酶切位點(diǎn)設(shè)計和選擇

1、引物設(shè)計原則及酶切位點(diǎn)選擇和設(shè)計整理:最初的時候，由于害怕設(shè)計酶切位點(diǎn)最后且不開，所以經(jīng)常采用最通用的方法，用 T載體克隆解決問題，但后來發(fā)現(xiàn)她也有問題，就是濃度提不上去，你需要體大量的載體來 酶切，所以感到還是直接擴(kuò)增好一點(diǎn)。但這就需要你仔細(xì)設(shè)計引物。連入質(zhì)粒中的重要目的就是進(jìn)行酶切和連接，當(dāng)然首先就是在想要合成或者是進(jìn)行PCR擴(kuò)增出靶基因的時候在核酸的兩端接入酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是與你的質(zhì)粒的特點(diǎn)相關(guān)的，可以在質(zhì)粒的圖譜說明書上找取相應(yīng)的位點(diǎn)，進(jìn)行設(shè)計。（一）設(shè)計引物前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備載體圖譜，大致準(zhǔn)備把片斷插在那個部分對片斷進(jìn)行酶切分析，確定一下那些酶切位點(diǎn)不能用準(zhǔn)備一本所買公司的酶的

2、商品目錄，便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用 （二）設(shè)計引物所要考慮的問題兩個位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點(diǎn)，且距離不能太近，往往導(dǎo)致兩個酶都切不好。因此，緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點(diǎn)。 我看promega的說明書上說，最好隔四個。還有一種情況是：不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG這樣的位點(diǎn)比較難切。 兩個酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切。最好使用酶切效率高的。最好使用雙酶切有共同 buffer的酶。最好使用較常用的酶（如 hind3, bamhl, ecorl等），最好使用自己實(shí)驗室有的酶，這樣可

3、 以省錢。Tm的計算，關(guān)于Tm的問題，很多的戰(zhàn)友都有疑惑。其實(shí)園子里有很多的解釋了。Tm叫溶解溫度（melting temperature, Tm ）,即是DNA雙鏈溶解所需的溫度。 大家可以理解， 這個溫度是由互補(bǔ)的 DNA區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)?DNA的溶解是沒有作用的。因此， 對于引物的Tm,只有和模板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)?Tm才有貢獻(xiàn)。計算Tm時，只計算互補(bǔ)的區(qū)域（除 非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)）。不少戰(zhàn)友設(shè)計的引物都 Tm過低，是因為他們誤把保護(hù)堿 基和酶切位點(diǎn)都計算到 Tm里了，最后的結(jié)果是導(dǎo)致了 PCR反應(yīng)的諸多困難。所以，設(shè)計引 物的時候，先不管 5'端的修飾序列，把互補(bǔ)

4、區(qū)的 Tm控制在55度以上（我喜歡控制在 58以 上，具體根據(jù)PCR的具體情況，對于困難的 PCR需要適當(dāng)提高Tm）,再加上酶切位點(diǎn)和保 護(hù)堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。Tm溫度高的引物就比較容易克服3 '發(fā)卡、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。簡單的計算公式可以用 2+4的公式。 若你計算的Tm值達(dá)到了快90 ,不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn) 的。自己可以再估計一下。如你設(shè)計了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長分別為29、33個堿基，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分別為17、21個堿基。引物公司給的單子是 70多度，實(shí)際用的只有50度，用55度擴(kuò)的

5、結(jié)果也差不多。其它關(guān)于Tm值的計算，有用PP5.0進(jìn)行評價的，需要考慮的參數(shù)包括：base number、GC% Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火溫度為 Tm-5 度，退火溫度的計 算可以不把加入的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn)去，如上所言，PCR幾個循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的Primer計算出來的。1.一般在5'端加保護(hù)堿基，如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTO減者其它的載體的話，酶切時可

6、以不需加保護(hù)堿基2.有人的經(jīng)驗加入酶切位點(diǎn)的引物可以和未加入時使用相同的退火溫度，結(jié)果也還是令人滿意。關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計引物的軟件進(jìn)行計算一下，看看引物之間的 G （自由能）的絕對值，如果小于10, 一般是問題的。如果稍大，PCR時可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3'端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計引物。 此外，所加的三個核甘酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計有時也可以降低二聚體的Go在設(shè)計酶切位點(diǎn)時， 最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為，一個特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致

7、就是28bp左右了。而我們在設(shè)計退火溫度時，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物 （20bp）的Tm肯定要高一些。如果我們 能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。還有，有些酶是離不開末端序列的， 因此，在設(shè)計一個酶位點(diǎn)時， 最好把該酶的性質(zhì)弄清楚 設(shè)計時限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在 5'端的頂端。在設(shè)計引物時，常在 5 '端添加酶切位點(diǎn)， 以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。設(shè)計引物時保證在最后 5個核昔中含有3個A或T。先用軟件設(shè)計出合適的引物，引物的3'端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對，應(yīng)盡量避免在引物 3'端的第一位堿基是 A。（容易錯配）引物 3

