整理蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法比較

1、精品文檔蛋 白 質(zhì) 測(cè) 疋 方 法 比 較簡(jiǎn)介蛋白質(zhì)protein 是生命的物質(zhì)根底,沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命.因此,它 是與生命及與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì).食物蛋白質(zhì)的質(zhì)和 量、各種氨基酸的比例,關(guān)系到人體蛋白質(zhì)合成的量,尤其是青少年的生長(zhǎng)發(fā)育、 孕產(chǎn)婦的優(yōu)生優(yōu)育、老年人的健康長(zhǎng)壽,都與膳食中蛋白質(zhì)的量有著密切的關(guān)系. 人體的生長(zhǎng)、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)、遺傳、繁殖等一切生命活動(dòng)都離不開(kāi)蛋白質(zhì).生命運(yùn) 動(dòng)需要蛋白質(zhì),也離不開(kāi)蛋白質(zhì).蛋白質(zhì)含量測(cè)定主要有五種方法,分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收 法、酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)法.這五種方法各有特點(diǎn),優(yōu)缺點(diǎn)明確.F面是我依照原理,優(yōu)缺點(diǎn),應(yīng)用范圍

2、所對(duì)五種方法作的一些簡(jiǎn)單介紹原理凱氏定氮法蛋白質(zhì)是含氮的化合物.食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化,使蛋白質(zhì)分 解,產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,留在消化液中,然后加堿蒸餾使氨游離, 用硼酸吸收后,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量來(lái)乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù), 即得蛋白質(zhì)含量.由于食品中除蛋白質(zhì)外,還含有其它含氮物質(zhì),所以此蛋白質(zhì) 稱為粗蛋白.雙縮脲定氮法雙縮脲NHCONHCONH是兩 個(gè)分子脲經(jīng)180C左右加熱,放出一個(gè)分子氨 后得到的產(chǎn)物.在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與 CuSO形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲 反響.凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵, 或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的 肽鍵,這類(lèi)化合物都有雙

3、縮脲反響.O=C ' . HHNR-CHO=CHNR-CH2OC=OINh' ' '、,.! CH-R Cu ' '、二-C=O_ ,- Nh ' -:CH-RI20紫色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比, 而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成 分無(wú)關(guān),故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量.測(cè)定范圍為 110mg蛋白質(zhì).干擾這一測(cè)定 的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等.紫外吸收定氮法雙縮脲法是傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法,當(dāng)含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上 肽鍵的物質(zhì)和堿性的硫酸銅反響時(shí),形成紫色的絡(luò)合物,這個(gè)顏色產(chǎn)物是肽鍵中 的氮原子和銅離子

4、配價(jià)結(jié)合的結(jié)果.蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì).形成顏色產(chǎn)物的量 取決于蛋白質(zhì)的濃度.實(shí)際測(cè)定時(shí),必須預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)校 正曲線,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液.不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 溶液參加雙縮脲試劑后,反響生成的顏色產(chǎn)物用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在540nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以雙縮脲試劑加緩沖或水作空白對(duì)照.然后將測(cè)得的值分別 對(duì)蛋白濃度mg/ ml作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線.未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理 根據(jù)測(cè)得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查得未知蛋白質(zhì)樣品中得蛋白質(zhì)濃度.酚試劑法此法的顯色原理與雙縮脲方法是相

5、同的,只是參加了第二種試劑,即 Folin 酚試劑,以增加顯色量,從而提升了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度. 這兩種顯色反響產(chǎn) 生深藍(lán)色的原因是： 在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物.Foli n 酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基 復(fù)原,產(chǎn)生深藍(lán)色鉬蘭和鎢蘭的混合物.在一定的條件下,藍(lán)色深度與蛋白 的量成正比.考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的最大吸收峰 的位置如aX,由465nm變?yōu)?95nm溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色.經(jīng)研 究認(rèn)為,染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸)和芳香族氨基酸 殘基相結(jié)合.在595nm下

6、測(cè)定的吸光度值 心,與蛋白質(zhì)濃度成正比.優(yōu)勢(shì)凱氏定氮法重現(xiàn)性好,是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法 ,是一種蛋白質(zhì)測(cè)定的 經(jīng)典方法,測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確.雙縮脲定氮法較快速,不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,以及干擾物質(zhì)少.主要的缺點(diǎn)是靈敏度差.因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)紫外吸收定氮法對(duì)各種蛋白質(zhì)呈色根本相同；特異性和準(zhǔn)確度好,精密度好;呈色穩(wěn)定性好, 試劑單一,方法簡(jiǎn)便.快速,不消耗樣品,測(cè)定后仍能回收使用.酚試劑法1. 靈敏度高,比雙縮脲法靈敏約100倍2. 操作簡(jiǎn)單,不需要特殊儀器設(shè)備.考馬斯亮藍(lán)法(1) 靈敏度高,據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍,其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可

