{超薄切片中的細(xì)胞和病毒}概況

1、chapter 超薄切片中的細(xì)胞和病毒I,正常與病理細(xì)胞的比較n ,病毒在細(xì)胞中的生活周期m,病原病毒的鑒定在病毒的整個生命周期中， 一定需要宿主細(xì)胞提供其復(fù)制核酸、 合成蛋白和組裝的場所， 而且病毒并沒有完整的酶系統(tǒng), 它需要利用宿主細(xì)胞的一系列“裝置”為其服務(wù)。這些都可導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生病變。 電鏡是觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要手段。 目前， 我們所獲得的關(guān)于細(xì)胞、 細(xì)胞器， 甚至一些細(xì)胞內(nèi)大分子的形態(tài)信息大多都由它來提供。 本章將著重講述利用超薄切片技術(shù)結(jié)合其它輔助方法， 在電鏡下觀察病毒與宿主細(xì)胞的相互作用及其病毒生命周期，并簡單介紹利用超薄切片和電鏡進(jìn)行病原病毒的鑒定和檢測。sectio

2、n 正常與病理細(xì)胞的比較電鏡下觀察到的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對簡單，膜系統(tǒng)不發(fā)達(dá)。在電鏡下觀察原核細(xì)胞多使用負(fù)染色技術(shù)，主要關(guān)注于它的大小，形態(tài)（桿狀、球狀等） ，鞭毛或菌毛的著生位置、數(shù)量等。正常的原核細(xì)胞，尤其是處于生命活動旺盛的分裂期的細(xì)胞，?？煽吹郊?xì)胞由完整流暢的內(nèi)、外膜包圍，有些細(xì)胞內(nèi)還可看到一些細(xì)胞器（圖 圖 1 ）和細(xì)胞內(nèi)膜狀結(jié)構(gòu)等。病毒（噬菌體）入侵這些原核生物時，有時可導(dǎo)致原核細(xì)胞膜變得皺縮，呈波浪形，不再光滑（ 圖 圖 2） ，有些可觀察到細(xì)胞內(nèi)子代病毒。真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，表面細(xì)胞膜有多種分化，細(xì)胞內(nèi)部還有豐富的細(xì)胞器，如細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、線粒體、質(zhì)體、溶酶體、核糖

3、體、微管微絲及脂肪滴、糖原等。不同的病毒感染，所引起的病變也不盡相同。其中細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等的變化尤為明顯。subsection 細(xì)胞膜和細(xì)胞的表面分化及其病毒對其的影響細(xì)胞膜主要由蛋白質(zhì)，類脂（膽固醇、磷脂） 、糖類（糖蛋白、糖脂）構(gòu)成。細(xì)胞膜的一切功能就是在液態(tài)的脂類雙分子層和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行的。 鑲嵌在膜中的蛋白質(zhì)執(zhí)行許多重要的功能，如主動運(yùn)輸膜內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，接受激素、神經(jīng)遞質(zhì)以及一些藥物信號的受體、許多酶及特異性的抗原等都是鑲嵌蛋白質(zhì)。植物細(xì)胞的質(zhì)膜外，尚有層纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁，而動物細(xì)胞在其原生質(zhì)外，僅有一層薄的質(zhì)膜（即細(xì)胞膜）隨著組織化學(xué)及電鏡技術(shù)的進(jìn)展，有人認(rèn)為，

4、除了在細(xì)胞結(jié)合很緊密的部分外，所有的細(xì)胞膜均覆有一層粘多糖的細(xì)胞被（ cell coat ） ，一般動物的細(xì)胞被在電鏡下呈絨毛狀或細(xì)絲狀，其厚度為15nmi根據(jù)膜結(jié)構(gòu)的現(xiàn)代概念，在多數(shù)細(xì)胞中，細(xì)胞被無論在結(jié)構(gòu)上或功能上均為完整的細(xì)胞膜組成部分，而不是外加在細(xì)胞表面的附著物，它主要的成份是糖蛋白和糖脂。細(xì)胞被具有多種功能。它除作為細(xì)胞膜的保護(hù)層外，與免疫作用有關(guān)的膜抗原（包括血型抗原和組織相容性抗原等） 、各種特異性受體、一些與細(xì)胞表面活動有關(guān)的酶類等， 都存在于細(xì)胞被中。 此外， 在某些組織中， 細(xì)胞被起著濾器的作用，或者給細(xì)胞創(chuàng)造一種特殊的微環(huán)境。生物體內(nèi)的各種器官和組織中，有些細(xì)胞的細(xì)胞膜

5、區(qū)域由于與吸收、分泌、液體輸送以及其它的生理功能，而使它的形態(tài)發(fā)生改變。這些形態(tài)發(fā)生改變的區(qū)域，即細(xì)胞的表面分化，位于細(xì)胞的游離端或在細(xì)胞的基部，也可以在細(xì)胞相鄰之間的連接處。主要的細(xì)胞表面分化包括微絨毛、纖毛、細(xì)胞連接等。微絨毛是上皮細(xì)胞頂部的細(xì)胞質(zhì)突起，呈圓柱狀。在超薄切片中，根據(jù)切割面的不同，呈現(xiàn)不同的形態(tài)。微絨毛橫切面，為整齊排列的圓圈狀，經(jīng)過四氧化鋨固定后黑色的邊界為細(xì)胞質(zhì)膜， 而微絨毛的縱切面， 呈現(xiàn)為向外突起的長條狀。 還有一些是微絨毛的斜切面，表現(xiàn)為橢圓狀。纖毛是細(xì)胞質(zhì)表面突出形成的表面結(jié)構(gòu)。其外有細(xì)胞膜包圍，內(nèi)為細(xì)胞質(zhì)，其中有縱行的微管。纖毛細(xì)胞膜內(nèi)有9 組成對的二聯(lián)微管圍成

6、一圈，中間為兩根單獨(dú)的微管，呈9+2 結(jié)構(gòu)。而纖毛的斜切面或縱切面并不表現(xiàn)為這種典型的 9+2 結(jié)構(gòu)，而可能只有細(xì)胞膜包裹的染色較深的長帶狀。纖毛的主要功能是運(yùn)動。高等有機(jī)體的組織是由無數(shù)細(xì)胞構(gòu)成。這些細(xì)胞已失去了某些獨(dú)立性，而作為一個整體進(jìn)行活動。為了統(tǒng)一行動和促進(jìn)細(xì)胞之間必需的相互聯(lián)系，細(xì)胞表面區(qū)域已經(jīng)特化，以便進(jìn)行接觸。這些細(xì)胞表面的特化，稱為細(xì)胞間連接( intercellular junction) 。它對高等生物的發(fā)育和正常功能是不可缺少的。病毒入侵可導(dǎo)致細(xì)胞膜及其表面分化發(fā)生變化。在病毒入侵初期，病毒主要依靠識別細(xì)胞膜上的受體分子， 結(jié)合上去， 繼而改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)， 如病毒本身