8、'端最佳堿基的選擇是 G 和C,因為他們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和 啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計算引物Tm值時并不包括這些序列， 但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。酶切位點(diǎn)都需要保護(hù)堿基以利于內(nèi)切酶的有效切割。酶切位點(diǎn)前加保護(hù)堿基1,兩個酶切點(diǎn)至少隔上3個堿基，在做載體構(gòu)建的時候設(shè)計引物擴(kuò)增片段進(jìn)行定向連接，除了酶切位點(diǎn)， 還要在兩端加一個三個核甘酸的保護(hù)序列，否則PCR產(chǎn)物很難被酶切，因此就會導(dǎo)致連接失敗，因為內(nèi)切酶需要一定的輔助性堿基才能順利切割，在沒有輔助堿基的情況下，有的酶是可以切割的，比如： S

9、all和SpeI,他們不需要輔助性堿基即可切割，但大部分酶是需要輔 助性堿基的。所以引物順序應(yīng)是：5'保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+引物配對區(qū)一3'下面是幾個戰(zhàn)友的討論，請問：在引物的5 '端加限制酶切位點(diǎn)，只在酶切位點(diǎn)的5 '端加保護(hù)堿基可以嗎？還是必須要在酶切位點(diǎn)的兩側(cè)加保護(hù)堿基？是的，只要在5'端加保護(hù)堿基可以了。 其實(shí)保護(hù)堿基就是要給限制性內(nèi)切酶一個結(jié)合位點(diǎn)， 3 '端還有更長的引物序列在，當(dāng)然不需要再加保護(hù)堿基了，下面就來討論一下這個問題：（下面引自NEB網(wǎng)站）1、寡核甘酸近末端位點(diǎn)的酶切為了解不同內(nèi)切酶對識別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NE

10、B采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核甘酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗。（這里用的是寡核甘酸！ ！而不是末端帶酶切位點(diǎn)的肽鏈?。?shí)驗結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位點(diǎn)很接近時），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近 DNA末端時也很有用。然后 NEB就提供了一個表，關(guān)于鏈長和切割效 率的。我覺得這只能說明酶在作用于識別位點(diǎn)時所需占據(jù)的鏈長，并不能說明在設(shè)計酶切位點(diǎn)時要加那么長的保護(hù)堿基，比如我用的NotI,要加10個堿基，切25個小時才95%的效率，這還是用了 20倍的酶量！我?guī)熃阒患恿?4個堿基，也沒見出現(xiàn)問題。 2、線性載體近末端位點(diǎn)的酶切 將線性載體與相應(yīng)內(nèi)切酶（10 units/ ©

11、;g在適宜溫度及緩沖液條件下反應(yīng)60分鐘，隨后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。切割效率=100%-前切產(chǎn)物車t化子數(shù)/再連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子數(shù)"近末端堿基對數(shù) ”指的是從識別位點(diǎn)到 DNA末端的堿基對數(shù)，但并不包括最初切割位點(diǎn)處留下的單鏈突出堿 基。（解釋一下：就像下面這個例子EcoRI酶切位點(diǎn)NNNG AATTCNNC TTAAG它的近末端堿基對數(shù)就是3,而不是4)4個額還沒有證據(jù)表明單鏈核甘酸能否提高切割效率，因此在設(shè)計PCR引物時應(yīng)至少加上外堿基。Not I 7 100 (2) Bluescript SK- Spe I4 100 Bluescript SK-Ksp I1 98 (2) Bluescr

12、ipt SK Xba I拿 NotI酶切位點(diǎn)的設(shè)計與保護(hù)堿基的選擇EnzymeOligo SequenceCham Length叫 Cleavage 2 hr 20 hrAccIGGTCGACC800CGGTCGACCG1000CCGGTCGACCGG1200AflUICACATGTG800CCACATGTGG10>90>90CCCACATGTGGG12>90>90AsciGGCGCGCC8>go>90AGGCGCGCCT10>90>90TTGGCGCGCCAA12>90>90AvalCCCCGGGG8SO>90CCCCCGGG

13、GG10>90>90TCCCCCGGGGGA12>90>90BamHICGGATCCG8102sCGGGATCCCG10>90>90CGCGGATCCGCG12>90>90BglllCAGATCTG800GAAGATCTTC1075>90ggaagatcttcc1225>90BssHTIGGCGCGCC800AGGCGCGCCT1000TTGGCGCGCCAA12SO>90Bst£UGGGT(A/T)ACCC9010BstXIAA匚下6匚46卬匚匚以以丁6匚2仃662200AAAACTGCAGCCAATGCATTGGA

14、A242S50CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT2725>90ClalCATCGATG800GATCGATC800CCATCGATGG10>90>90CCCATCGATGGG125050EcoRIGGAATTCC8>90>90CGGAATTCCG10*0>90CCGGAATTCCGG12>90>9CHaelllGGGGCCCC8>90>90AGCGGCCGCT10>90>90TTGCGGCCGCAA12>90>90HindlllCAAGCTTG800CCAAGCT1GG1000CCCAAGCT

