuǎn)化了空載體，即沒有重組質(zhì)粒的菌體，長成藍(lán)色菌落；轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落?？梢?，培養(yǎng)基上絕大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功。影響轉(zhuǎn)化的因素可能有：1.細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為好，密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化率。     2.對(duì)以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低。     3. 感受態(tài)細(xì)胞的制備對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大。一般未經(jīng)特殊處理的培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)重組DNA分子不敏感，難以轉(zhuǎn)化成功。4.

49、轉(zhuǎn)化體系中重組DNA的濃度與純度對(duì)轉(zhuǎn)化率也有一定影響。在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高，轉(zhuǎn)化率越高，重組DNA純度越高，轉(zhuǎn)化率越高。 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題：1.在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，首先應(yīng)該減少管口的敞開，防止雜菌污染；其次在懸浮細(xì)胞時(shí)應(yīng)該盡量動(dòng)作輕柔，用槍頭輕輕吹起細(xì)胞即可，避免影響細(xì)菌活性；最后就是所有操作都應(yīng)該在冰上進(jìn)行。2.涂布前玻璃棒要充分冷卻，不然會(huì)因?yàn)闇囟冗^高而燙死細(xì)菌。 3.菌液涂平板的時(shí)候要避免來回涂布，否則過多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化效率 4.操作過程中要盡量迅速以確保細(xì)菌細(xì)胞的活性。 5.所有的操作都應(yīng)該在無菌的條件下進(jìn)行，防止雜菌和其他DNA的污染。&#

50、160;實(shí)驗(yàn)十一 克隆的篩選和快速鑒定一、目的掌握快速細(xì)胞破碎法測定大小不等的眾多的質(zhì)粒DNA；和菌落PCR快速鑒定克隆。二、原理在這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法中，只需配制一種細(xì)胞緩沖液（它可以在室溫下保存，長期使用）。利用破碎細(xì)胞緩沖液中的陰離子去污劑-SDS在37溶解膜蛋白，使細(xì)胞破裂，并解聚核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使得蛋白質(zhì)沉淀。利用EDTA螯合金屬離子，防止破碎細(xì)胞的脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解。然后高速離心，去除細(xì)胞碎片核大部分的染色體DNA和RNA蛋白，將含有質(zhì)粒DNA的上清夜直接進(jìn)行點(diǎn)樣電泳和分離。在瓊脂糖凝膠上分離開的個(gè)組分中，有染色體DNA，不同大小的質(zhì)粒DNA和RNA，它

51、們都可以經(jīng)肉眼觀察或拍照顯示?；蛘哂迷O(shè)計(jì)好的引物，做菌落PCR快速鑒定克隆。三、試劑與器材（一）試劑1. 破碎細(xì)胞緩沖液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)1% SDS2mmol/L EDTA400mmol/L蔗糖0.01%溴酚藍(lán)配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10 ml 20% SDS 10 ml 250mmol/L EDTA 1.6 ml 蔗糖 27.2g 1.2%溴酚藍(lán) 1.67ml 加ddH2O至200毫升2. 10mg/ml 溴乙啶3. TBE電泳緩沖液（5×）4. Taq DNA聚合酶5. 10×反應(yīng)緩沖液（含25mmol

52、 MgCl2）6. dNTP7. 點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油。（二）器材1.電泳儀2.1.5ml 離心管3.Tip 4.培養(yǎng)皿5.PCR擴(kuò)增儀6.臺(tái)式離心機(jī)7.紫外分析儀8.恒溫水浴四、操作步驟菌落PCR快速鑒定法1.直接用牙簽或接種針挑取少許菌體加入25l或50l PCR反應(yīng)體系中。2.用通用引物或特異引物進(jìn)行PCR，根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無和大小來判斷插入片段的有無、大小及方向（反應(yīng)體系參照前面實(shí)驗(yàn)）。試劑體積（20l）ddH2O8lPrimer M13D1lPrimer M13R1l模板1個(gè)菌落或菌落稀釋液2 x Taq 酶10l五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.菌落PCR電泳圖如下所示：圖中箭頭所示即為本組的菌落PCR的電泳圖六分析與討論根據(jù)圖示可以看見菌落PCR的條帶，不過不是很亮，這可能與所加模版液濃度有關(guān)，證明了我們將外源基因正確的插入到了菌體當(dāng)中。比較發(fā)現(xiàn)，右邊3個(gè)菌落PCR條帶似有似無，這很可能是菌落出現(xiàn)了假陽性的結(jié)果，造成這種現(xiàn)象的原因可能是粘在菌落上的目的基因被污染了。因此為降低菌落PCR假陽性，可以用載體引物代替目的基因引物。實(shí)驗(yàn)十二