CCK8實(shí)驗(yàn)原理與步驟

1、CCK8實(shí)驗(yàn)1、在96孔板中配置100卩l(xiāng)的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 小時(shí)(37C, 5% CO2)。2、向培養(yǎng)板加入10卩l(xiāng)不同濃度的待測物質(zhì)。3、 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如：6、12、24或48 小時(shí))。4、向每孔加入10卩l(xiāng) CCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們 會影響OD值的讀數(shù))。5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。7、若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10卩l(xiāng) 0.1M的HCL溶 液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。 24 小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。PS: 1% w/v

2、 SDS溶液配制方法：組份濃度：10% (W/V)SDS配制量：100ml配制方法：1稱量10g高純度的SDS置于100-200ml燒杯中，加入約80ml的去離子水，68 C加入溶解2. 滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.23. 將溶液定容至100ml后，室溫保存。注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換 新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的 培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更 換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可?；盍τ?jì)算：細(xì)胞活力* （%） =A（加藥）-A （空白）/A （0加藥）-A （空白）X100A （加

3、藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A （空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度A （0加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力CCK-8可以用于細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8，它在電子載體（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的 脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可以用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒 性分析。其使用方法在增殖和毒性試驗(yàn)中有所區(qū)別：細(xì)胞增殖試驗(yàn)：1. 接種細(xì)胞懸液100微升于96孔板，預(yù)先置于37度,5%C

4、O2飽和濕度 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2. 在每孔內(nèi)加入10微升的CCK-8試劑.3. 把培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱內(nèi)1-4小時(shí)（根據(jù)細(xì)胞類型其時(shí)間有所不同）4在450nm波長處測定吸光值，參比波長為600nm或以上波長.毒性分析試驗(yàn)：1接種100微升細(xì)胞懸液（5000個(gè)/孔）于96孔板2. 預(yù)先放置37度5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)3. 加入10微升不同濃度的毒性物質(zhì)到孔內(nèi)培養(yǎng)基4. 在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí).5. 在每孔內(nèi)加入10微升CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時(shí)；6在450nm波長處測定吸光值，參比波長為600nm或以上.以上步驟摘自CCK-8的說明書，由于涉及到某些原因，我省去了上面的一些推

5、銷用語）（內(nèi)有標(biāo)價(jià),1245元/1000孔）寫在前面：一直都像個(gè)新手，從未老道過。所有新手的迷茫與無奈我最能體會?？吹綀@子里有一些同學(xué)在問有關(guān) CCK8試驗(yàn)的事情，當(dāng)初我也和他們 一樣，像個(gè)被蜘蛛絲纏住頭的迷茫蒼蠅一頭扎進(jìn)園子里，期待能找到些解決謎團(tuán)的只言片語。希望我寫的這些非專業(yè)文字能夠幫助那些在 實(shí)驗(yàn)室里沒有前行者指點(diǎn)迷津的筒子們。當(dāng)然仁者見仁智者見智，我 寫的只是個(gè)人實(shí)驗(yàn)心得，僅供參考。歡迎大家拍磚共同進(jìn)步。實(shí)驗(yàn)是 簡單的，道路是曲折的，時(shí)間就是用來浪費(fèi)的，科研就是自娛自樂使 勁折騰。我沒有做過MTT實(shí)驗(yàn)，但其實(shí)原理及目的都是一樣的（反應(yīng)機(jī)理不 一樣）。都說CCK8簡單點(diǎn)而且數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，

6、所以就用了這個(gè)試劑盒。CCK8的說明書大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問題都有提 到。而且說明書里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價(jià) 值，因?yàn)槟鞘欠磸?fù)驗(yàn)證過的最佳數(shù)值。但無論如何，做這個(gè)試驗(yàn)一定 要摸條件。你就算再懶，這個(gè)懶不得，否則你都只是在做無用功。以 下言論全部以細(xì)胞毒性試驗(yàn)為前提，如果你做的是促進(jìn)細(xì)胞生長的藥 物的藥效實(shí)驗(yàn)?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。摸條件包括1、種板數(shù)；2、種板后細(xì)胞的貼壁生長時(shí)間；3、加藥后 的孵育時(shí)間；4、CCK8試劑加入量；5、CCK8試劑加入后細(xì)胞孵育 時(shí)間?？雌饋砗芏?，其實(shí)這就是一個(gè)實(shí)驗(yàn)。而且都是種的空白板，也 就是不加藥物，只加細(xì)胞和 CCK8。1、種板數(shù)：

