PCR技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)方法（二）

1、藍(lán)色海洋書的海洋pcr技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)方法（二） (1)標(biāo)準(zhǔn)的pcr反應(yīng)體系：加滅菌雙蒸水至 50ul常用的反應(yīng)體系可分為25ul和50ul，常在0.2ml離心管內(nèi)配制，可按照自己的需要挑選相應(yīng)的反應(yīng)體系。pcr反應(yīng)體系中除引物序列不得轉(zhuǎn)變外，其余如dntp、taqdna聚合酶、引物和模板的用量等均可適當(dāng)轉(zhuǎn)變，以適應(yīng)詳細(xì)的pcr條件并達(dá)到試驗(yàn)的要求。(2) 參加pcr反應(yīng)體系的因素：參加pcr反應(yīng)的因素主要包括模板dna、引物、taqdna聚合酶、緩沖液、mg2+和三磷酸脫氧核苷酸(dntp)。1) 模板dna：用于pcr反應(yīng)的模板即為制備的基因組dna。2) 引物：引物打算pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的特異

2、性與長度。pcr反應(yīng)中有兩種引物，即5'端引物與3'端引物。5'端引物是指與模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指與模板3'端序列互補(bǔ)的寡核苷酸。反應(yīng)體系中，引物終濃度普通要求在0.10.5umol/l之間，濃度太高簡單生成引物二聚體或非特異性產(chǎn)物。3) taqdna聚合酶：熱穩(wěn)定dna聚合酶是pcr技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動化的關(guān)鍵，它在合適的溫度和mg2+濃度調(diào)控下，使dna由5'端開頭復(fù)制到3'端。taqdna聚合酶在pcr反應(yīng)中加入的量也很重要，通常每100ul反應(yīng)液中含12.5u為好，并注重在-20儲藏。4) pcr緩沖液：緩沖

3、液提供pcr反應(yīng)合適的酸堿度與某些離子，常用1050mmol/ltris-hcl(ph8.38.8)緩沖液。5) mg2+mg2+是taqdna聚合酶活性所必須的，普通pcr反應(yīng)體系中mg2+終濃度為1.52.0mmol/l，mg2+濃度過高反應(yīng)特異性降低，易浮現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低taqdna聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物削減。6) dntp：三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dntp)是datp、dgtp、dttp和dctp的統(tǒng)稱，是pcr反應(yīng)的合成原料。pcr反應(yīng)中dntp含量太低，pcr擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易浮現(xiàn)假陰性，過高的dntp濃度

4、會抑制擴(kuò)增反應(yīng)。pcr反應(yīng)中每種dntp濃度應(yīng)相等，通常的濃度范圍為50200umol/l。(3) pcr反應(yīng)程序的設(shè)定：標(biāo)準(zhǔn)的pcr反應(yīng)過程分為三步。pcr反應(yīng)程序中的詳細(xì)時(shí)光、溫度和循環(huán)數(shù)依據(jù)模板和引物狀況而定。同時(shí)必需設(shè)定陽性和空白對比，pcr陽性對比為采納相應(yīng)品種的對比藥材或符合現(xiàn)行版藥典規(guī)定的相應(yīng)藥材標(biāo)本按供試品同樣的辦法提取的dna模板；空白對比以滅菌雙蒸水作為pcr反應(yīng)的模板。對比pcr反應(yīng)體系均與供試品全都?，F(xiàn)在有些pcr由于擴(kuò)增區(qū)很短，即使taq酶活性不是最佳，也能在很短的時(shí)光內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延長同時(shí)在6065間舉行，以削減一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速

5、度。3. 瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳是一種十分簡便、迅速、常用的分別純化和鑒定核酸的辦法。(1) 試劑1) dna分子量標(biāo)準(zhǔn)：電泳一定要用法dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，普通挑選在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對目標(biāo)片段大小的估量才比較精確。2) 電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有溴酚藍(lán)和二甲苯青及銀染色。溴酚藍(lán)在堿性液體中呈紫藍(lán)色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍(lán)的遷移率分離與1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的雙鏈線性dna片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈藍(lán)色，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分離與2kb和1.6kb的雙鏈線性dna大致相同

