研究生蛋白質(zhì)作業(yè)

1、 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展和基因組時代的到來，蛋白隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展和基因組時代的到來，蛋白質(zhì)純化技術(shù)也面臨著新的挑戰(zhàn)質(zhì)純化技術(shù)也面臨著新的挑戰(zhàn)! ! 目前，沉淀、層析、離心和電泳等是蛋白質(zhì)純化的主要目前，沉淀、層析、離心和電泳等是蛋白質(zhì)純化的主要方法，其中方法，其中色譜法色譜法應(yīng)用較為廣泛應(yīng)用較為廣泛。固定化金屬親和色譜（固定化金屬親和色譜（IMACIMAC） 是一種利用過渡金屬離子與氨基酸殘基的配位作用，選是一種利用過渡金屬離子與氨基酸殘基的配位作用，選擇性地分離對這些過渡金屬離子具有親和能力的蛋白質(zhì)的一擇性地分離對這些過渡金屬離子具有親和能力的蛋白質(zhì)的一種分離純化技術(shù)種分離純化技術(shù)

2、! ! IMAC IMAC分離純化蛋白質(zhì)雖已得到廣泛的應(yīng)用，但其純化蛋分離純化蛋白質(zhì)雖已得到廣泛的應(yīng)用，但其純化蛋白時通常需要經(jīng)歷蛋白樣品前處理。白時通常需要經(jīng)歷蛋白樣品前處理。費時費力費時費力，難于大規(guī)模，難于大規(guī)模地對多個蛋白質(zhì)樣品進行分離純化。地對多個蛋白質(zhì)樣品進行分離純化。固定化金屬親和磁性納米粒子（固定化金屬親和磁性納米粒子（IMANIMAN） 磁性納米粒子（磁性納米粒子（MNPsMNPs）的應(yīng)用給蛋白質(zhì)的分離純化帶的應(yīng)用給蛋白質(zhì)的分離純化帶來了巨大的應(yīng)用前景。將螯合劑通過化學(xué)鍵連接在來了巨大的應(yīng)用前景。將螯合劑通過化學(xué)鍵連接在MNPsMNPs上，上，再螯合上金屬離子，即可制備出再螯

3、合上金屬離子，即可制備出固定化金屬親和磁性納米固定化金屬親和磁性納米粒子（粒子（IMANIMAN）。IMANIMAN具有磁響應(yīng)性，吸附目標(biāo)蛋白質(zhì)后在具有磁響應(yīng)性，吸附目標(biāo)蛋白質(zhì)后在外磁場作用下即可與原體系分離，再經(jīng)洗脫即可將蛋白質(zhì)外磁場作用下即可與原體系分離，再經(jīng)洗脫即可將蛋白質(zhì)與與IMANIMAN分離而得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。用分離而得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。用IMANIMAN分離純化蛋白質(zhì)較分離純化蛋白質(zhì)較IMACIMAC省去了過濾離心等復(fù)雜的樣品前處理和裝柱等步驟，省去了過濾離心等復(fù)雜的樣品前處理和裝柱等步驟，操作簡單、快速，非常適用于多種蛋白質(zhì)樣品的分離純化，操作簡單、快速，非常適用于多種蛋白質(zhì)樣品的分

4、離純化，是一種具有較好發(fā)展前景的分離純化方法。是一種具有較好發(fā)展前景的分離純化方法。 IMANIMAN是是IMACIMAC的一個重要改進，它既具有親和蛋白質(zhì)的的一個重要改進，它既具有親和蛋白質(zhì)的能力又具有磁響應(yīng)性。能力又具有磁響應(yīng)性。IMANIMAN主要由主要由磁性納米粒子螯合劑磁性納米粒子螯合劑和和金屬離子金屬離子組成，其組成的不同或蛋白質(zhì)標(biāo)簽的差異都會影組成，其組成的不同或蛋白質(zhì)標(biāo)簽的差異都會影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化效果。響目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化效果。 MNPs MNPs比一般微米尺寸的脂質(zhì)或商業(yè)磁珠具有更高的比一般微米尺寸的脂質(zhì)或商業(yè)磁珠具有更高的表面表面積與體積比積與體積比，生物相容性生物相容性