7、囊膜與細(xì)胞膜融合；或?qū)е录?xì)胞膜內(nèi)陷，使細(xì)胞吞噬病毒等。在病毒復(fù)制、成熟過程中，病毒也可導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生變化，如引起細(xì)胞膜與相鄰細(xì)胞膜發(fā)生融合，這在黃病毒屬等病毒中是比較常見的現(xiàn)象；病毒在成熟后的釋放，可引起細(xì)胞膜發(fā)生出芽、或者細(xì)胞膜破裂等現(xiàn)象，從而釋放成熟的病毒粒子。 還有的病毒在入侵宿主細(xì)胞過程中可導(dǎo)致細(xì)胞膜表面形成病毒抗原層。病毒抗原層是一種厚約4nm的均質(zhì)性電子致密的結(jié)構(gòu)。覆蓋在細(xì)胞膜表面，與質(zhì)膜有明顯的界限(圖 圖 3 ) 。有時這些成分會大量增生，從而在感染的細(xì)胞表面形成盤曲的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)還能形成近似病毒輪廓的結(jié)構(gòu)(圖 圖 4 ) 。subsection 病毒引起的線粒體的變化 su

8、bsubsection 正常細(xì)胞的線粒體正常線粒體( mitochondrion )具有雙層單位膜結(jié)構(gòu)，是進(jìn)行生物氧化及提供生命活動所需能量的重要細(xì)胞器，普遍存在于真核生物的所有細(xì)胞中。線粒體在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量因不同細(xì)胞而有很大的差別。一般生理功能活躍的細(xì)胞中數(shù)量特別多；而生理功能不甚活躍的細(xì)胞中，則較少。線粒體外膜包裹在整個線粒體外面，內(nèi)膜向線粒體內(nèi)突起形成許多折疊，稱為線粒體嵴( christae mitochondriales ) 。外膜與內(nèi)膜之間的間隙稱為膜間隙或外室，此區(qū)電子密度很低，故淺亮。線粒體嵴與嵴之間的間隙稱為內(nèi)室。由于里面充滿基質(zhì)，故又稱基質(zhì)間隙，此區(qū)呈中等電子密度，基質(zhì)( m

9、itochondrial matrix )內(nèi)有一些直徑3050nm的電子的密度高的基質(zhì)顆粒，顆粒內(nèi)含有鈣離子、鎂離子等二價陽離子。嵴內(nèi)面的間隙稱嵴內(nèi)間隙，它與外室相連( 圖 圖 5) 。不同種類的的細(xì)胞線粒體形態(tài)上有較大差異，主要表現(xiàn)在線粒體整體的大小、形態(tài)，嵴的數(shù)量、形態(tài)和排列上。在大多數(shù)情況下，線粒體呈圓球狀或棒狀。典型的圓球狀線粒體可在肝細(xì)胞中找到，其直徑為0.5-5 而棒狀的線粒體直徑多為0.2 m以上，長可達(dá)2001分支狀的線粒體、輪狀線粒體、碟狀線粒體和杯狀線粒體也有報道。大部分細(xì)胞線粒體的嵴呈薄板狀。嵴的排列方向與線粒體長軸垂直，但也有斜方向或甚至接近于縱行排列的嵴。有一些細(xì)胞，

10、如腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞等的線粒體嵴大多為彎曲的小管狀，其切面呈小泡狀和管狀。一般氧化代謝率高的細(xì)胞中，線粒體的嵴比較多，基質(zhì)較少，而在代謝率低的細(xì)胞或一些植物細(xì)胞中，線粒體的嵴短而疏。線粒體是細(xì)胞內(nèi)生物氧化的主要場所。線粒體的外膜、內(nèi)膜、嵴、外室及內(nèi)室中都含有很多種酶類，其中大多數(shù)是和生物氧化有關(guān)的。三羧酸循環(huán)、呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化都在線粒體內(nèi)進(jìn)行。三羧酸循環(huán)是在線粒體的內(nèi)室基質(zhì)中進(jìn)行的，而氧化磷酸化過程是在線粒體內(nèi)膜上進(jìn)行的。一般認(rèn)為，位于內(nèi)膜上的基粒頭部相當(dāng)于ATP合成酶，是將釋放的能量轉(zhuǎn)給 ADP生成ATP的部分，與氧化和磷酸化的偶聯(lián)過程有關(guān)；基部含有整 套與電子傳遞過程有關(guān)的酶類。su

11、bsubsection 病毒引起的線粒體病變病毒感染宿主細(xì)胞后， 常見線粒體發(fā)生嵴內(nèi)腫脹， 基質(zhì)變稠， 成電子密度致密帶（圖 圖6） ，有些基質(zhì)呈致密板狀繞于線粒體周邊（ 圖 圖 7 ） ，還有一些嵴消失，線粒體成小泡，嚴(yán)重時線粒體膜破碎（ 圖 圖 8 ） 。有些病毒感染宿主細(xì)胞后，可引起線粒體膜內(nèi)陷，形成小泡狀結(jié)構(gòu)（ 圖 圖 9 ） ，研究表明這些結(jié)構(gòu)與病毒核酸的復(fù)制、蛋白合成等有關(guān)。很多病毒在形成過程中都會形成一定的病毒發(fā)生基質(zhì)，病毒的核酸復(fù)制，蛋白合成及其子代病毒粒子的組裝等過程都在這個區(qū)域完成， 這些步驟的完成往往需要大量的能量、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)龋圆《疽鹚拗骷?xì)胞內(nèi)線粒體的變化還經(jīng)?？梢?/p>

12、起包括在粒體數(shù)量以及分布等方面的變化 （ 圖 圖 10 ） 。subsection 病毒引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的變化 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum , ERR是由單位膜構(gòu)成的一種重要細(xì)胞器，它廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)，其形態(tài)和數(shù)量隨各細(xì)胞而異。在有些細(xì)胞（如各種類型的白細(xì)胞）中很簡單，只有少數(shù)小泡、小管狀；而在另一些細(xì)胞（如漿細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞）則十分復(fù)雜， 且占細(xì)胞質(zhì)的很大部分。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。subsubsection 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（rough endoplasmic reticulum , RER的表面附有核糖體，它可以是少數(shù)小的游離囊泡， 也

13、可以形成廣泛互相連接的囊泡， 但大多數(shù)為扁平狀、 管狀或泡狀，而且往往可見到核膜外層與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連續(xù)。 除哺乳動物的紅細(xì)胞外， 幾乎所有的真核細(xì)胞都含有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 在旺盛合成和分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞 （胰腺外分泌細(xì)胞、 漿細(xì)胞） 中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，而在幼稚的細(xì)胞或分化低、生長快的腫瘤細(xì)胞中， 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達(dá)， 且數(shù)量很少。由于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面附著核糖體， 而核糖體是合成蛋白質(zhì)的場所， 因此， 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能與蛋白質(zhì)合成及運(yùn)輸有關(guān)。所以，細(xì)胞中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多少，常?？勺鳛楣烙嫾?xì)胞分化程度和功能狀態(tài)的一個指標(biāo)。subsubsection 滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（smooth endoplasm

14、ic reticulum , SER表面沒有附著核糖體，通常呈分支小管或小泡的不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 多數(shù)分布在細(xì)胞的邊緣， 且常和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連。 滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于許多不同類型的細(xì)胞， 其功能也多樣，并不具有一種共同的功能。 如肝細(xì)胞、 分泌固醇類激素的細(xì)胞、 壁細(xì)胞、 小腸上皮細(xì)胞等都有發(fā)達(dá)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 但它們的功能卻是不同的。肝細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與解毒作用、膽汁分泌、脂類代謝、糖代謝等功能有關(guān)；分泌固醇類激素的細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與膽固醇的合成有關(guān)； 胃底腺壁細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能與鹽酸的分泌及滲透壓的調(diào)節(jié)有關(guān)； 心肌和骨骼肌細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)成復(fù)雜的肌槳網(wǎng)， 能釋放及獲取鈣離子，與肌細(xì)胞的收縮、