7、這個(gè)要查文獻(xiàn)，看你所用細(xì)胞別人有無做過，把范圍大 致找出。記住還要參考說明書，這個(gè)很重要。然后稀釋一系列濃度種 板。首先你要觀察多長時(shí)間細(xì)胞可貼壁完全， 一般貼壁生長24小時(shí)。 然后還有在你的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長情況。比如我擬 定考察4天的時(shí)間，那么在4天內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長？ 因?yàn)槊繅K板都會設(shè)置對照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+CCK8，這個(gè) 數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試驗(yàn)最佳0D值在1.0附近，所以這 個(gè)最大數(shù)值最好能控制在1.0左右。我的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)是不要讓細(xì)胞長滿， 一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了， 對藥物能否順利進(jìn)入細(xì)胞有 影響此為其一，其二生長不均勻易導(dǎo)致孔

8、間 0D值數(shù)據(jù)偏差大，而且 OD值也很大。2、貼壁生長的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長 24h 了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞 已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時(shí)間對自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便。 沒人 愿意大半夜爬起來做實(shí)驗(yàn)吧。3、加藥后的孵育時(shí)間，我的實(shí)驗(yàn)摸了 3個(gè)時(shí)間，24h, 48h, 72h。然 后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇 最好的時(shí)間。太長了就沒有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可 想而知了。4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個(gè)問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞 懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液

9、=200微升，CCK8 不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本人最終采用的是后 者。5、 cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著時(shí)間的增加， OD值就會增大。 總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了 0.5h、1.0h、2.0h。再說一下關(guān)于種板設(shè)置問題。眾所周知周圍一圈孔因?yàn)檫吘壭?yīng)都是 不用來做實(shí)驗(yàn)的。一般每組樣品我會設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，得到的OD值去 掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會省很多力氣，但是也會增大組內(nèi)誤差。這個(gè)只有通過校正移液槍和選用最適槍頭 了。做這個(gè)實(shí)驗(yàn)我想大家遇到的最大問題應(yīng)該是數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，組內(nèi)數(shù)據(jù)偏 差大。講了很多怎樣摸條件，其實(shí)就一個(gè)原則，把0D

10、值控制在1.0左右。數(shù)據(jù)不穩(wěn)定也只能通過增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來彌補(bǔ)。還 有實(shí)驗(yàn)操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。能力有限，表達(dá)不清的大家湊合著看看吧。有疑問的歡迎大家留言討 論，我們的目標(biāo)是共同進(jìn)步，哈哈。補(bǔ)充：謝謝大家的熱烈討論。突然想起用酶標(biāo)儀檢測的時(shí)候還有一些 細(xì)節(jié)問題，園子里也有前輩提過。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡， 就用吸耳球吹掉，氣泡會很影響檢測結(jié)果。樣品板要擦拭干凈，當(dāng)然 了，蓋子一定要記得拿掉啊補(bǔ)充說明：這幾天有同學(xué)提出了一個(gè)問題，這個(gè)問題非常好也非常關(guān) 鍵：將0D值控制在1.0這個(gè)說法是否有依據(jù)？這里我還是想提醒大家一定要認(rèn)真閱讀試劑盒的說明書，試想一個(gè)試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可需要經(jīng)過多少試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證。我購買的是同仁化學(xué)研究所的 CCK8試劑盒，說明書的P7Q23: OD 值在什么范圍比較合適？答：一般情況下 0D值在0.1-2.0都可以， 在1.0附近比較好。再說到自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，酶標(biāo)儀的原理其實(shí)和紫外分光光度計(jì)是一樣 的，所以UV上很多減小誤差的注意事項(xiàng)在酶標(biāo)儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為