蛋白酶活性的測(cè)定

1、 實(shí)驗(yàn)四蛋白酶活力的測(cè)定 一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、 了解蛋白酶活力測(cè)定的原理； 2、 掌握蛋白酶活力測(cè)定的方法。 二、 實(shí)驗(yàn)原理 蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵， 也能夠水解酰胺鍵和酯 鍵，因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類化合物作為底物來測(cè)定蛋白酶的活 力。 本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白為底物，測(cè)定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。 酪蛋白經(jīng)蛋 白酶作用后，降解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸， 在反響混合物中參加三氯 醋酸溶液，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來， 相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽 和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反 應(yīng)時(shí)間。在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸

2、光度的增加，就可計(jì)算酶的活力。 三、 實(shí)驗(yàn)試劑 微生物蛋白酶萃取液 0.01g/ml：稱取1.0g酶制劑，加100ml蒸僻水?dāng)嚢?30min,在4C下離心別離后，將上層活夜置于冰箱中保存，使用前稀釋一定倍 數(shù)； 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.5; 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液PH7.5, 加熱并攪拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存； 5%三氯醋酸TCA溶液。 四、 實(shí)驗(yàn)步驟 1、 將5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37CT保溫。 2、 取四支15ml具塞試管，分別標(biāo)上記號(hào) A1、A0、B1和B0。在A1和A0試管 中各吸入0.20ml酶液

3、，在B1和B0試管中各吸入0.40ml酶液，分別用0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液定容至2.00ml。在A0和B0試管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液， 上述四支試管都置丁 37 C水浴中保溫。 3、 在各試管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37C下保溫10min 準(zhǔn)確計(jì)時(shí) 后，再向A1和B1試管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。 4、 將試管從水浴中取出，在室溫下放置 1h,用少量上活液潤(rùn)濕濾紙后過濾，保 留濾出液。 5、在280nm波長(zhǎng)下，分別以A0和B0濾液為空白，測(cè)定 A1和B1濾液的吸光 度。 五、計(jì)算 1、 在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，以每分鐘增加 0.001吸光度定義為一個(gè)酶單

4、位。 2、 每克酶制劑中酶活力的計(jì)算： ?A X 1000 / t X w 酶活力單位/克酶制劑 式中，？A樣品與空白吸光度差值即 A1和B1的吸光值；t 酶作用 時(shí)間本實(shí)驗(yàn)為10min； w - 反響中酶的用量，g 六、 說明 1、 微生物蛋白酶粗提取液在較寬廣的 PH范圍表現(xiàn)出活力，但是在接近中性條 件下最有最周活力。 2、 微生物蛋白酶在45 C以下可保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性。 七、 思考題 1、 蛋白酶有哪幾類？ 2、 影響酶活力的因素有哪些？ 3、 使用紫外分光光度計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問題？ 六、數(shù)據(jù)記錄與處理 A1 = 0.279 B1 = 0.573 酶含量為 0.001g/ml 酶活力

5、1 = ?A X 1000 / t X w =0.279 X 1000/10/0.001/0.20=1.395 酶活力 2= ?A x 1000 / t X w =0.573 x 1000/10/0.001/0.40=1.4325 5酶活匆m /克酶制 劑 平均值=1.395 X 51+ 1.4325 X 510=141375酶活力單位/克酶制劑 平均相對(duì)相差=143250 - 139500 /141375 X 100%=2.65% 七、思考題 1、 蛋白酶有哪幾類? 答：按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式：A內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵， 生成相對(duì)分子質(zhì)量較小的多肽類；B外肽酶：切開蛋白質(zhì)或多肽分子

6、氨基或?；?末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類；C水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；D水解蛋白 質(zhì)或多肽的酰胺鍵。按酶的來源可分為：動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋 白酶 微生物蛋白酶乂可分為：細(xì)菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白 防 按蛋白酶作用的最適PH可以分為A PH2.55.0的酸性蛋白酶，B PH9.510.5的堿性蛋白酶，C PH78的中性蛋白酶 2、 影響酶活力的因素有哪些？ 答：酶活力是酶催化某一化學(xué)反響的速率來表示的。防活力的大小即酶含量 的多少，可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示， 防活力的測(cè) 定也就是測(cè)定酶促反響的速率。 酶濃度對(duì)酶活力的影響：防促反響速率與

7、酶分子的濃度呈正比， 在一定范 圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r(shí)，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。 底物濃度對(duì)酶活力的影響：假設(shè)酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時(shí)， 酶促反響速度與底物濃度呈正比，即隨底物濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與底 物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會(huì)增加，防促 反響速度也不會(huì)增加。 溫度對(duì)酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內(nèi)，防促反響速度隨溫度升高而 增加，超過最適反響溫度，酶活力將會(huì)下降。 PH對(duì)酶活力的影響：酶在最適 PH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大丁或小丁最適 PH,都會(huì)降低酶活性。 激活劑對(duì)酶活力的影響：某些無機(jī)陽離子、陰離子、有機(jī)化合物可作為激 活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強(qiáng)化其催化活性。 抑制劑對(duì)酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞酶的活力， 它可降低酶促反響速度。 3、使用紫外分光光度計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問題？ 答：使用的比色皿必須潔凈，并注意配對(duì)使用。手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)， 裝盛樣品量