15、舒張有關(guān)?？傊?，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能是多種多樣的，它依細(xì)胞的類型而有很大的差別。subsubsection 病毒引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化 不管怎樣， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是與蛋白和其它物質(zhì)合成和運(yùn)輸?shù)牡胤?。因此?很多病毒入侵后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病變都比較明顯。 病毒在形成過程中， 需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成其蛋白， 而且需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸， 有些甚至干脆把內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為病毒蛋白組裝的場所。 這些都可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生嚴(yán)重的病變。如，SARSCoV入彳I Vero細(xì)胞后7小時不到，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)就發(fā)生膨脹，并可看到膨脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)有子代病毒粒子的組裝( 圖 圖 11) 。病變初期，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體顆粒雖仍可見到，但數(shù)量明顯減少，隨著

16、病變發(fā)生的程度進(jìn)一步增加，核糖體會脫落，同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹的程度也可增加， 呈空泡或囊狀結(jié)構(gòu)。 膨脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的物質(zhì)也會有不同的變化， 有些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹成囊狀結(jié)構(gòu)后，其內(nèi)的物質(zhì)減少而呈明顯的空泡(圖 圖 12) ，有些腔內(nèi)會有中等電子密度的蛋白性物質(zhì)存在( 圖 圖 13) 。subsection 病毒引起的細(xì)胞核的變化 subsubsection 正常的細(xì)胞核細(xì)胞核 ( nucleur ) 幾乎存在于所有的真核細(xì)胞中。 不同種類的細(xì)胞細(xì)胞核的數(shù)量有所不同，但結(jié)構(gòu)基本類似。細(xì)胞核由雙層核膜包裹，兩層核膜之間的間隙為核周間隙，寬度約1050nmi核膜上的核孔是由內(nèi)外層核膜融合形成。在一般超薄切片中，

17、當(dāng)切面通過核表面時，則見核孔呈圓形，彼此分離核孔復(fù)合體(nuclearpore complex)?？讖?0100nm核孔占核膜表面積的$5%15%$。一般來說，分化程度低及合成代謝旺盛的細(xì)胞，核孔數(shù)多；而分化程度高的細(xì)胞，核孔少，如在成熟的精子幾乎沒有核孔。核孔是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并可能具有開啟和關(guān)閉的作用。間期核中，異染色質(zhì)呈電子密度高的染色質(zhì)顆粒，聚集成大小不等的塊狀，不規(guī)則地分散在細(xì)胞核內(nèi)。而常染色質(zhì)呈淺亮區(qū)，分布于核中央，異染色質(zhì)之間及核仁內(nèi)外。常染色質(zhì)和異染色質(zhì)在結(jié)構(gòu)上是連續(xù)的， 不能截然分開。 二者的分布和比例亦非固定不變， 常因細(xì)胞的種類，生活周期及功能狀態(tài)的

18、不同而互相轉(zhuǎn)化。 一般來說， 分化程度高的細(xì)胞異染色質(zhì)多，如精子、 嗜中性多核細(xì)胞； 分化程度低的細(xì)胞和增殖速度快的細(xì)胞常染色質(zhì)所占的比例多， 如 胚胎細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。核仁著色深， 無界膜， 呈繩索狀交織的海綿結(jié)構(gòu)， 有時切片的角度也可能造成核仁在觀察時與大塊的異染色質(zhì)類似。 核仁不是固定的結(jié)構(gòu)， 它在細(xì)胞分裂時有周期性的變化。 在分裂前期核仁消失，到分裂后期，它又在核仁組織區(qū)( nucleolus organizer regions )內(nèi)重新出現(xiàn)。核仁的功能是合成核糖體核糖核酸(rRNA)的場所，故與蛋白質(zhì)的合成密切有關(guān)。核仁的大小和數(shù)量常反映細(xì)胞的生理狀態(tài)。在蛋白質(zhì)合成活躍的細(xì)胞，如胰腺

19、細(xì)胞，核仁發(fā)達(dá)，大而明顯， 或有多個核仁；在蛋白質(zhì)合成不活躍的細(xì)胞， 如肌細(xì)胞和精母細(xì)胞等， 核仁不明顯或小或無。核液( nuclear sap )又稱核基質(zhì)( nuclear matrix ) ，是一種無定形基質(zhì)，染色質(zhì)及核仁浸埋其中。核液含有可溶性RNA糖蛋白及其它物質(zhì)。細(xì)胞核是遺傳信息的物質(zhì)基石脫氧核糖核酸( DNA的復(fù)制及貯存場所，在一定的程度上控制著細(xì)胞的代謝、 生長、 分化和繁殖等的活動。 細(xì)胞核的化學(xué)成分主要是核酸和蛋白質(zhì)組成的核蛋白，蛋白質(zhì)主要是堿性蛋白質(zhì)，如組蛋白等；核酸多為DNA RNAW較少。此外,細(xì)胞核內(nèi)還含有酶、多糖及無機(jī)鹽等。subsubsection 病毒引起細(xì)胞

20、核的病變病毒入侵宿主細(xì)胞引起細(xì)胞核的變化主要表現(xiàn)在以下幾個方面：1，改變細(xì)胞核的大小、形態(tài)； 2，引起染色質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化；3 ，改變細(xì)胞核膜的結(jié)構(gòu)；有些病毒， 如昆蟲核多角體病毒， 入侵宿主細(xì)胞后可引起細(xì)胞核體積增大； 有些還可引起細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生變化。 核內(nèi)染色質(zhì)的變化主要體現(xiàn)在異染色質(zhì)的增加。 這是最常見的病毒感染后細(xì)胞核的變化，而且這些異染色質(zhì)常很不均一地分布，如昆蟲細(xì)胞感染核多角體病毒厚，異色質(zhì)不均一分布，形成了特殊的病毒發(fā)生基質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖 圖 14 ） 。還有些病毒感染后，可導(dǎo)致核膜發(fā)生一系列的變化。如 SARS CoV染Vero E6細(xì)胞后，可看到有些地方雙層核膜發(fā)生擴(kuò)張，形成一個囊泡

21、狀的結(jié)構(gòu)，這個囊泡狀結(jié)構(gòu)還可包裹病毒粒子（ 圖 圖 15） 。如Vero E6細(xì)胞感染皰疹病毒后，細(xì)胞核雙層核膜中間可形成一層電子密度較深的物質(zhì)（圖圖16） 。 病毒感染后期， 比較常見的細(xì)胞膜病變是細(xì)胞膜破裂不完整， 使細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)界限變得不清晰，最后細(xì)胞核碎裂。subsection 高爾基復(fù)合體 高爾基復(fù)合體（ Golgicomplex ） 由扁平囊、 大泡和小泡三部分組成。 扁平囊 （ Golgi saccule ）呈盤狀 （ 圖 圖 17） ， 由單位膜構(gòu)成， 囊的中部比較狹窄， 邊緣稍膨大， 通?？梢杂^察到 3-8個扁平囊互相平行疊在一起， 典型的為 9 層扁平囊疊在一起。 扁平囊