7、達(dá)1"g. 這是由于蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多.(2) 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便,只需加一種試劑.完成一個(gè)樣品的測(cè)定,只需要 5 分鐘左右.由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可 以在 1 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,且在 5 分鐘至 20 分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性最好.因而 完全不用像 Lowry 法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地限制時(shí)間.(3)干擾物質(zhì)少.如干擾Lowry法的K+、Naf、Mg離子、Tris緩沖液、糖和 蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法.缺點(diǎn)凱氏定氮法操作比擬繁復(fù),

8、費(fèi)時(shí) , 試劑消耗量大.且此法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量實(shí)際上包括 了核酸,生物堿,含氮類(lèi)脂,卟啉,含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物.雙縮脲定氮法不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收定氮法準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)多, 在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí), 對(duì)那些與標(biāo) 準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì), 有一定的誤差. 故該法適于用 測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì). 假設(shè)樣品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等 吸收紫外光的物質(zhì), 會(huì)出現(xiàn)較大的干擾. 核酸的干擾可以通過(guò)查校正表, 再進(jìn)行 計(jì)算的方法, 加以適當(dāng)?shù)男Ｕ? 但是由于不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相 同的,雖然經(jīng)過(guò)校正,測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤

9、差.此外,進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收頂峰常因pH的改變而有變化, 因此要注意溶液的pH值,測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致.酚試劑法費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng), 要精確限制操作時(shí)間, 標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式, 且專(zhuān) 一性較差,干擾物質(zhì)較多.對(duì)雙縮脲反響發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾 Lowry 反響.而且對(duì)后者的影響還要大得多.酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、 Tris 緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用.濃度較低的尿素0.5%,硫酸納1% ,硝酸納1%,三氯乙酸0.5%,乙醇5%,乙醚5%,丙酮0.5%等溶液 對(duì)顯色無(wú)影響,但這些物質(zhì)濃度高時(shí),必須作校正曲線.含硫酸銨的溶液,只須 加濃

10、碳酸鈉一氫氧化鈉溶液,即可顯色測(cè)定.假設(shè)樣品酸度較高,顯色后會(huì)色淺, 那么必須提升碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12倍.進(jìn)行測(cè)定時(shí),加F olin 酚試劑時(shí)要特別小心,由于該試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定,但上述復(fù)原反響只在pH=10的情況下發(fā)生,故當(dāng)Folin 酚試劑加到堿性的銅一蛋白質(zhì)溶液中時(shí),必 須立即混勻,以便在磷鉬酸一磷鎢酸試劑被破壞之前,復(fù)原反響即能發(fā)生.考馬斯亮藍(lán)法1 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford 法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差,在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用一球蛋 白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差.2 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定,主要的干擾

11、物質(zhì)有：去污劑、Trit on X-100、十二烷基硫酸鈉SDS和0.1N的NaOH 如同0.1N的酸干擾Lowary 法一樣.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有稍微的非線性,因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,而只能 用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度.應(yīng)用范圍凱氏定氮法適用樣品廣泛是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一法.適合于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定以及各類(lèi)動(dòng)植物蛋白測(cè)定.適用于0.2 1.0mg氮,誤差為2%雙縮脲定氮法適用于120mg氮.紫外吸收定氮法適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè),由于此時(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變 化,而不需知道其絕對(duì)值.適用于50100弋氮.酚試劑法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5乜.通常測(cè)定范圍是2O250Q.考馬斯亮

12、藍(lán)法適用于15乜氮.自己的想法凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法 ,是一種蛋白質(zhì)測(cè)定 的經(jīng)典方法,適用樣品廣泛,測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確.而雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)染色法那么 測(cè)試過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速,在可以準(zhǔn)確配取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液而準(zhǔn)確性要求不高的測(cè)試中 可以根據(jù)含氮量的不同選擇這兩種方法.紫外吸收法對(duì)有色被測(cè)樣品是不適用的 在測(cè)無(wú)色樣品時(shí),由于其操作簡(jiǎn)便、迅速,不消耗樣品,低濃度鹽類(lèi)不干擾,因 此也是經(jīng)常被采用的蛋白質(zhì)測(cè)定方法.而怎樣對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理以到達(dá)紫外吸收法的測(cè)定條件也是我們今后需要探索的. 而現(xiàn)在,科學(xué)家已經(jīng)對(duì)凱氏定氮裝置進(jìn) 行了改良 ,用高鍋?zhàn)鏊魵獍l(fā)生器 ,串連幾套定氮儀 , 可同時(shí)測(cè)定幾份樣品.節(jié)省 時(shí)間, 提升了工作效率.改良后的方法適用于批量食品蛋白質(zhì)的測(cè)定 , 具有準(zhǔn)確、 快速、簡(jiǎn)便