HPLC法測定物質(zhì)時已知雜質(zhì)的計算方法

1、HPLC法測定物質(zhì)時雜質(zhì)的計算方法制藥技術(shù)聯(lián)盟凱博思KEYBOS 6月17日根據(jù)藥品注冊的國際技術(shù)耍求(ICH)中雜質(zhì)的含義,雜質(zhì)分為有機雜質(zhì).無機雜質(zhì)和殘留溶劑. 有關(guān)物質(zhì)是雜質(zhì)的一種,主耍是指有機雜質(zhì).它的檢查方法很多,而其中的HPLC法具有專屬性 強、別離效果好.靈敏度高.分析速度快、重復(fù)性好、操作簡便等諸多優(yōu)點,11能與多種類型 檢測器聯(lián)合應(yīng)用,能滿足大多數(shù)化合物種類的檢測需要,比擬符合有關(guān)物質(zhì)檢查時雜質(zhì)含量低. 種類多的特點.HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)中己知雜質(zhì)的測定方法很多,計算方法也相應(yīng)很多,每種計算方法都有不 同的意義及其優(yōu)缺點,下面參考國內(nèi)外藥品標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)期刊文獻,結(jié)合在藥品檢驗

2、中的實際工 作,對這些計算方法作一簡單探討,以期為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立或進行相關(guān)研究時對有關(guān)物質(zhì) 檢查中己知雜質(zhì)的計算方法的選擇提供借鑒和參考.表1是各種計算方法的計算公式及其主耍 優(yōu)缺點.1面積歸一化法優(yōu)缺點：具有與稱樣量及進樣量根本不相關(guān)的特點,因此重復(fù)性和巫現(xiàn)性均良好,不需要折算,降低了 實驗中對稱樣量精密度的耍求,降低了檢驗本錢,操作更加簡便.快捷,省去了計算過程.但當(dāng)雜質(zhì)是微量的時候需増加方法的靈敬度,就耍增加進樣量,此時主成分可能超出儀器檢測 范圍,或雖然在儀器檢測范圍內(nèi),理論上講此時可能與主成分不在同一線性范圍內(nèi).正是由于各雜質(zhì)的響應(yīng)因子不同.含量較低和需耍較寬的線性范圍等因素的影

3、響,?中國藥典? 2005年版二部附錄中特別強調(diào)本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量.除另有規(guī)定 外,一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查這也在一定程度上限制了本法的使用.2.1不加校正因子的主成分口身對照法此方法是現(xiàn)行版?中國藥典?和其他國家藥品標(biāo)準(zhǔn)及藥品研發(fā)時制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用最多. 最廣泛的有關(guān)物質(zhì)的測定方法和計算方法.方法介紹：本法是配制一個濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤鹤鳛閷φ杖芤?一般是由供試品溶液直接稀 釋得到.本法不需要雜質(zhì)對照品當(dāng)無法獲得雜質(zhì)對照品時可采用不加校正因子的主成分自身 對照法來計算雜質(zhì)的含量.同面積歸一化一樣,本法也是在假定供試品溶液中所有成分均出峰、 所有雜質(zhì)均與

4、主成分別離且各雜質(zhì)和主成分的響應(yīng)因子均相同的前提下進行的.優(yōu)缺點：同面積歸一化一樣,本法的優(yōu)點是操作簡單、運算方便,無需雜質(zhì)對照品;缺點是忽略了各雜質(zhì) 與主成分的響應(yīng)因子可能不同的事實導(dǎo)致了實驗測得的雜質(zhì)含量可能與真正的雜質(zhì)含量不一 致.此外,不加校正因子的主成分自身對照法會存在稀釋步驟、進樣針和進樣閥殘留、進樣誤差等 影響因素,往往也會導(dǎo)致計算出的雜質(zhì)與真實含量之間存在一定的誤差；但不加校正因子的主 成分口身對照法可以解決面積歸一化法中可能出現(xiàn)的儀器檢測范圍和線性范圍問題.2.2加校正因子的主成分口身對照法目前在國內(nèi)應(yīng)用較少,但在國外藥品標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用比擬廣泛.方法介紹：該方法的操作步驟根本與2

5、.1相同,唯一不同的是在計算時把雜質(zhì)相當(dāng)于主成分的響應(yīng)因子考 慮進去.本法相當(dāng)于一個簡化的內(nèi)標(biāo)法,同時也是對雜質(zhì)對照品外標(biāo)法的簡化,即在研究方法學(xué) 時,利用雜質(zhì)對照品和主成分對照品,分別測定雜質(zhì)和主成分的線性方程,以斜率之比計算雜 質(zhì)相對于主成分的校正因子,此校正因子可直接載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中,在常規(guī)檢驗時用以校正該雜 質(zhì)的實測峰面積.在實際測定時,可釆用相對保存時間進行雜質(zhì)定位.優(yōu)缺點：此法的優(yōu)點是在日常檢驗中省去了雜質(zhì)對照品特別是在雜質(zhì)不夠穩(wěn)定或?qū)砉┙o有困難時顯 得尤其重要,同時又考慮到了雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同所引起的測定誤差;缺點是相 對保存時間在不同實驗室間可能有所波動特別是當(dāng)供試

6、品中存在多個雜質(zhì)而又別離不好時可 能造成雜質(zhì)定位困難.需耍指岀的是,如果己知雜質(zhì)對主成分的相對響應(yīng)因子超出091.1 范圍時,宜用加校正因子的主成分口身對照法或雜質(zhì)對照品外標(biāo)法法進行計算.3主成分對照品外標(biāo)法?美國藥典?多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法來對己知雜質(zhì)進行計算. 方法介紹：主成分對照品外標(biāo)法包括加不校正因子的主成分對照品外標(biāo)法和加校正因子的主成分對照品外 標(biāo)法.操作、計算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分口身對照法根本一樣,唯一不同 的是前者耍用主成分對照品制備一個濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ掌啡芤?后者是由供 試品溶液直接稀釋得到一個濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)?/p>