22、有凸面和凹面， 小泡直徑40-60nm,常見于扁平囊的凸面，大泡直徑約0.1-0.5科成常見于扁平囊的凹面。不同類型細(xì)胞的高爾基復(fù)合體的數(shù)量、 位置和分布是不同的。 在排列有極性的柱狀及立方上皮細(xì)胞內(nèi)， 一般位于核及游離面之間；在肝細(xì)胞中，則分為若干堆分散在細(xì)胞質(zhì)中；在神經(jīng)細(xì)胞中， 則包圍在整個細(xì)胞核的周圍。 高爾基復(fù)合體的大小和數(shù)量也因不同的細(xì)胞類型而差別很大。例如，神經(jīng)細(xì)胞和胰腺細(xì)胞的高爾基復(fù)合體較大，肌細(xì)胞內(nèi)的則小。此外，在同一類細(xì)胞中也可由于不同生理狀態(tài)而有所改變： 細(xì)胞處在發(fā)育時期或機(jī)能旺盛時多； 細(xì)胞機(jī)能低落或未分化時少；細(xì)胞處于衰老過chsh 小、少或消失。病毒感染細(xì)胞后， 初期

23、可引起高爾基體囊泡增生， 隨后， 可導(dǎo)致那側(cè)高爾基扁囊膨脹成大囊泡，病毒粒子可包含到這些囊泡中（ 圖 圖 18）subsection 核糖體及其病毒引起的變化 核糖體（ribosome ）大小約15X25nm,呈現(xiàn)為染色較深的小顆粒。除成熟紅細(xì)胞外，其它各種細(xì)胞都存在有這種細(xì)胞器， 它是合成蛋白質(zhì)的部位。 它是由核糖核酸和蛋白質(zhì)組成。 核糖體在細(xì)胞內(nèi)的分布有兩種形式， 即附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面上的稱為附著核糖體， 游離在細(xì)胞質(zhì)中的稱游離核糖體。 附著核糖體是以其亞大單位附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上， 它所合成的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外面。 游離核糖體所合成的蛋白質(zhì)主要為內(nèi)源性蛋白質(zhì)或可溶性蛋白質(zhì)， 這些蛋白質(zhì)主要是供

24、細(xì)胞本身增殖、 代謝所需， 游離核蛋白體也合成某些特殊功能的蛋白質(zhì)如血紅蛋白、肌動蛋白和肌球蛋白等。在一些分泌細(xì)胞中如分泌胰液的胰腺細(xì)胞和分泌抗體的漿細(xì)胞中，大部分核糖體是附在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的；而在未分化細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等， 則多見游離核糖體。 核糖體由mRNAE單個的核糖體串連一起，成為能合成蛋白質(zhì)的功能單位，稱為多聚核糖體。附著的或游離的核糖體都有呈多聚核糖體的型式，在電鏡下呈針簇狀，菊花狀或臉珠狀的長鏈，或以平螺紋的排列形式附著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面， 或游離于胞質(zhì)中。 多聚核糖體所集結(jié)的核糖體的數(shù)目與有關(guān)的 mRNA勺長度有關(guān)，也和所合成的有關(guān)蛋白質(zhì)的分子大小有關(guān)，小的僅幾個核糖體連結(jié)在一起，多的則可幾

25、十個核糖體。病毒感染時， 可造成宿主細(xì)胞的核糖體大量合成病毒生命過程中所需的蛋白。 病毒感染初期往往可造成宿主細(xì)胞的各種形態(tài)的核糖體數(shù)量明顯增加（ 圖 圖 19） ，而在后期，病毒感染又可引起核糖體從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫落。subsection 其它細(xì)胞器及其病毒引起的變化 溶酶體（lysosome）是由單位膜包圍而成的囊狀結(jié)構(gòu)，直徑約 0.25-0.5nt在電鏡下，溶酶體的形態(tài)很多， 往往憑一般常規(guī)電鏡技術(shù)方法不易區(qū)別， 需用電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)， 特別是顯示酸性磷酸酶的方法。 溶酶體普遍存在于哺乳動物各種細(xì)胞中， 不過數(shù)目不多。 在植物細(xì)胞中， 也發(fā)現(xiàn)類似溶酶體的細(xì)胞器， 但在細(xì)菌中沒有發(fā)現(xiàn)溶酶體。

26、 根據(jù)溶酶體消化活動的機(jī)能狀態(tài)以及是否含有“底物” ，將其分為初級溶酶體和次級溶酶體兩大類。病毒感染的宿主細(xì)胞有時可見溶酶體的增生。細(xì)胞內(nèi)還有其它的細(xì)胞器，如微體、 微管微絲、 脂肪滴等。 病毒有時也會引起這些細(xì)胞器的變化，主要體現(xiàn)在數(shù)量上的改變。subsection 病毒感染后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的特殊結(jié)構(gòu)病毒感染宿主細(xì)胞后，除了能造成細(xì)胞內(nèi)原有細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、數(shù)量、 形態(tài)等發(fā)生改變外， 還可在宿主細(xì)胞內(nèi)形成特殊的結(jié)構(gòu)。主要有：病毒發(fā)生基質(zhì)、包含體、多角體、微管、病毒伴隨顆粒等。如昆蟲核多角體病毒在病毒形成過程中， 能造成細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)形成網(wǎng)狀的病毒發(fā)生基質(zhì)（圖 圖 14） ，隨著病毒發(fā)生的繼續(xù)，最后還

27、在核內(nèi)形成了多角體，病毒成熟后，進(jìn)入多角體內(nèi) （ 圖 圖 20） 。 出血熱（ EHF） 病毒可造成細(xì)胞內(nèi)形成大片的絲狀的包含體（ 圖 圖 19） 。白紋伊蚊被濃核病毒感染后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可出現(xiàn)晶格樣排列的包含體（ 圖 圖 21） 。section 病毒在細(xì)胞中的生活周期 電子顯微學(xué)技術(shù)是揭示病毒入侵機(jī)理， 闡明病毒的發(fā)育循環(huán)， 研究感染宿主病理學(xué)的一個重要方法。 常規(guī)的超薄切片技術(shù)能夠?yàn)椴《镜娜肭帧?復(fù)制、 組裝以及宿主病變狀況提供最直觀的形態(tài)學(xué)證據(jù)， 并與其它生化、 分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果互相佐證， 解釋病毒與細(xì)胞的相互作用機(jī)理。 免疫學(xué)技術(shù)、 核酸分子雜交技術(shù)與電子顯微學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的

28、免疫電鏡技術(shù)和電鏡原位雜交技術(shù)使我們能在觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的同時， 對病毒的蛋白和核酸進(jìn)行精確定位， 而且通過對不同時期的感染細(xì)胞進(jìn)行跟蹤觀察， 確定這些分子在細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)分布過程，從而有效地闡明病毒增殖機(jī)制。subsection 病毒的入侵 電鏡作為一種研究病毒的強(qiáng)有力的工具，在病毒入侵方面可以帶來兩方面的信息：病毒與受體的結(jié)合狀況和病毒入侵細(xì)胞的方式。 病毒與受體的結(jié)合狀況包括結(jié)合部位， 結(jié)合后病毒衣殼的變化情況和結(jié)合后受體的變化情況，這對了解病毒和防治病毒是非常重要的。這一方面的研究主要利用免疫電鏡和冷凍電鏡等技術(shù)。病毒入侵細(xì)胞的方式有核酸注入式(如 T 噬菌體等) 、膜融合式、內(nèi)吞式等。

