從患者開始談基因檢測的整個(gè)流程0001

1、從患者開始談基因檢測的整個(gè)流程題記：幾顆玉米放進(jìn)爆米花機(jī)器，由來便是爆米花；一 個(gè)智力一般的高中生放到人大附中，三年后由來就是國際一 流大學(xué)新生；二兩五花肉和幾個(gè)青椒交給一名廚師，由來的 便是香噴噴的回鍋肉?？墒沁@中間都發(fā)生了啥？是什么重要 步驟將初始原料打磨成了成品？10ml的血液或者一塊腫瘤組織，最終變成了一份20頁的檢測報(bào)告？這是怎么實(shí)現(xiàn)的？ 中間都發(fā)生了什么？本文旨在回答這個(gè)問題?；驒z測的整個(gè)流程可分為哪幾個(gè)大的步驟？概況性地了 解一個(gè)事務(wù)的框架是很有必要的，因?yàn)檫@樣我們心里會(huì)有“底”。不管別人怎么分，我簡單粗暴地把它分為四個(gè)程序： 1,檢測前咨詢部分；2,實(shí)驗(yàn)室部分；3,信息分析部

2、分；4, 臨床解讀部分。五臟俱全的基因檢測公司應(yīng)該包含以上所有 的四個(gè)程序，除非存在部分業(yè)務(wù)外包的情況，例如有的公司 只做臨床解讀部分。1）檢測前咨詢部分：不是所有的癌癥 患者都應(yīng)該檢測，都值得檢測，檢測目的是為了明確是否可 以使用靶向藥物，還是僅僅為了玩，選擇哪種產(chǎn)品更加適合， 這些都是需要在這部分搞清楚。2）實(shí)驗(yàn)部分：應(yīng)該取多少組織樣本，測序過程中有哪些細(xì)節(jié)步驟， 這可是個(gè)核心環(huán)節(jié)。 3）信息分析：實(shí)驗(yàn)部分做完以后所得到的是一大堆序列， 不分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是從這些垃圾中挑選黃金。4）臨床解讀：黃金挑選由來不拿去換成大米然后進(jìn) 肚，那也沒什么用，基因檢測的結(jié)果有什么意義，對臨

3、床實(shí) 踐又何指導(dǎo)，全在這里了。四個(gè)程序，每個(gè)程序又包含哪些 小工序呢？通過上面的介紹，我們可以大體了解基因檢測分 為四個(gè)程序，也明白四個(gè)程序主要做什么。可是，每一個(gè)程 序又具體涉及哪些小程序呢？剖析程序的過程，就是知識(shí)差 異化的過程。1,檢測前咨詢：患者預(yù)期、產(chǎn)品選擇；2,實(shí)驗(yàn)部分：樣本獲取與運(yùn)輸、DNA制備與文庫構(gòu)建、質(zhì)控與上機(jī)測序；3,信息分析部分：數(shù)據(jù)分析、報(bào)告初稿；4,臨床解讀部分：檢測報(bào)告、臨床實(shí)踐、報(bào)告解讀/人文關(guān)懷?？偠灾唵蝸碚f，從明確患者的檢測目的開始（用藥指 導(dǎo)，耐藥后尋找新的方案，僅檢測一個(gè)基因或多個(gè)基因突變 狀態(tài)等），到選擇合適的產(chǎn)品，然后獲取規(guī)范的樣本（血液， 組

4、織，唾液等），然后合適的運(yùn)輸方式到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，然后一 些列的規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作及數(shù)據(jù)分析，最后到科學(xué)的檢測報(bào)告 與咨詢服務(wù)。這就是四個(gè)程序所包含的內(nèi)容。每一個(gè)程序分 為許多小工序，每一個(gè)小工序又有許多學(xué)問與講究。下面將 會(huì)詳細(xì)介紹每一個(gè)小工序。程序一：檢測前咨詢部分1.1:患者預(yù)期。銷售經(jīng)理、產(chǎn)品經(jīng)理、主治醫(yī)生與患者需要充分溝 通，明確該基因檢測的目的，知道檢測技術(shù)的局限性，做好 患者的預(yù)期控制。12產(chǎn)品選擇。對于基因檢測產(chǎn)品來說， 產(chǎn)品選擇幾乎等同于檢測基因的選擇。哪些基因需要強(qiáng)行檢 測、哪些基因推薦檢測、哪些基因有一定的檢測價(jià)值，這些 需要闡述清楚。最后，根據(jù)患者的經(jīng)濟(jì)情況與病情，綜合選 擇（這