5、好，具有較高的好，具有較高的結(jié)合率結(jié)合率和和儲熱能儲熱能力力；其大小為納米尺寸，因而可以快速地移動并易于進入；其大小為納米尺寸，因而可以快速地移動并易于進入細胞；它的磁可控聚集行為使它能夠被固定到固體支持物細胞；它的磁可控聚集行為使它能夠被固定到固體支持物上并被進一步使用，因而具有很大的應(yīng)用價值上并被進一步使用，因而具有很大的應(yīng)用價值! !在在IMANIMAN中，中，這種具有金屬螯合能力的亞微米尺寸的磁鐵礦等磁性納米這種具有金屬螯合能力的亞微米尺寸的磁鐵礦等磁性納米材料一般被稱為磁性基質(zhì)材料一般被稱為磁性基質(zhì)! !當(dāng)磁性納米材料作為基質(zhì)時需要當(dāng)磁性納米材料作為基質(zhì)時需要對對MNPsMNPs表面

6、進行特定的修飾，以增加它的可溶性、分散性表面進行特定的修飾，以增加它的可溶性、分散性并使其易于與其它物質(zhì)連接，從而提高并使其易于與其它物質(zhì)連接，從而提高IMANIMAN分離純化蛋白分離純化蛋白質(zhì)的效率。質(zhì)的效率。 在分離純化蛋白質(zhì)中，常用于螯合金屬離子的螯合劑有：在分離純化蛋白質(zhì)中，常用于螯合金屬離子的螯合劑有：三齒配體亞氨基二乙酸、四齒配體次氮基三乙酸、五齒配三齒配體亞氨基二乙酸、四齒配體次氮基三乙酸、五齒配體三乙二胺、羧甲基天冬氨酸等。目前，常用的螯合劑是體三乙二胺、羧甲基天冬氨酸等。目前，常用的螯合劑是三齒配體的三齒配體的IDAIDA和和四齒配體的四齒配體的NTANTA。 在在IMANI

7、MAN蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)中，不同金屬離子可與不同蛋白蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)中，不同金屬離子可與不同蛋白質(zhì)相互作用，在某種意義上，金屬離子可直接決定蛋白質(zhì)質(zhì)相互作用，在某種意義上，金屬離子可直接決定蛋白質(zhì)分離純化的效果分離純化的效果! ! IMAN IMAN主要是利用蛋白質(zhì)對金屬螯合絡(luò)合物上金屬離子主要是利用蛋白質(zhì)對金屬螯合絡(luò)合物上金屬離子親親和性和性的不同來達到分離的目的的不同來達到分離的目的! !其中，金屬螯合物的其中，金屬螯合物的穩(wěn)定性穩(wěn)定性對分離純化的效果有很大影響，此外，蛋白質(zhì)表面配位氨對分離純化的效果有很大影響，此外，蛋白質(zhì)表面配位氨基酸的類型、數(shù)目、離解常數(shù)和空間取向等，也是影響金基酸的類型、

8、數(shù)目、離解常數(shù)和空間取向等，也是影響金屬螯合物穩(wěn)定性的重要因素屬螯合物穩(wěn)定性的重要因素! !通常情況下，蛋白質(zhì)表面通常情況下，蛋白質(zhì)表面配位配位氨基酸數(shù)目氨基酸數(shù)目越多，越多，離解常數(shù)離解常數(shù)越大，配位原子中越大，配位原子中孤對電子取孤對電子取向向與金屬離子中與金屬離子中空價電子軌道空價電子軌道伸展方向越一致，則蛋白質(zhì)伸展方向越一致，則蛋白質(zhì)與金屬螯合配體越容易成鍵。與金屬螯合配體越容易成鍵。 依據(jù)依據(jù) IMANIMAN分離純化蛋白質(zhì)的原理，針對不同蛋白質(zhì)的分分離純化蛋白質(zhì)的原理，針對不同蛋白質(zhì)的分離純化，只有當(dāng)組成離純化，只有當(dāng)組成 IMANIMAN的磁性基質(zhì)修飾、螯合劑和金屬的磁性基質(zhì)修飾