29、這些方式最初都是由電鏡觀察超薄切片的研究中首先發(fā)現(xiàn)的。 此后， 其它方法也應(yīng)用到入侵方式的研究中，但電鏡以其直觀的優(yōu)點(diǎn)，提供直接的證據(jù)。核酸注入方式入侵細(xì)胞時， 病毒衣殼并不進(jìn)入宿主細(xì)胞， 如噬菌體入侵宿主細(xì)胞 ( 圖 圖 22)時，首先其尾巴識別宿主細(xì)胞受體， 并通過其尾巴附著細(xì)胞上，然后尾巴穿過宿主細(xì)胞，或相關(guān)蛋白在宿主細(xì)胞膜上形成一通道， 使衣殼內(nèi)的核酸注入宿主細(xì)胞， 然后核酸在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、表達(dá)等一系列生命活動。膜融合的方式主要發(fā)生在有囊膜的病毒中，病毒入侵細(xì)胞時，其囊膜與細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生融合，時囊膜內(nèi)的核衣殼進(jìn)入宿主細(xì)胞， 然后在宿主細(xì)胞內(nèi)完成脫衣殼、 核酸復(fù)制等過程， 完成入 侵

30、的過程。如，SARS冠狀病毒(SARS coronavirus , SARSCoV入侵 Vero E6細(xì)胞的方式。R CoV 屬于冠狀病毒科(Coronaviridae ) ，冠狀病毒屬( Coronavirus ) 。它是一種正義單鏈RNA病毒。取感染 SARS CoV同時期的Vero E6細(xì)胞進(jìn)行大量超薄切片觀察，在感染 早期的細(xì)胞中觀察到 SARSCoV入侵細(xì)胞的過程。圖refappVirusEntryb 可以看到，SARS CoV首先吸附在Vero E6細(xì)胞表面，病毒的囊膜與宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，隨后核衣殼進(jìn)入 細(xì)胞。圖中還可看到剛通過細(xì)胞膜的SARS CoV勺核衣殼邊界模糊，沒有明顯

31、囊膜結(jié)構(gòu)，整個粒子的電子密度均勻。說明SARS CoV!入細(xì)胞后，已去除了外面的囊膜結(jié)構(gòu)，只有病毒的核衣殼進(jìn)入了宿主細(xì)胞。經(jīng)大量觀察，沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)吞后膜融合進(jìn)入的病毒粒子。而內(nèi)吞方式是病毒識別宿主細(xì)胞后， 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成內(nèi)吞泡，將病毒吞噬， 病毒 由此進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程。這種方式可以發(fā)生在有膜或無膜的病毒種類中。正如以上所說， 病毒入侵細(xì)胞的方式， 很多都是通過電鏡直接觀察到的。 通過電鏡還可為分子生物學(xué)和其它生物學(xué)研究成果提供依據(jù)。 如使用電鏡觀察家蠶質(zhì)多角體病毒 ( Bombyxmori cypovirus1 ， BmCPV-1) 入 侵 家 蠶 中 腸 柱 狀 細(xì) 胞 的 方 式

32、 。 BmCPV-1 是 呼 腸 孤 病 毒 科 (Reoviridae )，質(zhì)多角體病毒屬(Cypovirus )的代表種。它是一種無囊膜的雙鏈RNA病毒，其入侵方式存在爭議。 1972 年小林正彥認(rèn)為它以一種類似于T 噬菌體的注入式入侵方式進(jìn)入細(xì)胞， 病毒粒子的突起前端吸附細(xì)胞表面， 突起埋進(jìn)細(xì)胞表層， 從衣殼頂點(diǎn)釋放纖維狀的病毒核酸到細(xì)胞的內(nèi)并進(jìn)行復(fù)制， 釋放出髓核物質(zhì)的空心的病毒衣殼仍留在細(xì)胞外邊。 然而 分子生物學(xué)和冷凍電子顯微技術(shù)的研究結(jié)果表明：BmCPVJ RNAm合酶是病毒復(fù)制所必需的，而RNA聚合酶處于病毒衣殼突起的內(nèi)壁上，如果病毒衣殼仍然留在細(xì)胞外邊，那么RNAm合酶也就不

33、會進(jìn)入細(xì)胞，那么病毒的復(fù)制將無法進(jìn)行，顯然這種注入式的入侵方式不適合于 BmCPV勺情況。為了弄清 BmCPV勺入侵方式，活體感染二齡起蠶，添毒后在不同時間大量取 樣、制作超薄切片和電鏡觀察，清楚地直接觀察到BmCP謾以整個病毒粒子穿過細(xì)胞膜的形式入侵中腸上皮細(xì)胞，見圖 refappVirusEntrya ，這種穿膜入侵方式是首次報導(dǎo)的。 beginfigurehtbp centering includegraphicstotalheight=8cmappVirusEntrycaption(a) 完整的BmCPVf毒粒子通過直接穿膜方式進(jìn)入柱狀細(xì)胞微絨毛(橫切面) 。右 上方插圖為病毒穿絨毛膜

34、的局部放大圖。Mw.微絨毛。Bar=100nm。(b)SARS Co隊(duì)侵細(xì)胞過程。SARS CoV(黑色箭頭指示)吸附到細(xì)胞表面，病毒囊膜與 Vero E6 細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，釋放出病毒核衣殼，白箭頭指示釋放到細(xì)胞質(zhì)中的模糊的病毒核衣 殼。 Bar=100nm。 citeTan2003labelappVirusEntryendfiguresubsection 病毒的繁殖病毒感染細(xì)胞首先是識別、 吸附細(xì)胞， 然后核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞開始病毒的復(fù)制過程。 病毒的繁殖包括病毒核酸的復(fù)制、 病毒蛋白的合成、 病毒粒子的組裝以及釋放。 電子顯微學(xué)技術(shù) （包括超薄切片， 免疫電鏡技術(shù)以及電鏡原位雜交技術(shù)） 的

35、應(yīng)用， 給我們提供了這些重要環(huán)節(jié)的形態(tài)表征以及發(fā)生的時間和空間信息。病毒核酸復(fù)制的過程， 主要可以通過電鏡原位雜交技術(shù)進(jìn)行研究。 如研究家蠶質(zhì)多角體病毒（BmCPV。為了檢測病毒核酸的復(fù)制場所和復(fù)制開始的時間，可以根據(jù)雙鏈 RNAW毒在復(fù)制過程中先產(chǎn)生單鏈正鏈 RNA再以此鏈為模板合成負(fù)鏈從而形成雙鏈RNA勺特性，采用電鏡原位雜交技術(shù)，檢測柱狀細(xì)胞內(nèi)BmCPV勺核酸復(fù)制中間體-正鏈RNA的分布，以確定病毒核 酸的復(fù)制場所。從第6小時樣品開始，檢測到陽性雜交結(jié)果， 顯示病毒正鏈 RNAI先出現(xiàn)在 中腸柱狀細(xì)胞的核內(nèi)，并且相對集中分布在核仁上，核基質(zhì)中也有分布，但數(shù)量較少。第12小時（見圖refa