5、是理想狀況）。實(shí)際操作過程中，銷售經(jīng)理往往會(huì)以 經(jīng)濟(jì)利益為導(dǎo)向。1.3:臨床信息?；颊叩呐R床信息對于基因 檢測報(bào)告者有重要意義，信息掌握越全面報(bào)告越個(gè)性化，咨 詢解讀也更有針對性。因此，完整詳實(shí)的臨床申請單需要提 供。程序二：實(shí)驗(yàn)部分2.1:樣本類型。需要明確一點(diǎn)，能夠運(yùn)用無創(chuàng)的盡量用無創(chuàng) （唾液與血液），因?yàn)闆]有一個(gè)患者希望無緣無故的在自己身上打洞。固體：手術(shù)樣本，穿刺樣本，石蠟包埋組織，石 蠟切片組織；液體：全血，血清 血細(xì)胞，胸水，腹水，唾 液。1）手術(shù)樣本：（腫瘤組織A 50mg,癌旁正常組織n 25mg, 收到組織后立即用至少 5倍體積的10%中性福爾馬林固定液 固定），切片25張以

6、上，厚度5腫瘤細(xì)胞占比A 50%,壞死組織區(qū)域2）穿刺樣本：穿刺一針以上，腫瘤細(xì)胞占比 >50%,壞死組織區(qū)域 3）石蠟包埋組織：常溫保存運(yùn)輸即 可，最好是1年以內(nèi)。4）石蠟切片組織：常溫保存運(yùn)輸即可， 最好是6周以內(nèi)。5）全血：6ml-10ml for NGS （Streck管，含 有保存液，負(fù)壓真空抽滿），輕輕垂直平面90旋轉(zhuǎn)10次， 6-25C （常溫）運(yùn)輸，3 （7）日內(nèi)送達(dá)，可用干冰/制熱劑制 造維持環(huán)境溫度。6）血漿 血細(xì)胞 （普通試管）：抽血后2h 內(nèi)將全血4 c 1600g離心10min,分別收集上清和沉淀至離心管中；上清再 4 C 16000g離心10min,收集上清血

7、漿轉(zhuǎn) 移至15mL離心管中。血漿 血細(xì)胞樣品，均封口膜封口， 干冰運(yùn)輸。7）胸水：8）腹水：這兩個(gè)情況比較少，至少我 們公司很少遇到這樣的樣本。22質(zhì)控。血液樣本是否合格，是否可以進(jìn)行測序上機(jī)，樣本質(zhì)量怎么樣？安捷倫 2100生物 分析儀或者4200 TapeStation核酸分析儀，通過 DNA完整值（DIN ）來數(shù)字化基因組 DNA的完整性。如果不用這些儀 器，可以通過跑膠來實(shí)現(xiàn)這一步。質(zhì)控不合格，只有重新采 樣。標(biāo)準(zhǔn)流程只需要 0.1-1© DNA , DNA的OD 260/280在 1.8-2.0之間，RNA的RIN值A(chǔ) 8.0。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只要 RIN 值大于7,就可以獲得

8、比較滿意的結(jié)果。（RIN : RNA完整值）。 總的來說，質(zhì)控兩個(gè)指標(biāo)：1）足夠的DNA量；2）完整的 DNA基因組。這個(gè)步驟在構(gòu)建文庫后上機(jī)測序前完成。2.3:文庫構(gòu)建。簡而言之，獲取足夠量的/目的的/前期適合上機(jī)測序而標(biāo)準(zhǔn)處理的 DNA o其程序主要有：片段化，連接， 擴(kuò)增。1）片段化：我們總不能直接將那么長的DNA去測序吧，測序儀就只能一次測幾百bp的DNA ,超聲波片段化等方法，獲得DNA片段為正態(tài)分布200-500bp,通過一定方法（切割瓊脂糖凝膠電泳條帶）選擇所需長度的DNA片段（150-200bp）,其它的片段就扔了（不影響覆蓋范圍）。2）末端修補(bǔ)：上面的方法（物理方法）片段化的

9、DNA , 一般來說兩端都被破壞了，不再是平平整整的了，而后續(xù)步驟需要在兩端加測序接頭，所以我們得先把這個(gè)破壞的兩端修補(bǔ)好。修補(bǔ)所需三種酶：5 '端延伸的酶，5'端連接的酶，3 '端延伸的酶。3） 3'端加A:片段化且兩端修補(bǔ)好的 DNA , 3 '端加上一個(gè)堿基 A ,而下一步驟的連接接頭 3'端有一個(gè) 堿基T,這樣就實(shí)現(xiàn)了堿基互補(bǔ)而連接起來了。這樣做還有 以下幾個(gè)原因：提供連接效率；防止接頭與DNA片段多種方向連接；減少接頭之間的連接。值得一提的是1） 2） 3）的步驟可以用 WGS Framentation Mix搞定。4）兩端加接頭： 首

