細(xì)胞培養(yǎng)與病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)二 傳代細(xì)胞培養(yǎng)與病毒在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獾怪蔑@微鏡的構(gòu)造與使用，了解不同傳代細(xì)胞的形態(tài)及接毒后的病變特征，掌握細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法、病毒接種方法及收毒方法。二、常用細(xì)胞的種類BHK-21：倉鼠腎傳代細(xì)胞PK-15：豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2：豬腎傳代細(xì)胞Hela：人的子宮瘤細(xì)胞Vero：非洲綠猴腎細(xì)胞Marc-145：來源于Vero細(xì)胞TK-143：人的胸苷激酶陰性細(xì)胞Sf9：昆蟲細(xì)胞 三、材料1、100ml細(xì)胞瓶、吸管、吸球、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭2、BHK-21（baby hamster kidney）細(xì)胞3、0.25%胰酶4、生長液：含10%犢牛血清、200U/m

2、l青、鏈霉素的DMEM 維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM5、偽狂犬病病毒液（PRV）四、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1）細(xì)胞密度：2-3×105個(gè)/ml2）pH范圍 最適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培養(yǎng)溫度 哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為37 昆蟲細(xì)胞28-30五、常用細(xì)胞分散劑與作用原理1、胰酶 使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個(gè)細(xì)胞。2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：與二價(jià)鈣、鎂離子結(jié)合，從而使細(xì)胞分散。3、灰色鏈絲菌酶 ：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽

3、酶的混合物。六、營養(yǎng)液1、人工綜合營養(yǎng)液氨基酸、糖類、無機(jī)鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。2、血清1）血清的種類 胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用最為廣泛。2）血清的處理無菌采集，過濾除菌。用前56滅活30min。3）血清的作用A、能提供細(xì)胞生存、生長和增生所必須的生長調(diào)節(jié)因子。B、能補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。C、含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長基質(zhì)成分。D、有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用。E、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。F、提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞釋放的蛋白酶

4、的損害。4）應(yīng)用血清存在的問題A、血清中存在不少有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)：補(bǔ)體、免疫球蛋白、生長抑制因子。B、血清的成分不明確，影響對結(jié)果的分析。C、不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。七、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)1、優(yōu)點(diǎn)：1) 可以無限的傳代。2) 不少細(xì)胞系對病毒很敏感。3) 某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。4) 生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。2、缺點(diǎn)：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。3、培養(yǎng)方法1）取長滿單層的細(xì)胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。2）加入2ml 胰酶消化液，于37培養(yǎng)箱放置幾分鐘，至細(xì)胞間出現(xiàn)空隙或細(xì)胞變圓后，倒去消化液。3

5、）加入生長液,反復(fù)吹打幾次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，然后分裝于3個(gè)小瓶中。再在每個(gè)小瓶中補(bǔ)充生長液至10ml，然后置37培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2天即可長成單層。八、病毒（PRV）在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)1、選長滿單層的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液。2、加入適量的病毒懸液3、置溫箱中感作（吸附）45min-1h。4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養(yǎng)液，補(bǔ)足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至80%以上的細(xì)胞病變。5、收毒：將病變的細(xì)胞置于-20冰箱中，凍結(jié)后取出自然解凍，在解凍過程中振搖幾次，以使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。實(shí)驗(yàn)三、原代細(xì)胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細(xì)胞為例）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了

6、解不同原代細(xì)胞的形態(tài)，掌握雞胚成纖維細(xì)胞的制備與培養(yǎng)方法。二、材料1、9-11日齡雞胚2、照蛋燈與蛋座3、碘酊棉球與酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小鑷子5、平皿、細(xì)菌瓶、吸管、吸球、細(xì)胞瓶、6、胰酶、生長液、維持液三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1）細(xì)胞密度原代細(xì)胞：4-6×105個(gè)/ml傳代細(xì)胞：2-3×105個(gè)/ml2）pH范圍 最適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培養(yǎng)溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為37 昆蟲細(xì)胞28-30四、操作步驟1、取9-12日齡孵育良好的雞胚，依次用碘酊和酒精消毒氣室部。2、無菌操作下用剪子去除氣室部卵殼，去除殼膜，穿破絨毛尿囊膜，夾住雞胚頸部，取出雞

7、胚放于滅菌平皿中。3、用眼科剪、鑷去除雞胚頭、四肢及內(nèi)臟，用DMEM沖冼2次。4、將沖洗后的雞胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜狀。5、將剪碎的組織塊倒入錐形瓶或燒杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分沖洗，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加DMEM。如此反復(fù)沖洗2-3遍。6、于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0.25%胰酶，并調(diào)pH至7.6-7.8，振蕩混勻后置37水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動(dòng)一次，使細(xì)胞消化完全（組織塊變散松，沉降漸變緩慢時(shí)即表示消化足夠）。7、取出，靜置幾分鐘，小心吸棄上層胰酶溶液，用DMEM輕洗2次后，加入生長液5ml，用大口徑吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞游離。8、靜置幾

8、分鐘，使未消化好的組織塊下沉。9、細(xì)胞計(jì)數(shù) 取細(xì)胞懸液0.5ml+2ml 0.1%結(jié)晶紫枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室溫或37溫箱中5-10min，充分振蕩后進(jìn)行計(jì)數(shù)。 按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算4角4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（N）。 每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)（n）=N/4×10000×K（稀釋倍數(shù)）。 活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在90%以上。10、將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞稀釋到合適的濃度，使細(xì)胞量約為4-6×106個(gè)/ml，分層于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶1ml，再補(bǔ)加DMEM生長液至10ml，蓋上蓋子，置于37恒溫箱中培養(yǎng)。表示可計(jì)數(shù)表示不計(jì)數(shù)五、結(jié)果的觀察 于培養(yǎng)后每天觀察結(jié)果，至長層單層。細(xì)胞量較大時(shí)