36、ppBmCPVRNA）,病毒正鏈RNA大量富積在核仁上，部分開始向核膜移動， 雙層核膜間隙中觀察到病毒正鏈RNA核外也觀察到少量病毒正鏈RNA顯示病毒正鏈 RNA在細(xì)胞核仁上合成后通過核膜運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。 柱狀細(xì)胞頂端胞質(zhì)中觀察到少量病毒正鏈RNA出現(xiàn)在核糖體上。說明病毒正鏈RNA作為mRNA旨導(dǎo)蛋白的合成。第 24小時，病毒正鏈 RNA均勻分散在胞質(zhì)的一個小區(qū)域內(nèi)， 該區(qū)域內(nèi)無細(xì)胞器， 可能是病毒發(fā)生基質(zhì)將要形成的地方。另外，有些區(qū)域病毒發(fā)生基質(zhì)已形成，病毒正鏈RNAH現(xiàn)在該基質(zhì)的邊緣，暗示病毒單鏈核酸運(yùn)到基質(zhì)中與病毒蛋白裝配。 出現(xiàn)在病毒發(fā)生基質(zhì)中的子代病毒， 其中未成熟的病毒顆粒被標(biāo)記，

37、暗示病毒顆粒裝配中存在單鏈基因組階段， 但該階段可能非常短暫， 因多數(shù)病毒顆粒都未被標(biāo)記，顯示其內(nèi)的核酸已經(jīng)為雙鏈。推測單鏈正鏈RNA與病毒蛋白形成病毒粒子前 體后，立即在病毒粒子前體內(nèi)合成負(fù)鏈從而形成雙鏈RNA基因組。第48小時，包埋在多角體內(nèi)的成熟病毒粒子均未標(biāo)記上膠體金，這是因?yàn)槠浜怂崾请p鏈RNA式。beginfigurehtbp centeringincludegraphicstotalheight=6cmappBmCPVRNAcaption感染BmCPVI 12小時柱狀細(xì)胞核內(nèi)的病毒正鏈RNA開始向細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸。大量病毒正鏈RNA（箭頭指示）富積在核仁（Nu）上，部分開始向核膜移動，雙

38、層核膜間隙觀察到病 毒正鏈RNA （三角形指示），有的核外觀察到少量病毒正鏈RNA（鉆石箭頭指示），顯然病毒正鏈RNA核仁上合成后開始通過核膜運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。Bar=100nm。labelappBmCPVRNAendfigure病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)和病毒粒子的組裝和運(yùn)輸?shù)冗^程， 可以通過免疫電鏡進(jìn)行研究。 例如我們 使用電鏡技術(shù)研究 BmCPVfe家蠶中腸柱狀細(xì)胞中的增殖過程：首先通過觀察不同感染時期的家蠶中腸柱狀細(xì)胞的常規(guī)超薄切片， 發(fā)現(xiàn)在感染后第3 小時， 才觀察到大量親代病毒粒子進(jìn)入柱狀細(xì)胞內(nèi)， 除分布在細(xì)胞質(zhì)，還出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)。在雙層核膜間隙、核基質(zhì)內(nèi)均觀察到病毒粒子， 暗示了病毒穿過核膜進(jìn)入

39、到核內(nèi)。 親代病毒似乎在進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)之后， 才降解消失。而隨后的612小時都未觀察到病毒顆粒。這說明從病毒侵入細(xì)胞，到產(chǎn)生子代病毒之間存在一段隱蔽期。在感染第 24 小時，中腸柱狀細(xì)胞頂端細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了病毒發(fā)生基質(zhì)和子代病毒 （見圖 refappBmCPVprotein ） ， 免疫標(biāo)記結(jié)果表明病毒蛋白集中分布在病毒發(fā)生基質(zhì)內(nèi)及其周圍的核糖體上?；|(zhì)的外層區(qū)免疫標(biāo)記較多，基質(zhì)內(nèi)的病毒衣殼也被標(biāo)記上。這暗示了病毒蛋白從核糖體合成出來后集中到病毒發(fā)生基質(zhì)中，隨后組裝到病毒的衣殼上。beginfigurehtbpcenteringincludegraphicstotalheight=6cmappBm

40、CPVproteincaption感染BmCPVl 24小時的中腸樣品的免疫標(biāo)記。膠體金（箭頭指示）出現(xiàn)在病毒發(fā)生基質(zhì)內(nèi)及其周圍的核糖體上。 病毒發(fā)生基質(zhì)（ VS） 的微網(wǎng)結(jié)構(gòu)中和病毒粒子衣殼上出現(xiàn)膠體金。 Bar=100nm。 labelappBmCPVproteinendfigure第 48 小時，多角體出現(xiàn)在病毒發(fā)生基質(zhì)中，多角體內(nèi)的病毒粒子也被標(biāo)記上，柱狀細(xì)胞基部 出 現(xiàn) 的 病 毒 發(fā) 生 基 質(zhì) 和 病 毒 粒 子 也 被 標(biāo) 記 。 在 感 染 的 第 48 小 時 （ 見 圖 refappBmCPVassembly） ， 大量成熟或未成熟病毒粒子被包埋在多角體蛋白中形成多角體。

41、柱狀細(xì)胞的基部也開始出現(xiàn)病毒粒子和病毒發(fā)生基質(zhì)。為了弄清楚BmCPVt白的合成動態(tài)，可以應(yīng)用了免疫電鏡技術(shù)來檢測在不同感染時期內(nèi)， 病毒蛋白在柱狀細(xì)胞內(nèi)的分布。 發(fā)現(xiàn)在感染第 6 小時樣品免疫標(biāo)記結(jié)果為陰性， 即此時間段內(nèi)未檢測到病毒蛋白， 病毒蛋白的合成可能還未開始。而感染的第 12 小時樣品檢測到弱陽性免疫反應(yīng)結(jié)果，在柱狀細(xì)胞頂端的胞質(zhì)內(nèi)以及核糖體上出現(xiàn)少量被標(biāo)記的病毒蛋白， 但此時未觀察到病毒發(fā)生基質(zhì)和可辨的病毒顆粒，顯然病毒的組裝還未開始。beginfigurehtbpcenteringincludegraphicstotalheight=6cmappBmCPVassemblycapt

42、ionBmCPV 病毒粒子的不同發(fā)育階段。感染48 小時，病毒成熟過程中觀察到有突起的空病毒（）（僅有衣殼）、部分填充的病毒（）和完整的病毒（）同時存在的情況，代表病毒發(fā)育的不同階段。Bar=100nm。labelappBmCPVassemblyendfigure subsection 病毒的釋放 成熟病毒粒子的釋放有多種途徑。 很多病毒感染細(xì)胞后， 在宿主細(xì)胞內(nèi)大量繁殖可導(dǎo)致細(xì)胞破裂，病毒釋放出體外。也有很多病毒，尤其是戴囊膜的病毒，則通過細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸系統(tǒng)，將病毒運(yùn)輸至細(xì)胞膜，而后，病毒通過出芽方式，帶上囊膜的同時，釋放到細(xì)胞外。此外，還有病毒粒子通過胞吐方式釋放到細(xì)胞外面。 這些過程都可通過