10、先明確接頭3 '端有一個(gè)突生的堿基 T,插入片段3'端有 一個(gè)突生的堿基 A;其次，這個(gè)工序是在插入片段兩端加入 東西；這個(gè)東西包括以下幾個(gè)部分：測序接頭（P5, P7;測序時(shí)用于與種植在 Flow Cell上的序列堿基互補(bǔ)配對用）， Barcode（用于標(biāo)識(shí)該條 DNA片段屬于哪個(gè)樣本，4個(gè)堿基）， 單分子編碼序列（Index,用于識(shí)別是哪條 DNA片段，12個(gè) 隨機(jī)堿基）；其中Y型的序列是已經(jīng)商業(yè)化的試劑盒。5） PCR富集：如果樣本不夠，那么我們就需要擴(kuò)增它才能上機(jī)測序， 這就是該環(huán)節(jié)存在的必要。由于每個(gè)經(jīng)4）處理的片段兩端都有P5與P7,因此PCR引物只需設(shè)計(jì)與它們配對

11、的就行了。 如果樣本足夠，這一步就省了唄。6）文庫定量：這里才應(yīng)該是質(zhì)控，也就是2.2的步驟。7）基因捕獲：我們只將需要 的DNA片段去測序，不需要的去測不是浪費(fèi)錢嗎？于是在 測序之前，我們就用這個(gè)工序?qū)⒛康腄NA挑選由來（為什么要捕獲）；目前目標(biāo)序列捕獲方法有 3種，NimbleGesn Sequence Capture array Agilent SureSelect DNA Capture Array, Agilent SureSelect Target Enrichment System 值得注意的是不 同捕獲方法可能測序儀器有不同的要求（捕獲的方法有哪 些；羅氏和安捷倫）；我們捕獲的

12、探針設(shè)計(jì)可以自己設(shè)計(jì)， 初步設(shè)計(jì)，需要檢測的位點(diǎn)提交到商業(yè)公司，真正的設(shè)計(jì)還 是需要專業(yè)的商業(yè)公司來干（捕獲探針的由來）；例如目標(biāo)區(qū)域?yàn)?00Kb,好的探針是100%覆蓋這100Kb,而有的商業(yè) 公司達(dá)不到，只能覆蓋到97%,那么意味著有3%的區(qū)域捕獲不到，更談不上對這些區(qū)域測序了，所以覆蓋率很重要； 對于這100Kb的目標(biāo)片段，前10Kb探針捕獲了 100個(gè)片段, 第10Kb-20Kb的探針捕獲了 10個(gè)片段，那么這樣的話就是 均一性不好，最終可能會(huì)得由結(jié)論 10Kb-20Kb這一段突變頻 率過高/過低，因此均一性很重要；如果一個(gè)探針設(shè)計(jì)由來 想捕獲目標(biāo)片段，卻捕獲到了別的垃圾片段，我們還對

13、它測 序，這不是浪費(fèi)錢嗎？所以，探針特異性很重要。（好的捕獲是怎么樣的）。8） PCR擴(kuò)增：PCR再次擴(kuò)增捕獲的 DNA 片段，上機(jī)前再一次加足樣本量。9）文庫再次定量：相當(dāng)于上機(jī)前的再一次質(zhì)量檢測。2.4:上機(jī)測序。通過前面的步驟，我們從患者身上的一塊腫瘤組織或者一管血開始，然后 分離提純我們需要的基因組DNA ,再把這些DNA打成小片段，然后再在這些 DNA小片段兩頭接上識(shí)別標(biāo)記和測序接頭，最后再通過基因捕獲技術(shù)篩選由目的DNA ,根據(jù)需求PCR擴(kuò)增。通過這么多步驟，就是為上機(jī)測序做準(zhǔn)備。一句 話，上機(jī)測序的過程就是讀取這些DNA小片段的序列，如ATCTGGCTT.(160bp),這樣萬級(jí)

