流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析

1、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 史桂英史桂英BDBD公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto一一 流式細(xì)胞儀的基本原理流式細(xì)胞儀的基本原理 *穩(wěn)定流動(dòng)穩(wěn)定流動(dòng) *激發(fā)光斑激發(fā)光斑 *熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償 *熒光素選擇熒光素選擇二二 數(shù)據(jù)分析及開(kāi)窗數(shù)據(jù)分析及開(kāi)窗FCMFCM原理示意圖原理示意圖 層流是液體穩(wěn)定流動(dòng)的必要條件層流是液體穩(wěn)定流動(dòng)的必要條件,管道中層流管道中層流 的形成要滿(mǎn)足雷諾數(shù)的形成要滿(mǎn)足雷諾數(shù)

2、dV Re = 2300， 式中式中、分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d d和和V V分別為管道的直徑和液體的平均流速。分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCMFCM利用層流技術(shù)利用層流技術(shù), ,使細(xì)胞流動(dòng)穩(wěn)定使細(xì)胞流動(dòng)穩(wěn)定, ,并具有自聚焦并具有自聚焦作用作用, ,為細(xì)胞分析分選提供技術(shù)保證為細(xì)胞分析分選提供技術(shù)保證. . 層流技術(shù)層流技術(shù)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（示意圖）（示意圖） 流速與壓力的關(guān)系服從流速與壓力的關(guān)系服從BernoulliBernoulli方程，即方程，即 P=(1/2)P=(1/2) V V2 2 ( (忽略高度的變化忽略高度的變化) )。改變氣

3、壓。改變氣壓, ,就可獲得不同的流速。就可獲得不同的流速。 低速低速 高速高速不同樣本速率形成的樣本流不同樣本速率形成的樣本流激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng).20um64um32um 0 32um聚焦距離聚焦距離激光束激光束聚焦透鏡聚焦透鏡強(qiáng)度強(qiáng)度光束成形與細(xì)胞受照方式光束成形與細(xì)胞受照方式這種橢圓形這種橢圓形光斑的檢測(cè)光斑的檢測(cè)區(qū)保證每個(gè)區(qū)保證每個(gè)細(xì)胞分別受細(xì)胞分別受到光照且受到光照且受檢時(shí)受到一檢時(shí)受到一致的光照致的光照 熒光光譜重?zé)晒夤庾V重疊疊 FITCFITC和和PEPE熒光光譜重疊熒光光譜重疊Uncompensated vs CompensatedFL1FL2 利用電子

4、技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的方法稱(chēng)熒光通道的信號(hào)加以扣除的方法稱(chēng)“”熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償MeanMean值判斷補(bǔ)償值判斷補(bǔ)償雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色綠色、橙色FITC+T red 488 525 綠色綠色 568 615 紅色紅色FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、綠色、 紅色紅色FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色綠色、橙紅色F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色

5、綠、橙、紅色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙紅色、紅色綠、橙紅色、紅色F+P +PeCy5 +APC 488 525 、 575 綠色、橙色綠色、橙色 633 670 紅色紅色 熒光染料熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)（nm) nm) 發(fā)射波長(zhǎng)（發(fā)射波長(zhǎng)（nm) nm) 顏色顏色 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在起，在488nm488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。LaserLaserCY7755PEECD620CY

6、5670488nm488nm能量傳遞染料：能量傳遞染料：流式細(xì)胞術(shù)操作流程流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織新鮮組織石蠟包埋石蠟包埋單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液制備制備熒光抗體標(biāo)記熒光抗體標(biāo)記上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè)表型測(cè)定表型測(cè)定細(xì)胞分選細(xì)胞分選繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析單分散細(xì)胞單分散細(xì)胞FSCSSC細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞熒光測(cè)量細(xì)胞熒光測(cè)量 未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞 在激發(fā)光的照射下可測(cè)到有微弱的熒在激發(fā)光的照射下可測(cè)到有微弱的熒 光信號(hào)光信號(hào). . 經(jīng)過(guò)各種特異染色的經(jīng)過(guò)各種特異染色的 細(xì)胞在細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測(cè)到較強(qiáng)的熒光激發(fā)光的照射下可測(cè)

7、到較強(qiáng)的熒光 信號(hào)信號(hào). .自發(fā)熒光信號(hào)與特異染色的熒光信號(hào)分析圖自發(fā)熒光信號(hào)與特異染色的熒光信號(hào)分析圖自發(fā)熒光信號(hào)自發(fā)熒光信號(hào)特異染色的熒光信號(hào)特異染色的熒光信號(hào)DNADNA分析比較分析比較排除雙聯(lián)體細(xì)胞排除雙聯(lián)體細(xì)胞細(xì)胞阻滯在細(xì)胞阻滯在G G2 2M M期期雙克隆細(xì)胞周期分析雙克隆細(xì)胞周期分析 溴脫氧尿嘧啶核苷溴脫氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )BrdUrd )是胸苷的一種類(lèi)似物。是胸苷的一種類(lèi)似物。它可以替代它可以替代胸腺嘧啶摻入到細(xì)胞新合成的胸腺嘧啶摻入到細(xì)胞新合成的DNADNA分子中，成為分子中，成為S S期

8、細(xì)胞的一種標(biāo)記物。流式細(xì)胞術(shù)采用抗期細(xì)胞的一種標(biāo)記物。流式細(xì)胞術(shù)采用抗BrdUrdBrdUrd單克隆抗體免疫熒光和單克隆抗體免疫熒光和PIPI雙參數(shù)檢測(cè)細(xì)胞，不僅雙參數(shù)檢測(cè)細(xì)胞，不僅可檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和可檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和DNADNA含量，同含量，同時(shí)可以了解不同細(xì)胞的時(shí)可以了解不同細(xì)胞的DNADNA合成能力高低合成能力高低。 BrdUrdBrdUrd和和DNADNA雙標(biāo)記染色雙標(biāo)記染色BrdUrdBrdUrd與與PIPI檢測(cè)檢測(cè)BrdUrdBrdUrd與與PIPI檢測(cè)檢測(cè)BrdUrdBrdUrd與與PIPI檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞三色熒光檢測(cè)細(xì)胞三色熒光檢測(cè)細(xì)胞因子測(cè)定細(xì)胞因子測(cè)定* *檢測(cè)檢測(cè)T T細(xì)胞細(xì)胞(CD69)(CD69)活化活化G6=R1*R5* *CD4CD4抗原分子結(jié)構(gòu)引起抗原分子結(jié)構(gòu)引起CD4CD4熒光強(qiáng)度下調(diào)熒光強(qiáng)度下調(diào)細(xì)胞因子分析圖細(xì)胞因子分析圖* *過(guò)敏性鼻息肉與鼻息肉細(xì)胞因子比較過(guò)敏性鼻息肉與鼻息肉細(xì)胞因子比較純化單核細(xì)胞純化單核細(xì)胞調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性T