43、電鏡直觀地觀察到。 如， SARSCoV的釋放過程（圖'圖23）。section 病毒的電子顯微學(xué)鑒定 目前最常用的病毒性疾病的鑒定技術(shù)一般包括： 電子顯微學(xué)技術(shù)、 免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)。 這幾種方法各有其優(yōu)勢： 當(dāng)有明確的懷疑目標(biāo)病原，并有確定的抗體等存在時， 無需太多的儀器設(shè)備， 只需一些試劑盒和常規(guī)的分子生物學(xué)和免疫學(xué)儀器， 就可利用分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行快捷簡便的診斷。 而病毒的電子顯微學(xué)診斷和鑒定技術(shù)更多地應(yīng)用于疑難病例、其它方法難以解決以及新病毒、新病原出現(xiàn)時的鑒定。事實(shí)上，在PC將現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫學(xué)手段建立之前，許多病毒都是由電鏡所發(fā)現(xiàn)和確定的。不管何種技術(shù)

44、， 病原的確診都需要符合柯赫氏法則。 在柯赫氏法則中的第一條， 電鏡可以對病原的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行很直接的觀察， 可以初步確定是否每個病體中具有同樣的病原。 在柯赫氏法則的其余三條中， 電子顯微學(xué)對分離的病原的形態(tài)特征和其引起的超微結(jié)構(gòu)變化的描述都起到了很重要的作用。 可見， 電子顯微學(xué)技術(shù)能直接觀察病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、 數(shù)量以及病毒侵染寄主后引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化等的特點(diǎn)， 很多時候使人們能馬上憑這些信息即可判斷這是什么病毒以及它是否是病原體等問題。 因此也使它稱為病毒性疾病診斷和鑒定中最有用的工具之一。 電鏡在不但在以前的病毒診斷和鑒定中曾起著非常重要的作用， 現(xiàn)在和將來， 它仍是不可替代的最重要的病

45、毒，尤其新病毒的診斷和鑒定的工具。目前， 在病毒的診斷和鑒定中經(jīng)常用的電子顯微學(xué)方法包括負(fù)染色法和超薄切片法， 結(jié)合免疫電鏡技術(shù)還可以判斷病毒的血清學(xué)關(guān)系， 研究病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制裝配等。 除此之外， 冷凍電鏡單顆粒技術(shù)等所獲得的高分辯結(jié)構(gòu)也可作為病毒鑒定的依據(jù)。 這些技術(shù)的詳細(xì)技術(shù)要點(diǎn)見本書的其它章節(jié)。subsection 病毒電子顯微學(xué)鑒定的依據(jù)病毒的電子顯微學(xué)診斷鑒定的依據(jù)主要包括： 病毒的形態(tài)學(xué)特征依據(jù)、 病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)的依據(jù)， 也就是病毒與宿主細(xì)胞的關(guān)系和引起的病變； 免疫電鏡的依據(jù)， 即電鏡下觀察特異抗原抗體復(fù)合物聚合物和標(biāo)記的抗原抗體物質(zhì)。subsubsection 形態(tài)學(xué)特征依

46、據(jù)主要包括 beginenumerateitem 病毒的大??；item病毒形狀，如球狀，還是絲狀、彈狀、桿狀等；item 有沒有突起，突起的長度、分布情況、突起的形態(tài)和位置等；item 有沒有囊膜，囊膜的形態(tài)，囊膜表面有沒有纖突，纖突的形狀、長度和間距等；item 病毒衣殼的對稱性，是立體對稱還是螺旋對稱、是單層衣殼還是多層衣殼、殼粒的數(shù)目和排列方式等。endenumerate根據(jù)這些特征，在植物病毒的鑒定中，花椰菜花葉病毒科(caulimoviridae) 、雙生病毒科(Geminiviridae) 、 呼腸孤病毒科 (Reoviridae) 、 彈狀病毒科 (Rhabdoviridae)

47、、 苜蓿花葉病 毒屬 (Alfamovirus) 、歐爾密病毒屬 (Ourmiavirus) 、油橄欖病毒屬 (Oleavirus) 等都具有特 殊典型的形態(tài)學(xué)特征， 通過負(fù)染色即可在電鏡下確定其歸屬。 對于煙草花葉病毒等螺旋對稱的桿狀病毒和馬鈴薯Y 病毒等線狀病毒， 可以直接用病變組織汁液的負(fù)染色觀察， 依據(jù)病毒粒子的大小和彎曲程度進(jìn)行鑒定， 一般可判斷到科或?qū)佟?而細(xì)小的球狀病毒， 不易用病變組織的粗汁液直接進(jìn)行電鏡觀察， 大多需要將病毒進(jìn)行提純后方可進(jìn)行電鏡鑒定。 雖然球狀病毒形態(tài)相似， 但還是可以根據(jù)病毒粒子的外形進(jìn)行初步判斷。 人和動物病毒同樣可以根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定： 如引起人腹

48、瀉的病原就利用電鏡下病毒的形態(tài)特征很容易發(fā)現(xiàn)， 引起人腹瀉的病毒有冠狀病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒和腺病毒。subsubsection 病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)的依據(jù)病毒在細(xì)胞內(nèi)的排列、 復(fù)制、 組裝和成熟的過程以及某些包膜病毒的芽生部位和病毒包涵體（病毒基質(zhì)） 的形態(tài)特征等。 大多數(shù)有囊膜病毒都有一個脂質(zhì)雙層包膜和相關(guān)的蛋白， 在相應(yīng)的細(xì)胞膜上發(fā)芽成熟， 有的病毒在細(xì)胞質(zhì)膜上發(fā)芽， 有的則在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、 核膜或高爾基扁囊和囊泡膜上發(fā)芽。 病毒在形態(tài)發(fā)生過程中形成的包涵體的形態(tài)特征同樣也是病毒診斷鑒定的重要依據(jù)：現(xiàn)有資料表明，在植物病毒中至少有19 個病毒科或?qū)俚某蓡T產(chǎn)生不同的包涵體， 可以與其它科或?qū)賲^(qū)分

49、開來。 最典型的如馬鈴薯Y 病毒科的柱狀包涵體，煙草花葉病毒屬的結(jié)晶體和X-體、花椰菜花葉病毒的病毒基質(zhì)等。有些細(xì)胞病理變化特征還有助于區(qū)別病毒的種甚至株系，如番茄花葉病毒在細(xì)胞內(nèi)形成角層狀聚集體，不產(chǎn)生 X-體，與同屬的TMV?有明顯區(qū)別。subsubsection 細(xì)胞病變依據(jù)不同科或?qū)俚牟《疽鸺?xì)胞發(fā)生病變的程度、 特征也是很不一致的。 這些特性有時從光學(xué)顯微鏡就可觀察到。電鏡下，一些細(xì)微的特征更能幫助人們診斷。如人們在尋找SARSW原時,先后分別在病人身上發(fā)現(xiàn)了副粘病毒， 皰疹病毒， 呼腸孤病毒和冠狀病毒等， 這些病毒所引起的細(xì)胞病變就非常不同。冠狀病毒引起細(xì)胞病變一個非常典型的特征是