9、、螯合劑和金屬離子選擇適當(dāng)時，才能得到較理想的效果離子選擇適當(dāng)時，才能得到較理想的效果! ! 磁性基質(zhì)應(yīng)選用具有高磁響應(yīng)性的磁性納米材料，為磁性基質(zhì)應(yīng)選用具有高磁響應(yīng)性的磁性納米材料，為提高其利用效率，應(yīng)對不同磁性基質(zhì)進行不同的修飾提高其利用效率，應(yīng)對不同磁性基質(zhì)進行不同的修飾! !修飾修飾方式主要根據(jù)方式主要根據(jù)螯合劑的類型螯合劑的類型來確定，如：當(dāng)要連接磁性基來確定，如：當(dāng)要連接磁性基質(zhì)和含巰基的螯合劑時，可在質(zhì)和含巰基的螯合劑時，可在MNPsMNPs表面包覆一層金、銀等表面包覆一層金、銀等貴金屬，利用這些貴金屬與巰基的特異性結(jié)合來實現(xiàn)。貴金屬，利用這些貴金屬與巰基的特異性結(jié)合來實現(xiàn)。 螯

10、合劑的選擇要同時保證配位亞基和結(jié)合蛋白質(zhì)配體的螯合劑的選擇要同時保證配位亞基和結(jié)合蛋白質(zhì)配體的剩余配位基的數(shù)目螯合劑與金屬離子的結(jié)合能力取決于配剩余配位基的數(shù)目螯合劑與金屬離子的結(jié)合能力取決于配位亞基的多少，但配位亞基越多，結(jié)合蛋白質(zhì)的能力卻不位亞基的多少，但配位亞基越多，結(jié)合蛋白質(zhì)的能力卻不一定強，因為這些配位基不僅要保證螯合劑形成穩(wěn)定的一定強，因為這些配位基不僅要保證螯合劑形成穩(wěn)定的螯螯合物合物，而且還要保證有剩余的配位基來結(jié)合蛋白質(zhì)配體。，而且還要保證有剩余的配位基來結(jié)合蛋白質(zhì)配體。 在金屬離子選擇過程中，金屬離子對蛋白質(zhì)的親和力及在金屬離子選擇過程中，金屬離子對蛋白質(zhì)的親和力及吸附量并

11、不能完全代表分離效果的優(yōu)劣，而對蛋白質(zhì)的吸附量并不能完全代表分離效果的優(yōu)劣，而對蛋白質(zhì)的選選擇性純化擇性純化和高的回收率才是選擇金屬離子的關(guān)鍵。和高的回收率才是選擇金屬離子的關(guān)鍵。IMANIMAN在蛋白質(zhì)分離純化中使用廣泛且效果較好，但隨在蛋白質(zhì)分離純化中使用廣泛且效果較好，但隨著蛋白質(zhì)分離純化要求的不斷提高，利用著蛋白質(zhì)分離純化要求的不斷提高，利用IMANIMAN純化蛋白的純化蛋白的方法也在不斷改進完善，近年來，方法也在不斷改進完善，近年來，IMANIMAN的改進方式主要有的改進方式主要有利用利用不同的中間體不同的中間體和針對所要分離純化的和針對所要分離純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白質(zhì)所進所進行的

12、修飾，以及采用行的修飾，以及采用多價螯合劑多價螯合劑的策略。的策略。 IMAN IMAN純化蛋白質(zhì)的效果不僅取決于它們間的特殊相互純化蛋白質(zhì)的效果不僅取決于它們間的特殊相互作用作用 （如蛋白質(zhì)表面暴露的組氨酸組與金屬離子間的協(xié)調(diào)（如蛋白質(zhì)表面暴露的組氨酸組與金屬離子間的協(xié)調(diào)作用作用 ）還與一些）還與一些非特異性相互作用非特異性相互作用（靜電作用和疏水作（靜電作用和疏水作用用 ）有關(guān)，而由這種非特異性相互作用引起的非特異性吸）有關(guān)，而由這種非特異性相互作用引起的非特異性吸附是蛋白質(zhì)純化中最為顯著的缺點。附是蛋白質(zhì)純化中最為顯著的缺點。 為了有效地捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)，以合適的中間體（巰基、為了有效地捕

