激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)實(shí)用教案

1、原理小結(jié):Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光(ynggung)成像在探測針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個(gè)層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不

2、斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像 。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡技術(shù)第1頁/共43頁第一頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡技術(shù)第2頁/共43頁第二頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 1.抑制圖像的模糊(m hu)，獲得清晰的圖像第3頁/共43頁第三頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)(gungxu)切片conventionalconfocal第4頁/共43頁第四頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)(ch

3、untng)顯微鏡的區(qū)別 3. 增加側(cè)向分辨率2alconventionconfocaldd第5頁/共43頁第五頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別(qbi) 4. 由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響第6頁/共43頁第六頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡技術(shù)三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明2.具有照明針孔(zhn kn)和探測針孔(zhn kn)3.照明針孔(zhn kn)和探測針孔(zhn kn)共軛(共焦), 共焦點(diǎn)即被探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像 5.具有多個(gè)（四個(gè)） 熒光通道，可同

4、時(shí)探測多個(gè)被標(biāo)記物 第7頁/共43頁第七頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡技術(shù) 技術(shù)指標(biāo)（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61/NA （0.25 m ) Confocal: Rxy=0.4/NA（0.18 m ) 2. 樣品的最大厚度(hud): 取決于: 物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度 Z 軸 的 最 大 移 動 范 圍(166m、Z-wide) 3. 樣品的最小光切厚度(hud): (載物臺最小移動距離為40nm） 取決于: 物鏡的NA、針孔大小 Z 軸 的 最 小 移 動 步 距 :

5、40nm Z軸的分辨率: 0.35 m 第8頁/共43頁第八頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡技術(shù)4. 激光器 Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特點(diǎn)(tdin): 1) 方向性好: 激光基本延直線傳播 2) 單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光為平面偏振光, 光纖耦合第9頁/共43頁第九頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡技術(shù)5. 四個(gè)熒光通道, 一個(gè)透射光通道

6、 即除了(ch le)可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光圖像為非共焦圖像。第10頁/共43頁第十頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡技術(shù)6.掃描速度(sd): slow 220lines/s 512512 2-3秒 slow2 440lines/s（2：雙向掃描） medium 450lines/s 512512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512512 0.7秒 128128 0.2秒 fast2 2000lines/s7. 掃描密度: 6464 128128 512512 10241024 20482

7、048第11頁/共43頁第十一頁，共44頁。 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)(jsh)的應(yīng)用The application of Confocal Laser Scanning Microscopy第12頁/共43頁第十二頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 功能.1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示(xinsh)5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進(jìn)行光切6.定量分析7.時(shí)間序列掃描: xyt 、xyzt 和 xt 掃描8.圖像處理9. 旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描 第13頁/共

8、43頁第十三頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡應(yīng)用應(yīng)用定位、定量三維重組動態(tài)測量 活細(xì)胞或組織(zzh)內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化 測量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的檢測 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位第14頁/共43頁第十四頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡應(yīng)用 活細(xì)胞(xbo)內(nèi)H+濃度（ pH值）的測量 線粒體膜電位的測量 熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量 籠鎖解籠鎖的測量 熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測量 其他應(yīng)用第15頁/共43頁第十五頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡應(yīng)用一、定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單

9、標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)）的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管(wi un)的分布、 兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的 增值、分化細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交-fitc + PI熒光原位雜交： 染色體基因定位 第16頁/共43頁第十六頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 定位(dngwi)、定量研究中常用熒光探針 1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等 Green Red

10、Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明) Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白) Texas Red 595/615 (德州紅) Cy3 558/568 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618第17頁/共43頁第十七頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用1)細(xì)胞表面(biomin)抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián), 直標(biāo): 一抗+熒光探針 間標(biāo): 二抗+熒光

11、探針 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗體+熒光探針) 肌動蛋白actin ( Palloidine+熒光探針)2)細(xì)胞膜表面(biomin)受體配體+熒光探針 如 : n A c h R 、 m A c h R 、 多 巴 胺 受 體(D1,D2) 標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC 第18頁/共43頁第十八頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡應(yīng)用2.標(biāo)記(bioj)細(xì)胞器熒光探針1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子, 可檢 測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留 時(shí)間短 JC1 線粒體膜電位

12、低時(shí)為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標(biāo)記(bioj)活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 , 穩(wěn)定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitotracker Orange 還原型, 只能染活細(xì)胞 第19頁/共43頁第十九頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2)溶酶體 Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官(qgun) 為非特異性 AO : LysoTra

13、cker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 較低濃度標(biāo)記線粒體4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞 第20頁/共43頁第二十頁，共44頁。激光掃描(somio)共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞(xbo)器的單克隆抗體5)細(xì)胞(xbo)核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死細(xì)胞(xbo)碘化丙啶E

14、B ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞(xbo)Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞(xbo)Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞(xbo)DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞(xbo)Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活細(xì)胞(xbo) 560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞(xbo)SYTO1116 2024 488/ 520 活細(xì)胞(xbo)SYTO1116 2024 521/ 556 活細(xì)胞(