14、、億級(jí)的DNA片段個(gè)數(shù)。 至于這些DNA片段是怎么樣在機(jī)器上被測由來的，這又是 個(gè)大問題，我在液體活檢有哪些這篇文章有簡要說明， 這里不管它，畢竟世界上那么多事情，哪有想管就管得了的 呢？至此，實(shí)驗(yàn)部分結(jié)束。程序三：信息分析部分3.1:下機(jī)數(shù)據(jù)識(shí)別。數(shù)以億計(jì)的 DNA小片段，一大餅，雜 亂無章，很多情況是幾十個(gè)患者的樣本都一起的，更亂。一 句話，這個(gè)步驟將屬于不同患者的DNA小片段放進(jìn)不同的盒子里，分類。這是怎么實(shí)現(xiàn)的呢？我們在構(gòu)建文庫的加接 頭步驟時(shí)，同時(shí)加上了 Barcode序列，同一個(gè)患者使用同一 個(gè)Barcode,不同的患者使用不同的 Barcode,那么計(jì)算機(jī)通 過這個(gè)Barcode

15、輕松識(shí)別然后放進(jìn)不同的盒子里。值得注意 的是，DNA是兩條鏈，有的公司會(huì)兩條鏈同時(shí)測序以增加 準(zhǔn)確性，因此一個(gè) A患者會(huì)有兩個(gè)盒子屬于他(A1:正義鏈的DNA小片段集合；A2:反義鏈的DNA小片段集合)。還 值得注意的是，如果樣本是血液，有的公司會(huì)同時(shí)檢測 cfDNA和gDNA ,那么一個(gè)B患者就會(huì)有四個(gè)盒子屬于他(B1, B2, B3, B4)。3.2:圖像轉(zhuǎn)換。下機(jī)的時(shí)候那些 DNA片段最初其實(shí)是圖像格式的，例如紅色表示堿基A ,綠色表示堿基T,需要用專業(yè)工具將圖像格式轉(zhuǎn)換成序列。Illumina公司提供專業(yè)軟件，只需對其調(diào)用就可以完成這一步驟。一 句話：圖像轉(zhuǎn)換成序列。3.3:比對到基因

16、圖上。將這些上以 億級(jí)的DNA小片段歸位，如果你是 1號(hào)染色體的第500位 到第650位之間的片段，就把你歸到這個(gè)位置下面。當(dāng)然，1號(hào)染色體上的這個(gè)位置下面一般不止一條DNA片段，畢竟有一個(gè)概念叫做測序深度，如果測序深度為10000,那么理論上該位置下面就應(yīng)該有10000條DNA片段。怎么控制是10000條呢？這在上機(jī)之前構(gòu)建文庫時(shí)，通過調(diào)節(jié) PCR擴(kuò)增 來實(shí)現(xiàn)。一句話：將散亂的DNA小片段比對到參考基因組上，從而實(shí)現(xiàn)它們的定位。這個(gè)參考基因組是國際權(quán)威數(shù)據(jù) 庫給由的，供給全世界所有人使用?；蚪M： /goldenPath/hg19/b

17、igZips/ ; 比 對軟件 BWA : http:/bio- ; 3.4:計(jì)算突變 頻率。假如1號(hào)染色體的500位到第650位有10000個(gè)DNA 片段，那么測序深度就真的是10000嗎？在這里需要做一個(gè)辨別，如果這10000條DNA片段有9000條是一模一樣的， 那么我們認(rèn)為這是一條 DNA片段PCR擴(kuò)增由來的，這9000 條只能算作1條，這時(shí)候有效測序深度為1001。在莫個(gè)特定的位點(diǎn)，如果這1001條DNA片段有100條發(fā)生同樣的與參 考基因組不一樣的變化，我們就認(rèn)為該點(diǎn)的突變頻率為10%。這10%的突變頻率（血液腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變?yōu)槔┮馕吨?血液中的cfDNA有10%是ctDNA ,從而反應(yīng)患者的腫瘤病 灶有一部分癌細(xì)胞發(fā)生了該突變，若有針對該位點(diǎn)的靶向 藥，那么可根據(jù)情況推薦使用。值得注意的是，如果有效測 序深度只有100,那么就有可能漏掉一些典型的突變，所以 有效測序深度足夠是非常重要的。這里有一個(gè)問題：莫個(gè)特 定位點(diǎn)的變化，怎么樣才算真正的突變呢？冷泉港實(shí)驗(yàn)室的 VarScan軟件來判定 SNV和INDEL，順便說一句要判定真正 的突變很難，國際上有不同的看法。VarScan: ; 3.5: 1）原始數(shù)據(jù)過濾； 2） 數(shù)據(jù)比對BWA; 3）