13、獲目標(biāo)蛋白質(zhì)，以合適的中間體（巰基、多巴胺或其他）來修飾多巴胺或其他）來修飾MNPsMNPs的表面并抑制非特異性蛋白的的表面并抑制非特異性蛋白的吸附是很有必要的，對吸附是很有必要的，對MNPsMNPs的不斷修飾和改進，使得的不斷修飾和改進，使得IMANIMAN在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用更為廣泛在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用更為廣泛! !巰基能與金屬巰基能與金屬AuAu（金）、（金）、AgAg、PtPt（鉑）和（鉑）和FeFe等穩(wěn)定結(jié)合，等穩(wěn)定結(jié)合，故表面含有此類金屬的故表面含有此類金屬的MNPsMNPs均能與巰基化的均能與巰基化的螯合劑偶聯(lián)螯合劑偶聯(lián)。目前研究較多的是金納米粒子與巰基的結(jié)合，已經(jīng)成功制目前研究

14、較多的是金納米粒子與巰基的結(jié)合，已經(jīng)成功制備出備出核殼型磁性金納米復(fù)合材料核殼型磁性金納米復(fù)合材料，并廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥，并廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。生物功能性納米粒子對標(biāo)簽蛋白具有很強的親和力，領(lǐng)域。生物功能性納米粒子對標(biāo)簽蛋白具有很強的親和力，適合于復(fù)雜樣品中目標(biāo)蛋白的濃縮、純化和檢測，此方法適合于復(fù)雜樣品中目標(biāo)蛋白的濃縮、純化和檢測，此方法簡便，快速，成本低，不需要樣品預(yù)處理，被使用后的粒簡便，快速，成本低，不需要樣品預(yù)處理，被使用后的粒子經(jīng)過子經(jīng)過EDTAEDTA和和NiClNiCl2 2處理后可重復(fù)使用。處理后可重復(fù)使用。多巴胺（多巴胺（DADA）是一種二齒烯二醇配體，其苯環(huán)上兩個鄰）

15、是一種二齒烯二醇配體，其苯環(huán)上兩個鄰位羥基可與位羥基可與MNPsMNPs表面的親氧硬酸類金屬離子結(jié)合，并通過表面的親氧硬酸類金屬離子結(jié)合，并通過DADA配體交換過程介導(dǎo)配體交換過程介導(dǎo)MNPsMNPs的磁性增加，的磁性增加，DADA螯合上螯合上NTANTA等配體等配體后，可與氧化鐵納米粒子或殼型納米粒子偶聯(lián)制得后，可與氧化鐵納米粒子或殼型納米粒子偶聯(lián)制得新的功新的功能性能性MNPsMNPs，它們在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。，它們在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 MNPs MNPs表面進行氨基化或羧基化修飾后，與表面進行氨基化或羧基化修飾后，與NTANTA衍生物及衍生物及其它配體

16、通過羧基或氨基生成其它配體通過羧基或氨基生成酰胺鍵偶聯(lián)酰胺鍵偶聯(lián), ,這種方式在螯合這種方式在螯合劑的偶聯(lián)中也被廣泛使用。劑的偶聯(lián)中也被廣泛使用。MNPsMNPs表面伯胺可與戊二醛以共表面伯胺可與戊二醛以共價鍵相聯(lián)形成一個功能化磁性納米粒子，螯合有價鍵相聯(lián)形成一個功能化磁性納米粒子，螯合有NiNi2- 2- 的的NTANTA再與之共價結(jié)合形成功能性納米粒子再與之共價結(jié)合形成功能性納米粒子FeFe3 3O O4 4 - -Ni-NTA Ni-NTA 改性的改性的超順磁性超順磁性FeFe3 3O O4 4納米顆粒能夠從粗細胞裂解物中，利用納米顆粒能夠從粗細胞裂解物中，利用NiNi2-2-上上剩余的