15、xbo)SYTO 17 621/634 活細(xì)胞(xbo)第21頁/共43頁第二十一頁，共44頁。3. GFP 綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先(shuxin)從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。 將外源基因與GFP DNA 相連, GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測外源基因的表達(dá).激

16、光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用第22頁/共43頁第二十二頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用GFP主要應(yīng)用: 對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察 可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界(wiji)刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá), 如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。 GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動態(tài)觀察 該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程 GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯 示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程 可用于觀察分子的運(yùn)動（FRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）第23頁/共43

17、頁第二十三頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用三.動態(tài)測量Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量1).游離(yul)Ca2+測量 檢測游離(yul)Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離(yul)鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10 xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100n M)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2

18、+濃度的10倍左右） 第24頁/共43頁第二十四頁，共44頁。熒光探針 激發(fā)(jf)波長 發(fā)射波長 KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nmCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488 494nm520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 328nMIndo-1 356nm 405/458nm 230n

19、MFura-2 340/380 476nm 145nM激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用第25頁/共43頁第二十五頁，共44頁。程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測 量。 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對(judu)測量1）單波長公式法Fluo3: 530nm Kd=450nMCa2+I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度( MnCl2)Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度(A23187)測量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低（F值不低于40）激光(jgung)掃描共焦

20、顯微鏡應(yīng)用第26頁/共43頁第二十六頁，共44頁。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同(b tn)Ca2+濃度的Buffer(EGTA- Ca2+)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度3）比例熒光的測量.雙波長(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)Ca2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用第27頁/共43頁第二十七頁，共44頁。激光掃描(som

21、io)共焦顯微鏡應(yīng)用快速Ca2+變化(binhu)的測量1.改變掃描速度2.采用雙向掃描3.減少采樣點(diǎn)數(shù)(犧牲空間分辨率）4.采用線掃描(xt)第28頁/共43頁第二十八頁，共44頁。細(xì)胞器的Ca2+測量(cling)1.線粒體內(nèi)游離Ca2+測量(cling) Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色）2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測 激光掃描(s

22、omio)共焦顯微鏡應(yīng)用第29頁/共43頁第二十九頁，共44頁。 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測量(cling)的應(yīng)用鈣的特性1細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍2細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致 胞內(nèi)鈣明顯升高3細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)”細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用1肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)2神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)4卵子受精5細(xì)胞分裂和再生6細(xì)胞調(diào)亡7細(xì)胞間通訊激光掃描(somio)共焦顯微鏡應(yīng)用第30頁/共43頁第三十頁，共44頁。8細(xì)胞信號傳導(dǎo)9. DNA合成10. 基因表達(dá)細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病1高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病胞內(nèi)鈣濃度異常2糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病胞內(nèi)鈣濃度

23、增高3人體(rnt)缺鈣骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高4老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用第31頁/共43頁第三十一頁，共44頁。電刺激(cj)引起骨骼肌 細(xì)胞的Ca2+振蕩激光掃描(somio)共焦顯微鏡應(yīng)用第32頁/共43頁第三十二頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 pH值的檢測(jin c)： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0第

24、33頁/共43頁第三十三頁，共44頁。自由基的檢測熒光探針：H2DCF-DAH2DCF-DA（504nm/529nm504nm/529nm）2-2-氫，2 2氯熒光素乙酰乙酸鹽 胞外H2DCF-DA H2DCF-DA 擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 酯酶脫乙酰DCF-H(DCF-H(不熒發(fā)光） DCF DCF（發(fā)熒光）* *樣品不能在鏡下用汞燈( (n n d dn n) )照射及觀察 Dihydrorhodamine 123 Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm507nm/529nm）H2rhod123 H2rhod123 被動擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 在細(xì)胞內(nèi)被氧化成rod123rod123

25、（發(fā)光）激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用第34頁/共43頁第三十四頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程(guchng)及定位分布 xyzt 掃描 第35頁/共43頁第三十五頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用四. . 膜電位的測量標(biāo)記(bi(bioj)oj)膜電位探針( (慢反應(yīng)）：JC1 510nmJC1 510nm 530/590nm 530/590nmDioc5(3) 548nmDioc5(3) 548nm 573nm 573nmDioc6(3) 484nmDioc6(3) 484nm 500nm 500nm快反應(yīng)探針：Di-4-A

26、NEPPS 496nmDi-4-ANEPPS 496nm 703nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nmDi-4-ANEPPS 498nm 713nm 713nm細(xì)胞膜靜息膜電位：-70mV-70mV線粒體膜電位：-150mV-150mV以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針 第36頁/共43頁第三十六頁，共44頁。激光(jgung)掃描共焦顯微鏡應(yīng)用七 熒 光 能 量七 熒 光 能 量 ( n n g l i n g ) 共 振 轉(zhuǎn) 移共 振 轉(zhuǎn) 移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量能量(nngling)轉(zhuǎn)移：能量轉(zhuǎn)移：能量(nngling)從分從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量(nngling)從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量能量(nngling)的提供者叫能量的提供者叫能量(nngling)供體，能量供體，能