15、TGGG121075KpnlGGGTACCC800GGGGTACCCC10>90>90CGGGGTACCCCG12>90>90MluIGACGCGTC800CGACGCGTCG102550NcolCCCATGGG800CATGCCATGGCATG145075NdelCCATATGG800CCCATATGGG1000CGCCATATGGCG1200GGGTTTCA FATGAAACCC1800GGAA1TCqATATGGAA1TCC20/b>90gggaaiiclaiaiggaairccc22/5>90NhelGGCTAGCC800CGGCTAGCCG1010

16、25CTAGCTAGCTAG121050NoUTTGCGGCCGCAA1200ATTTGCGGcCgCT1IA161010AZKAT AT GCGGCC Gc T AT AAA201010ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT242590AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA2825>90NsilTGCATGCATGCA1210>90CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT22>90>90Padttaattaa800gttaattaac10025CCTTAATTAAGG120>90Pmelgtttaaac800ggtttaaacc1

17、0025GGgTTTaaaccc12050AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG2475>90PstIGCTGCAGC800TGCACTGCAGTGCA141010AAcTGcAGAACCAATGCATTGG22>90>90AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA24>90>90CTGcAGAACCAATGCATTGGATGCAT2600PvulCCGATCGG800ATCGATCGAT101025TCGCGATCGCGA12010SadCGAGCTCG81010SadiGCCGCGGC800TCCCCGCGGGGA1250>90SallG

18、TCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GCGTCGACirrCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAZ<321075SealGAGTACTC81025AAAAG kAO 1 1 1127575SmalCCCGGG6010CCCCGGGG8010CCCCCGGGGG101050TCCCCCGGGGGA12>90>90SpelGACTAGTC810>90GGACTAGTCC1010>90CGGACTAGTCCG12050CTAGACTAGTCTAG14050SphIGGC

19、ATGCC800CATGCATGCATG12025ACATGCATGCATGT141050StulAAuGCcTT8>90>90GAAGGCC7 TC10>90>90AAAAbGCL1 ITT12>90>90XbalCTCTAGAG800GCTCTAGAGC10>90>90TGCTCTAGAGCA1275>90CTAGTCTAGACTAG147s>90XholCCTCGAGG800CCCTCGAGGG101025CCGCTCGAGCGG121075XmalCCCCGGGG800CCCCCGGGGG102575CCCCCCGGGGGG1

20、250>90TCCCCCCGGGGGGA14>90>901酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hrNot ITTGCGGCCGC AAo0Alli GCGGCCGC IIIAio10AAATAT GCGGCCGC TATAAAio10ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT2590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA25>90Nsi ITGC ATGCAT GCA10>90CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT>90>90Pac ITTAATTAA00GTTAATTAA C025CC TTAATTAA GG

21、0>90Pme IGIIIAAAC00GGIIIAAAC C025GGGmAAAC CC050AGdU GUTAAAC GGCGCGCCGG75>90Pst IGCTGCAG C00TGCA CTGCAG TGCA1010AACTGCAG AACCAATGCATTGG>90>90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA>90>90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT00Pvu ICCGATCG G00ATCGATCG AT1025TCG CGATCG CGA010Sac ICGAGCTC G1010Sac IIGCCGCGG C

22、00TCC CCGCGG GGA50>90Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCG1050GACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA1075Sca IGAGTACT C1025AAAAGTACT TH7575Sma ICCCGGG010CCCCGGG G010CC CCCGGG GG1050TCC CCCGGG GGA>90>90Spe IGACTAGT C10>90GG ACTAGT CC10>90CGG ACTAGT CCG050CTAG

23、ACTAGT CTAG050Sph IGGCATGC C00CAT GCATGC ATG025ACAT GCATGC ATGT1050Stu IAAGGCCT T>90>90GAAGGCCT TC>90>90AAAAGGCCI III>90>90Xba ICTCTAGA G00GC TCTAGA GC>90>90TGC TCTAGA GCA75>90CTAG TCTAGA CTAG75>90Xho ICCTCGAG G00CC CTCGAG GG1025CCG CTCGAG CGG1075Xma ICCCCGGG G00CC CCCG

24、GG GG2575CCC CCCGGG GGG50>90TCCC CCCGGG GGGA>90>90酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGAC C00CG GTCGAC CG00CCG GTCGAC CGG00Afl IIICACATGT G00CC ACATGT GG>90>90CCC ACATGT GGG>90>90Asc IGGCGCGCC>90>90AGGCGCGCC T>90>90TTGGCGCGCC AA>90>90Ava ICCCCGGG G50>90CCCCCGGG GG>90>90TCC CCCGGG GGA>90>90BamH ICGGATCC G1025CG GGATCC CG>90>90CGC GGATCC GCG>90>90Bgl IICAGATC