50、使細(xì)胞嚴(yán)重空泡化，而皰疹病毒入侵細(xì)胞后，細(xì)胞變空的病變并不嚴(yán)重。subsubsection 免疫電鏡學(xué)依據(jù)電鏡下觀察聚集成堆的抗原抗體復(fù)合物或標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物是病毒診斷鑒定非常準(zhǔn)確和有效的工具。 1973 年，美國學(xué)者Feinstone 等就是首次以免疫電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)了甲型肝炎病毒顆粒。 他們以患者急性期糞便提取液與恢復(fù)期病人血清混勻孵育， 然后對其沉淀物的懸浮液進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大量被抗體凝集的2732nm的病毒顆粒，病毒呈二十面體對稱，無囊膜，免疫電鏡下病毒顆粒表面可見放射狀和絨毛狀抗體橋。subsection 病毒電子顯微學(xué)鑒定的特點(diǎn) 病毒的電子顯微學(xué)診斷的快速和簡便是其它手段難以達(dá)到

51、的。如通過對患病個體的水樣糞便、口腔或鼻咽拭子、皮膚的水皰液以及各種臟器、組織進(jìn)行簡單的處理， 數(shù)分鐘或十多分鐘即可做出早期的診斷。這就是電鏡診斷方法至今仍被廣泛采用的原因所在。一般情況下，在電鏡下根據(jù)病毒的形態(tài)學(xué)特征可以鑒定到病毒的科甚至種。 這對于那些需要復(fù)雜培養(yǎng)條件和尚不能在體外細(xì)胞培養(yǎng)中增殖的病毒尤其有用。 因此， 病毒的電子顯微學(xué)診斷的快速和簡便是其第一個特點(diǎn)。通過電鏡的診斷鑒定，可發(fā)現(xiàn)新的病毒致病因子是病毒電子顯微學(xué)診斷的第二個重要特點(diǎn)。很多實(shí)例證明電鏡是第一個從病人臨床樣品中檢出病毒顆粒， 作出病原鑒定。 如乙型肝炎（ 肝DNA病毒科的乙型肝炎病毒），嬰幼兒腹瀉（呼腸孤病毒科的輪

52、狀病毒）和流行性出血熱病毒（ 布尼安病毒科的漢坦病毒） 等。 在新的疾病， 尤其新的病毒性疾病發(fā)生和流行時， 電子顯微學(xué)技術(shù)是尋找未知病原，鑒定病原最重要的診斷鑒定技術(shù)。第三個重要特點(diǎn)是對一些疑難病例， 兩種甚至多種病毒的合并感染或合并其它病原入侵等的診斷時， 電子顯微學(xué)診斷相對直觀、 可靠特點(diǎn)使其有特別的優(yōu)勢。 雖然臨床上普遍使用免疫學(xué)、 分子生物學(xué)等手段進(jìn)行疾病的診斷。 但眾所周知， 目前人和各種養(yǎng)殖動物在各個階段都普遍接種各種疫苗， 很多病毒的抗原具有交叉反應(yīng)， 這給單純利用血清學(xué)技術(shù)診斷帶來混亂，使單純檢測抗體的方法來診斷病毒性疾病難以進(jìn)行。而且對于一種未知具體病原體的的疾病，由于沒有

53、確定的抗體，也無法用免疫學(xué)手段進(jìn)行診斷。分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要利用PCR RT- PCR等技術(shù)，對于已知具體病毒的疾病的確定是比較快速的方法。但對于某種突發(fā)性疾病， 又沒有明確的病原時， 這種方法的診斷就顯得有點(diǎn)大海撈針了。 因?yàn)闆]有明確的目標(biāo)時， 不能選用特異性引物， 只能用隨機(jī)引物進(jìn)行檢測， 此時獲得擴(kuò)增的核酸片段的數(shù)量就很巨大， 這使單一的分子生物學(xué)診斷也顯得比較困難。 而且，生物體往往非常復(fù)雜， 有時很多的微生物存在在生物體內(nèi)，但它們并非是病原體，從原理上來說，PCR方法只能確定某種病毒的存在，但不能判斷它是否是病原體。另外，很多實(shí)驗(yàn)表明免疫學(xué)及PCR僉測都可出現(xiàn)程度不等的假陰性或假陽

54、性， 在這些用一般的光學(xué)顯微鏡、 血清學(xué)和分子生物學(xué)等方法感 到無能為力時， 尤其對未知病毒或者那些不易被發(fā)現(xiàn)的病毒， 傳統(tǒng)的電鏡技術(shù)往往起著舉足 輕重的作用。 許多病毒僅僅根據(jù)其微細(xì)結(jié)構(gòu)特征就足以用電鏡進(jìn)行鑒別， 有的病毒在它的致 病作用遠(yuǎn)未搞清以前就被電鏡發(fā)現(xiàn)了，這種情況無論在體外或體內(nèi)都有不少先例可借鑒。以下幾個例子可以說明電子顯微學(xué)在發(fā)現(xiàn)新的病毒致病因子以及疑難病例中的應(yīng)用。subsection 病毒電子顯微學(xué)診斷鑒定的實(shí)例 subsubsection 電子顯微學(xué)診斷鑒定技術(shù)在新出現(xiàn)的疾病中的應(yīng)用 在2002年底爆發(fā)的SAR砥情的病原尋找過程中，不同國家、地區(qū)都不約而同地用到了電子顯微

55、學(xué)技術(shù)，也有很多這方面的報道。在報道非典型性肺炎爆發(fā)后，一星期內(nèi)，2003 年 2 月 18 日我國研究人員通過電鏡觀察，在兩份死于本次肺炎病人的尸檢肺標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)了典型的衣原體的包涵體， 而肺細(xì)胞漿內(nèi)衣原體顆粒十分典型。雖然現(xiàn)在看來這個論斷并不正確，但它畢竟拉開了尋找 SARSW原的序幕，也揭開了 SARSW秘面紗白一角。3月18日德國用電鏡在咽拭子標(biāo)本中觀察到副粘病毒。3月 19 日新加坡從病人呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)副粘病毒顆粒并使用香港中文大學(xué)的 Metapneumo 病毒擴(kuò)增引物獲得較微弱的病毒基因擴(kuò)增產(chǎn)物。 3 月 20 日香港中文大學(xué)在電鏡下發(fā)現(xiàn)副粘 病毒顆粒，同日國際上首先發(fā)現(xiàn)Metapneumo病毒的荷蘭鹿特丹實(shí)驗(yàn)室檢測到副粘病毒，但是Metapneumo病毒基因擴(kuò)增為陰性。3月21日香港中文大學(xué)在猴腎細(xì)胞培養(yǎng)物中分離到病 毒，隨即研制了相應(yīng)的血清學(xué)診斷試劑。香港大學(xué) QueenMary 醫(yī)院微生物病理系的 Peiris 等是最早報道應(yīng)用負(fù)染和超薄切片電鏡技術(shù)從SARS思者生前肺活檢組織以及鼻咽部吸出物的病毒分離培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的。 美國從用泰國病人標(biāo)本感染培養(yǎng)細(xì)胞， 引起細(xì)胞病變 的產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒（70-100nm）,并在同一份標(biāo)本獲得