熒光素酶常見問題與解答

1、1）什么是雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)（ DLR ?DLR測試系統(tǒng)靈敏，方便，在一個系統(tǒng)中用于測量兩個單獨的熒光素酶報告基因，螢火蟲熒光素酶及海洋海腎熒光素酶（Renilla reniformis） , DLR測試系統(tǒng)可用于細胞裂解物及無細胞的翻譯系統(tǒng)。2）有哪些海腎熒光素酶載體？海腎熒光素酶載體pRL用于在轉(zhuǎn)染的哺乳細胞中組成性地表達海腎熒光素酶。這類載體還有T7啟動子，可用T7RNA聚合物在體外合成海腎熒光素酶，有4個不同的載體：pRL-SV40 載體PRL-SV40載體含SV40增強子及早期啟動子區(qū)域，可在多種細胞中組成性地高表達海腎熒 光素酶。pRL-SV40載體還含有SV40的復(fù)制起始

2、區(qū)，可在表達SV40大T抗原的細胞中， 如COS-1 , COS-7細胞中，瞬時及附加體似地復(fù)制。pRL-CMV 載體pRL-CMV載體含有CMV極早增強子及啟動子，可在多種細胞中組成性地高表達海腎熒光素 酶。pRL-TK載體pRL-TK載體含HSV胞喀咤激酶啟動子區(qū)域，在多種細胞中組成性地弱表達海腎熒光素酶。 pRL-null 載體pRL-null載體缺真核啟動子及增強子，在海腎熒光素酶基因的上游含有多克隆位點。3）用雙報告基因有何優(yōu)點？一般地說，實驗報告基因用于測試實驗條件下基因的表達，而另一個報告基因作為內(nèi)對照，以提供實驗報告基因測試的歸一化。將實驗報告基因的活力與內(nèi)對照報告基因的活力作

3、歸一化可消除實驗中不同測試間所固有的變化，這些變化減弱實驗準確度，其中包括培養(yǎng)細胞的數(shù)目及活力的差異，細胞轉(zhuǎn)染及裂解的效率。海腎熒光素酶可用作對照報告基因及實驗 報告基因。在雙熒光素酶報告基因測試中，將螢火蟲熒光素酶作為實驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因。4）相比用CAT或3 -半乳糖甘酶對表達數(shù)據(jù)作歸一化，雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng) 有何優(yōu)點？ 用雙熒光素酶報告基因測試（DLR ）有幾個優(yōu)點：快速DLR測試不需保溫或?qū)悠纷黝A(yù)處理。用被動裂解液將共轉(zhuǎn)染有螢火蟲及海腎熒光素酶 基因的細胞裂解，制備細胞抽提物。 加入Stop&Glo試劑后，可同時湮滅螢火蟲熒光素酶活 力并激活海腎

4、熒光素酶發(fā)光，需立即測試海腎熒光素酶活性。在幾秒鐘內(nèi)可完成熒光素酶測 試實驗并作定量測試。而其他一些如CAT及3 -gal的報告基因系統(tǒng)在定量前需要長時間 的保溫。 靈敏度螢火蟲及海腎熒光素酶的測試線性范圍，是酶濃度的7個對數(shù)。其他報告基因的靈敏度及線性應(yīng)答受限。通常不存在內(nèi)源熒光素酶使背景活力低。 方便在單管中完成測試，不需拆分樣品，可用被動裂解液將培養(yǎng)在 96孔板中的細胞快速裂解。5）海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶相比的相對活性如何？在ATP,鎂，及氧存在時，螢火蟲熒光素酶作用于甲蟲熒光素，而來源于海洋腔腸 （Renilla reniformis）的熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。6）

5、將兩個報告基因載體作共轉(zhuǎn)染應(yīng)用什么條件？當用雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)來測量等重量的螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶時， 可觀察到它們釋放的光幾乎相等。螢火蟲熒光素酶的分子量為 61kD ,而海腎熒光素酶的分子量為36kD ,當測試等重量的兩個酶時，所測的海腎熒光素酶分子實際多69%。如以每摩爾為基礎(chǔ)，據(jù)實驗確定，用雙熒光素酶報告基因試劑測試的螢火蟲熒光素酶的熒光強度比 海腎熒光素酶強大約 53% 。共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒所含啟動子間的反式效應(yīng)有可能會影響到報告基因的表達。當對照或?qū)嶒瀳蟾婊蜉d體含有很強的啟動子/增強子時，需要特別加以注意。載體 pRL上的TK ,SV40 , CMV調(diào)節(jié)因子據(jù)報道可在大多數(shù)

6、哺乳類細胞中表達，但它們在不同細胞中的表達水平不同。載體pRL-TK中HSV胞喀咤激酶啟動子相對較弱，使海腎熒光素酶的組成性表達 成低到中度水平。早SV40極早CMV的增強子/啟動子轉(zhuǎn)錄水平高，當實驗載體所具有的 調(diào)節(jié)因子較強時，這類啟動子不太適用于雙報告基因?qū)嶒?。為使實驗報告基因及對照報告基因的基因表達相對獨立，每次實驗時轉(zhuǎn)染混和液中載體DNA的量及共轉(zhuǎn)染報告基因載體的比例需作優(yōu)化?？刹捎脤嶒炤d體與共轉(zhuǎn)染報告基因載體的組成比在10 : 1到50 : 1或更大的范圍，這有利于抑制啟動子間的交互作用。有時為有利于實驗，共轉(zhuǎn)染混和液中的實驗載體應(yīng)選擇為少量部分。7）需用熒光測試儀對雙熒光素酶報告基