6、。3) 上樣緩沖液：普通與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。可增強(qiáng)樣品比重，以確保dna勻稱沉入加樣孔內(nèi)；使樣品呈色，便于加樣操作；形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。4) 核酸染色劑：常用溴化乙錠(eb)或gelred，這兩種均為熒光染料，可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與dna的含量成正比，據(jù)此可粗略估量樣品dna濃度。eb是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。5) 電泳緩沖液：核酸電泳緩沖液有三種，即tris-硼酸(tbe)、tris-(tae)和tris-(tpe)，tbe與tpe緩沖容量高，dna分別效果好，但tpe在dna片

7、段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，簡單使dna沉淀。tae緩沖容量低，但價(jià)格較廉價(jià)，因而推舉選用tbe或tae。緩沖液中的edta可螯合二價(jià)陽離子，從而抑制dna酶的活性，防止pcr擴(kuò)增產(chǎn)物降解。10×tbe：稱取108克tris堿，9.3克edta，55克硼酸，加水至1000ml(ph8.08.2)，電泳時(shí)用水稀釋20倍至0.5×tbe工作液。50×tae：稱取242克tris堿，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/ledta(ph8.0)，加入適量去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?000ml，作為儲藏液。舉行凝膠電泳時(shí)稀釋50倍至1×tae工作液。6)

8、 1%瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖，加入100ml1×tae電泳緩沖液。(2) 制備：1%瓊脂糖凝膠：稱取1g，加入100ml 1×tae電泳緩沖液，微波爐中火加熱煮沸3次至瓊脂糖所有溶化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液，冷卻至65左右加入核酸染色劑。(3) 膠板制備：取制膠槽，放入制膠板，置于水平位置，并在固定位置放好梳子，將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠液混勻當(dāng)心地倒入內(nèi)槽板上，使膠液緩慢綻開，直到囫圇玻璃板表面形成勻稱膠層，室溫下靜置直至凝膠徹低凝固，垂直輕拔梳子，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中，添加1×tae電泳緩沖液至沒過膠板為止。(4) 加樣：在點(diǎn)樣板或paraf

9、ilm上混合dna樣品和上樣緩沖液，用移液器分離將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)吸頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。加樣前要先登記加樣的挨次。(5) 電泳：加樣后的凝膠板立刻通電舉行電泳，電壓60100v，樣品由負(fù)極向正極方向移動。當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。(6) 觀看照相：在紫外光下觀看，dna存在則顯示出紅色熒光條帶，采納凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。4. 結(jié)果與判定(1) pcr電泳圖譜：電泳圖譜應(yīng)包括dna分子量標(biāo)準(zhǔn)、供試品、陽性對比和空白對比。pcr產(chǎn)物與點(diǎn)樣孔之間的遷移距離與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)舉行對比，即可得到供試品的pcr分子量。(

10、2) 結(jié)果判定：供試品凝膠圖譜中，在與對比藥材凝膠圖譜相應(yīng)位置上有相應(yīng)的單一dna條帶，即擴(kuò)增片段與預(yù)期片段全都，而空白對比中皆沒有相應(yīng)的dna條帶，表白該樣品為陽性結(jié)果，報(bào)告供試品符合規(guī)定。(四) 注重事項(xiàng)pcr反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力與極高的敏捷性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。1. 污染緣由主要有標(biāo)本間交錯(cuò)污染，pcr試劑的污染，最頻繁的是pcr擴(kuò)增產(chǎn)物污染，主要形式是氣溶膠污染。2. 防止污染的辦法(1) 試驗(yàn)室合理分區(qū)：最好能劃分樣本制備區(qū)、pcr反應(yīng)液制備區(qū)、pcr擴(kuò)增區(qū)、pcr產(chǎn)物分析區(qū)。(2) 移液器的污染：加樣或吸取模板核酸時(shí)要非常當(dāng)心，吸樣要慢盡量一次性完成，以免交錯(cuò)污染或產(chǎn)憤怒溶膠污染。(3) 預(yù)混和分裝pcr試劑：全部的pcr試劑都應(yīng)小量分裝，避開污染機(jī)會。另外，pcr試劑、pcr反應(yīng)液應(yīng)與樣品及pcr產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(4) 試驗(yàn)用品及移液器應(yīng)專用。試驗(yàn)前應(yīng)將試驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的dna或rna，防止操作人員污染。(5) 用法一次性手套、吸頭，小離心管應(yīng)一次性用法。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，全部試劑或器材均應(yīng)高溫高壓消毒；