9、，一天即可長成單層，細(xì)胞呈纖維狀。實(shí)驗(yàn)四 病毒感染力的滴定（TCID50的測定）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解病毒感染力測定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50的操作步驟、計(jì)算方法及含義。二、測定病毒感染力的方法半數(shù)致死量LD50( 50% lethal dose)：用動(dòng)物或雞胚來檢測半數(shù)雞胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用細(xì)胞來檢測蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細(xì)胞來檢測三、材料 1、長滿單層的細(xì)胞1瓶

10、2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-10。 2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100µl。3、在每孔加入細(xì)胞懸液100µl，使細(xì)胞量達(dá)到23×105個(gè)/ml。 4、設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排。（100µl生長液+100µl細(xì)胞懸液）5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。6、結(jié)果的計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法五、TC

11、ID50的計(jì)算方法 CPE：細(xì)胞病變效應(yīng)1、Reed-Muench兩氏法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累 計(jì)出現(xiàn)CPE孔所占的%CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6 （11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathic effect距離比例（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）  （91.6-50）/（91.6-40） 0.8lgTCID50=距離

12、比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù) =0.8×(-1)+(-3) =-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.8接種100µl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。2、Karber法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)出現(xiàn)CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-60 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀釋度的對數(shù)D：稀釋度對數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5

13、) =-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.875接種100µl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。實(shí)驗(yàn)五 血清中和試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解中和試驗(yàn)的基本原理和幾種不同的測定方法，掌握固定病毒稀釋血清法的操作步驟和計(jì)算方法及含義。二、原理 抗體與相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使病毒的感染力喪失。三、用途1、疾病診斷2、病毒分離株的鑒定3、不同病毒株的抗原關(guān)系研究4、疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)5、免疫血清的質(zhì)量評(píng)價(jià)6、測定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中是否存在抗體四、分類(一) 蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗(yàn)將病毒正常血清混合物以及病毒待檢血清混合物分別接種到單層細(xì)胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲

14、基纖維素，進(jìn)行蝕斑測定，比較病毒正常血清組和病毒待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中和能力。以試驗(yàn)組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是其蝕斑減數(shù)試驗(yàn)效價(jià)。(二) 交叉保護(hù)試驗(yàn)先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫，然后以待檢病毒進(jìn)行攻擊，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被保護(hù)的情況，判定待檢V的種類或型別。這一方法的缺點(diǎn)是試驗(yàn)周期太長，并且需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?？捎糜谝韵聨追矫妫簯?yīng)用已知V鑒定未知V ；應(yīng)用已知免疫血清鑒定未知V；應(yīng)用已知V鑒定未知血清。（三）終點(diǎn)法中和試驗(yàn)1、固定病毒稀釋血清法 將不同稀釋度的血清與固定量的病毒液（一般為100或200個(gè)TCID50、EID50或LD5

15、0）混合，置適當(dāng)?shù)臈l件下感作一定時(shí)間，再將血清-病毒混合物接種于敏感細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，測定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物發(fā)生病毒感染的能力及其效價(jià)。以能保護(hù)50%組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物不發(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價(jià)（PD50）。2、固定血清稀釋病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對照非免疫血清（對照組）和待檢血清同時(shí)進(jìn)行測定，計(jì)算每一組的TCID50、EID50或LD50，然后計(jì)算中和指數(shù)。五、材料 1、長滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）6、待檢血清、P

16、RV陽性對照血清、PRV陰性對照血清六、操作步驟1、固定病毒稀釋血清法1）測定病毒液的TCID502）將測好TCID50的病毒液稀釋成200個(gè)TCID50的病毒懸液。3）在96孔微量培養(yǎng)板中將血清（預(yù)先56滅活30min）作連續(xù)倍比稀釋（具體方法是在96孔板中先加入50µl生長液，再加50µl待檢血清，混勻后，吸50µl至下一孔，如此下去。一直到1256），每個(gè)稀釋度作4孔。4）在上述各孔內(nèi)加入50µl稀釋好的病毒液，混勻后放入37 5%CO2培養(yǎng)箱中作用45min-60min。5）同時(shí)設(shè)待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細(xì)胞對照，其中病

17、毒對照要作 200個(gè)TCID50、20個(gè)TCID50、2個(gè)TCID50、0.2個(gè)TCID50 4個(gè)不同濃度的對照。6）感作完成后每孔加入100µl細(xì)胞懸液，放37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果，一般要觀察5-7天。 7）結(jié)果計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進(jìn)行。血清稀釋度CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累計(jì)保護(hù)率%CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)12（10-0.3）04015100（15/15）14（10-0.6）04011100（11/11）18（10-0.9）131787.5（7/8）116（10-1.2）132466.7（4/6）132（10-1.5）315116.

18、7（1/6）164（10-1.8）40900（0/9）1128（10-2.1）401300（0/13）1256（10-2.4）401700（0/17）距離比例=（高于50%的保護(hù)率-50% ）/（高于50%的保護(hù)率低于50%的保護(hù)率）=（66.7-50）/（66.7-16.7）=-1.2+0.33×(-0.3)=-1.299lgPD50=高于50%的保護(hù)率的血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋度對數(shù)的差PD50=-1.299的反對數(shù)=0.05=1/20=0.33  即120稀釋的待檢血清可保護(hù)50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞免于出現(xiàn)CPE。2、固定血清稀釋病毒法1）將病毒作連續(xù)10倍稀釋2）將稀釋好的病毒接種96孔板