17、兩個結(jié)合位點來親和綁定標(biāo)簽蛋白，以達到特異性剩余的兩個結(jié)合位點來親和綁定標(biāo)簽蛋白，以達到特異性分離純化目的蛋白的目的。分離純化目的蛋白的目的。 MNPs MNPs的修飾方式及螯合劑種類隨純化的目的蛋白的不同的修飾方式及螯合劑種類隨純化的目的蛋白的不同而不同而不同! !目前已有多種目前已有多種 MNPsMNPs修飾方式對牛血清蛋白進行分修飾方式對牛血清蛋白進行分離純化。通過超順磁性羧甲基殼聚糖離純化。通過超順磁性羧甲基殼聚糖 MNPsMNPs與與 CuCu2+2+或或ZnZn2+2+溶溶液化學(xué)共沉淀得到了一種液化學(xué)共沉淀得到了一種新型磁性納米粒子新型磁性納米粒子! !這類粒子不僅這類粒子不僅可用

18、于牛血清白蛋白的分離，還可分離胰蛋白酶，且對酶可用于牛血清白蛋白的分離，還可分離胰蛋白酶，且對酶的活性沒有明顯的負面影響，分離效率高，在固定和穩(wěn)定的活性沒有明顯的負面影響，分離效率高，在固定和穩(wěn)定胰蛋白酶方面具有潛在的應(yīng)用價值胰蛋白酶方面具有潛在的應(yīng)用價值。 除了對除了對 MNPsMNPs進行修飾外，螯合劑的進行修飾外，螯合劑的多價策略多價策略也可以通也可以通過增加與目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用來加強蛋白質(zhì)的分離純化過增加與目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用來加強蛋白質(zhì)的分離純化效果效果! ! 另外，通過對一些多價螯合劑磁頭（如雙另外，通過對一些多價螯合劑磁頭（如雙 一，三一，三 ，和，和四四 -NTA-NTA）

19、被特征化后與六聚組氨酸和十聚組氨酸目標(biāo)標(biāo)被特征化后與六聚組氨酸和十聚組氨酸目標(biāo)標(biāo)簽蛋白質(zhì)相互作用的研究發(fā)現(xiàn)：多價簽蛋白質(zhì)相互作用的研究發(fā)現(xiàn)：多價 NTANTA比單比單 NTANTA對標(biāo)簽對標(biāo)簽蛋白質(zhì)有更高的結(jié)合蛋白質(zhì)有更高的結(jié)合親和力親和力，顯著提高了捕獲組氨酸標(biāo)簽，顯著提高了捕獲組氨酸標(biāo)簽蛋白的穩(wěn)定性，且隨蛋白的穩(wěn)定性，且隨NTA NTA 部分的增加，部分的增加，結(jié)合穩(wěn)定性結(jié)合穩(wěn)定性也增加也增加! ! 蛋白質(zhì)吸附主要依賴于蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)吸附主要依賴于蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基表面氨基酸殘基和金屬離和金屬離子之間子之間親和力親和力的大小。親和作用主要在金屬離子和氨基酸的大小。親和作用主要在金屬離子和氨

20、基酸殘基的咪唑基、巰基或吲哚基之間發(fā)生，以金屬離子作為殘基的咪唑基、巰基或吲哚基之間發(fā)生，以金屬離子作為受電子體、氨基酸作為給電子體的相互作用為吸附驅(qū)動力。受電子體、氨基酸作為給電子體的相互作用為吸附驅(qū)動力。在在 IMANIMAN中，影響蛋白質(zhì)分離純化的因素，除偶聯(lián)劑、螯合中，影響蛋白質(zhì)分離純化的因素，除偶聯(lián)劑、螯合劑和金屬種類外，吸附液的溫度、劑和金屬種類外，吸附液的溫度、PHPH、鹽的種類及濃度、鹽的種類及濃度、競爭性洗脫劑等，對蛋白質(zhì)的吸附也有很大影響競爭性洗脫劑等，對蛋白質(zhì)的吸附也有很大影響! !溫度溫度 溫度的改變會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中較疏水的表面溫度的改變會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中較疏水的表面暴露