7、溶液作為對照溶液.優(yōu)缺點：由于主成分對照品是經(jīng)過標(biāo)定的,其純度或量值會比擬準(zhǔn)確,而制劑中主成分的實際含量與標(biāo) 示量有時會不完全一致,因此采用對照品外標(biāo)法計算出的雜質(zhì)的實際絕對含量要比口身對照法 準(zhǔn)確一些.當(dāng)然,由于本法耍使用主成分對照品,從而導(dǎo)致操作本錢會提升一些,操作過程會繁 瑣一些.4雜質(zhì)對照品外標(biāo)法方法介紹：雜質(zhì)對照品外標(biāo)法要求提供一定純度的雜質(zhì)對照品,分析時需制備一個濃度應(yīng)與雜質(zhì)限度相當(dāng) 的溶液作為雜質(zhì)對照品溶液.由于雜質(zhì)對照品外標(biāo)法可以解決上述幾種測定方法和計算方法存 在的種種問題,特別是雜質(zhì)與主成分響應(yīng)不一致的問題,因此,本法能反映藥品中該雜質(zhì)的真 實含量.優(yōu)缺點：如果雜質(zhì)對照品容

8、易獲得并能持續(xù)供給,建議在有關(guān)物質(zhì)檢查中己知雜質(zhì)的測定和計算時存選 該法,特別是當(dāng)該雜質(zhì)與主成分的相對響應(yīng)因子相差較大超出09范圍或該雜質(zhì)有毒副 作用時,歐美藥典中采用此法進行有關(guān)物質(zhì)計算的品種也不在少數(shù).雖然雜質(zhì)對照品的獲得和供給比擬困難,在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中是否引入雜質(zhì)對照品應(yīng)權(quán)衡并慎重, 但由于該法能真實反映藥品中某一雜質(zhì)的含量,因此采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法應(yīng)該是今后有關(guān)物 質(zhì)檢查時努力的方向.5加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法方法介紹：加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法其實也是雜質(zhì)對照品外標(biāo)法的一種.本法的操作方法與測定方 法同雜質(zhì)對照品外標(biāo)法一樣,不同的是在計算公式中多乘以一個轉(zhuǎn)換因子,其意義就是把樣

9、品 中某一雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本身的重量百分比水平.假設(shè)某一制劑的標(biāo)示量為100 mg,采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計算出某一雜質(zhì)的含量為主成分的 1.0%z假設(shè)該雜質(zhì)與主成分的分子量之比為1：2,那么按加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計算出的 該雜質(zhì)的含量為2.0%,即該雜質(zhì)的真實含量為l.Omg,但通過分子量之比換算成相當(dāng)于主成分 的含量為2.0mgo優(yōu)缺點：結(jié)果較準(zhǔn)確.但由于雜質(zhì)的分子量可能大于或小于主成分的分子量即主成分的分子量/雜質(zhì)的 分子量可能小于1或大于it因此采用本法計算出的某一雜質(zhì)的含量結(jié)果也可能比面積歸一化 法、主成分自身對照法.主成分對照品外標(biāo)法和雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計算出的結(jié)果

10、偏低或偏高.6加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對照品外標(biāo)法方法介紹：加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對照品外標(biāo)法其實也是主成分對照品外標(biāo)法的一種,就是在加 校正因子的主成分對照品外標(biāo)法的根底上乘以轉(zhuǎn)換因子.優(yōu)缺點：其操作和優(yōu)缺點與加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法一樣,其意義與加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品 外標(biāo)法一樣,也是通過雜質(zhì)和主成分分子量之比的換算把該雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本 身的百分比水平.7內(nèi)標(biāo)法方法介紹：按各品種項下的規(guī)定,分別精密量収含有一定濃度內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對照品溶液和供試品溶液,注入 液相色譜儀記錄色譜圖,測定對照品溶液中對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積及供試品溶液中待測 成分這里指待測雜質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物

11、質(zhì)的峰面積,根據(jù)表1中的公式計算雜質(zhì)的含量.優(yōu)缺點：內(nèi)標(biāo)法主耍是為了解決儀器進樣精密度和藥物中所含成分的回收率的問題,這種方法可以抵消 儀器和過程帶來的誤差.但在以常圧六通閥定量環(huán)進樣和回收率己經(jīng)驗證的情況下,意義己不 大,加之內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇比擬困難,內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的添加會導(dǎo)致別離難度的增大,操作過程更加煩 瑣等問題,本法己經(jīng)使用很少.現(xiàn)舉例說明不同計算方法對HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)中己知雜質(zhì)測定結(jié)果的影響.抗髙血圧藥q來 酸依那普利片中有關(guān)物質(zhì)的計算方法.?中國藥典?2005年版二部中所有雜質(zhì)包括雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮采用的均是 不加校正因子的主成分自身對照法；?英國藥典?2021年版中雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮采用的是雜質(zhì)對照品外標(biāo)法,其 他雜質(zhì)采用的是不加校正因子的主成分口身對照法；?英國藥典?31版中雜質(zhì)依那普利拉采用的是加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法,依那普利 雙酮采用的是加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對照品外標(biāo)法,其他雜質(zhì)釆用的是不加校正因子 的主成分對照品外標(biāo)法.由于不同計算方法所表示的意義不同,所以得出的結(jié)果也不相同.表2就是某企業(yè)生產(chǎn)的q來 酸依那普利片,按上述不同計算方法得出的雜質(zhì)的含量結(jié)果.由表