7、因測試系統(tǒng)的熒光素酶作測定嗎？作DLR測試時應(yīng)使用熒光測試儀。液閃儀的靈敏度相比太低，不易獲得可重復(fù)的結(jié)果。8）作熒光素酶報告基因測試時，如何使用單或雙加樣的熒光測試儀?對于單加樣的熒光測試儀,物并測螢火蟲熒光素酶的活力， 測海腎熒光素酶的活力。對于雙加樣的熒光測試儀, I中加入熒光素酶測試試劑在管子中預(yù)先加入熒光素酶測試試劑II ,再加入細胞裂解接下來，用熒光測試儀上的加樣管加入Stop&Glo試劑，并在管子中加入細胞裂解物后，放入熒光測試儀中， 從加樣管II并測螢火蟲熒光素酶的活力，從加樣管II 中加入Stop&Glo試劑，并測海腎熒光素酶的活力。需對背景作預(yù)測試的熒光測試

8、儀需關(guān)閉這一功能。9）如何從熒光測試儀中清理Stop&Glo試劑？Stop&Glo試劑中的一個熒光素酶湮滅成份對塑料物質(zhì)有一定的親和力。這一組份對于 自動加樣管的塑料管及吸管的內(nèi)壁有可逆結(jié)合。接觸過Stop&Glo試劑的加樣管如沒充分清洗，會將殘留的湮滅試劑遺漏到隨后通過加樣管的溶液中。如這樣的情況發(fā)生，則非常少量的污染湮滅試劑就會極大地抑制螢火蟲熒光素酶的活力。因此在使用螢火蟲熒光素酶測試 中，如要用自動法加樣 LARII ,則需對已接觸 Stop&Glo試劑的加樣管作充分的清洗。如 熒光測試儀有兩個加樣管，則要將每個管子固定加樣一種溶液。在完成一次實驗后必須

9、徹底清洗，請按下面的步驟清洗管子并維修儀器。普通加樣管清洗步驟:用3倍于吸管箱體積的去離子水反復(fù)清洗加樣管子以除去Stop&Glo試劑。準備70%的乙醇作為清洗試劑，用 5ml70%的乙醇將箱及加樣管完全清洗，可將加樣管浸 泡在這一溶液30分鐘后，再用去離子水清洗。注意：構(gòu)造加樣管子的材料有很大差異，有的吸管浸泡清洗試劑的時間需超過30分鐘。配有Teflon管子的熒光測試儀不會有太大問題，而其他如Tygon浸泡清洗試劑的時間需超過12-16小時（過夜）以完全除去 Stop&Glo試劑。用3倍于吸管箱體積的去離子水反復(fù)清洗加樣管子以除去乙醇。Turner Designs TD -

10、 20/20熒光測試儀中加樣管的清洗 ：TD - 20/20熒光測試儀需5次預(yù)循環(huán)以100%地將加樣吸管中的溶液完全清除，然后按下列方法清除殘留的 Stop&Glo試劑：用去離子水清洗吸管10次，清除殘留的Stop&Glo試劑。再用70%乙醇清洗10次，并用清洗液將管子浸泡30分鐘。再用去離子水清洗 10次，清除殘留的乙醇。10）如何保存 Stop&Glo 試劑？將一定體積的Stop&Glo試劑保存在玻璃管及硅化的聚丙烯管子中，放在 -70oC 。在 未作處理的塑料管中，這一試劑不穩(wěn)定。11） 50 X Stop&Glo底物儲存液的保存條件已作改變！St

11、op&Glo底物溶于Stop&Glo底物試劑中，所得50 X貯液在-20oC會沉淀。當沉淀 發(fā)生時，50 X貯液的顏色會改變，如用于測定海腎熒光素酶，則酶活力會降低。最好新鮮配制50 X貯液，并立即使用，如需保存，則將 50 X貯液保存-70oC達4周, 活力不會改變。12）被動裂解液與報告基因裂解液及細胞培養(yǎng)裂解試劑有何差別？這三種裂解液能同雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)（DLR ） 一同使用嗎？被動裂解液經(jīng)特別配方以最有效地減小海腎熒光素酶底物海腎熒光素的自發(fā)熒光水平。兩個熒光素酶在被動裂解液中，室溫可保存6小時。報告基因裂解液原則上可用于制備細胞裂解物，并用于 DLR測試，但實際上這不可行，因較被動裂解液會導(dǎo)致高一些的海腎熒 光素的自發(fā)熒光水平。細胞培養(yǎng)裂解試劑的海腎熒光素的自發(fā)熒光水平很高，不能被采用于制備DLR測試系統(tǒng)的細胞裂解物。13）被動裂解液能裂解培養(yǎng)的植物細胞嗎？它能裂解哺乳動物組織所得的初級細胞嗎？被動裂解液不能裂解植物細胞。它能裂解一些類型的哺乳初級細胞。一種細胞能否被它裂解需作測試。14）加入Stop&Glo試劑后，還殘留有螢火蟲熒光素酶活性嗎？螢火蟲熒光素酶能立即被Stop&Glo試劑湮滅，殘留有螢火蟲熒光素酶活性低于%。15）熒光素酶測試試劑II是否是熒光素酶測試系統(tǒng)的同一試劑？熒光素酶測試試劑II不是熒光