21、暴露出來，出來，呈現(xiàn)較為呈現(xiàn)較為疏水疏水的現(xiàn)象。同時，蛋白質(zhì)也會因溫度過高造成的現(xiàn)象。同時，蛋白質(zhì)也會因溫度過高造成其結(jié)構(gòu)中氫鍵和二硫鍵的斷裂，失去活性其結(jié)構(gòu)中氫鍵和二硫鍵的斷裂，失去活性! !因此，對于生物因此，對于生物分離純化而言，溫度的控制相當(dāng)重要。分離純化而言，溫度的控制相當(dāng)重要。PHPH值值 溶液的溶液的 PH PH 值不但涉及緩沖體系成分的值不但涉及緩沖體系成分的親核親核行為，且對行為，且對電子給予體和受體的電子給予體和受體的性質(zhì)性質(zhì)也有影響，是蛋白質(zhì)分離純化的也有影響，是蛋白質(zhì)分離純化的影響因素之一影響因素之一! ! 隨溶液隨溶液 PHPH值的增加，固定在磁性納米粒子表面的金屬值

22、的增加，固定在磁性納米粒子表面的金屬離子與蛋白質(zhì)表面配位原子的離子與蛋白質(zhì)表面配位原子的配位作用配位作用增強，在近距離范增強，在近距離范圍內(nèi)的靜電作用增強，因而可增大蛋白質(zhì)在螯合粒子上的圍內(nèi)的靜電作用增強，因而可增大蛋白質(zhì)在螯合粒子上的保留值保留值! !在蛋白質(zhì)洗脫時，降低溶液在蛋白質(zhì)洗脫時，降低溶液PHPH值，可將蛋白質(zhì)從值，可將蛋白質(zhì)從 IMANIMAN上洗脫下來以達到上洗脫下來以達到純化純化的目的的目的! !吸附體系的吸附體系的 PH PH 值也有值也有一定的范圍，既要有利于蛋白質(zhì)的吸附又要避免蛋白質(zhì)的一定的范圍，既要有利于蛋白質(zhì)的吸附又要避免蛋白質(zhì)的變性，通?？刂圃谧冃?，通?？刂圃赑H

23、=6PH=68 8。常用磷酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩。常用磷酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液來維持反應(yīng)體系的沖液來維持反應(yīng)體系的 PHPH值值! ! 在在 IMANIMAN中，鹽種類及其濃度對蛋白質(zhì)與載體間的中，鹽種類及其濃度對蛋白質(zhì)與載體間的非特非特定性吸附力定性吸附力 （如靜電力和疏水力）有較明顯的影響（如靜電力和疏水力）有較明顯的影響! !鹽的鹽的加入使得蛋白質(zhì)與固體載體產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)，隨著鹽濃度的加入使得蛋白質(zhì)與固體載體產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)，隨著鹽濃度的增加，非特定性吸附減少的效果愈顯著，但鹽濃度過高，增加，非特定性吸附減少的效果愈顯著，但鹽濃度過高，會明顯增加蛋白質(zhì)的疏水作用力，使得非特異性吸附增會明顯增加蛋白質(zhì)的疏水作用力，使得非特異性吸附增加加!IMAN!IMAN中不同鹽類對蛋白質(zhì)的吸附強度有不同的影響，常中不同鹽類對蛋白質(zhì)的吸附強度有不同的影響，常用用較高濃度較高濃度的鹽來調(diào)節(jié)或抑制非特定性吸附。的鹽來調(diào)節(jié)或抑制非特定性吸附。 對于某些強親和性的蛋白質(zhì)吸附，其作用力是對于某些強親和性的蛋白質(zhì)吸附，其作用力是配位鍵配位鍵，降低降低PHPH值或改變離子強度都不能洗脫所吸附的蛋白質(zhì)，而值或改變離子強度都不能洗脫所吸附的