免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術

1、第三章第三章 免疫細胞的分離及其免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術表面標志檢測技術第一節(jié)第一節(jié) 免疫細胞的分離免疫細胞的分離 一、一、 外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞分離 二、二、 淋巴細胞的分離淋巴細胞的分離 三、三、 T T細胞和細胞和B B細胞的分離細胞的分離 四、四、 T T細胞亞群的分離細胞亞群的分離第二節(jié)第二節(jié) 淋巴細胞標志及亞群分類淋巴細胞標志及亞群分類 一、一、 細胞表面標志及亞群細胞表面標志及亞群 二、二、 B B細胞表面標志細胞表面標志 三、三、 NKNK細胞表面標志細胞表面標志第三節(jié)第三節(jié) 其他的免疫細胞其他的免疫細胞第四節(jié)第四節(jié) 免疫細胞表面標志的檢測及應用免疫細

2、胞表面標志的檢測及應用 一、一、免疫細胞表面標志的檢測方法免疫細胞表面標志的檢測方法 二、二、 淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義思考題思考題小結小結 第一節(jié)第一節(jié) 免疫細胞的分離免疫細胞的分離 外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞分離 淋巴細胞的分離淋巴細胞的分離 T T細胞和細胞和B B細胞的分離細胞的分離 T T細胞亞群的分離細胞亞群的分離一、外周血單個核細胞分離一、外周血單個核細胞分離 外周血單個核細胞外周血單個核細胞（peripheralmononuclearcells,PMNC）包括淋巴細胞和單核細胞包括淋巴細胞和單核細胞（monocyte）。）。 Fic

3、oll分離液法主要用于分離外周血中的單個核細分離液法主要用于分離外周血中的單個核細胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。 細胞分離基本原理細胞分離基本原理不同細胞密度不同不同細胞密度不同不同細胞表面生物學特性不同不同細胞表面生物學特性不同不同細胞表面分化抗原不同不同細胞表面分化抗原不同不同細胞密度不同不同細胞密度不同人的紅細胞密度為人的紅細胞密度為1.093 粒細胞密度為粒細胞密度為1.092 單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）的密度為單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）的密度為1.075-1.090 不同細胞密度不同不同細胞密度不同用用1.0771.077

4、0.0010.001的分層液可將細胞分離的分層液可將細胞分離 密度梯度離心密度梯度離心(Ficoll)(Ficoll)離心離心二二、淋巴細胞分離、淋巴細胞分離貼壁粘附法貼壁粘附法 吸附柱過濾法吸附柱過濾法 磁鐵吸引法磁鐵吸引法 Percoll Percoll 分離液法分離液法 （連續(xù)密度梯度離心）（連續(xù)密度梯度離心）（去單核細胞）（去單核細胞）E E花環(huán)沉降法花環(huán)沉降法 尼龍毛柱分離法尼龍毛柱分離法 三、三、T T細胞和細胞和B B細胞的分離細胞的分離四、四、T T細胞亞群的分離細胞亞群的分離 親和板結合分離法親和板結合分離法 磁性微球分離法磁性微球分離法 熒光激活細胞分離儀分離法熒光激活細胞

5、分離儀分離法 熒光激活細胞分離儀分離法熒光激活細胞分離儀分離法 磁珠大小可以選擇磁珠大小可以選擇大小免疫磁珠分離細胞的特點比較大小免疫磁珠分離細胞的特點比較 比較項目比較項目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠對細胞的影響對細胞的影響對細胞造成機械壓力，影響對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利于分離其生物學活性，不利于分離后培養(yǎng)。后培養(yǎng)。對細胞溫和，不影響分離細對細胞溫和，不影響分離細胞的后續(xù)培養(yǎng)。胞的后續(xù)培養(yǎng)。對流式細胞儀的影響對流式細胞儀的影響阻塞流式細胞儀的噴嘴，影阻塞流式細胞儀的噴嘴，影響散射光。響散射光?？芍苯由狭魇郊毎麅x檢測，可直接上流式細胞儀檢測，不影響散射光。不影響散射光。分離條件要

6、求分離條件要求技術簡單，分離可在試管中技術簡單，分離可在試管中完成。完成。需要很強的磁場來分離細胞。需要很強的磁場來分離細胞。 收率收率得率高。得率高。得率不高。得率不高。純度純度純度低。純度低。純度高。純度高。分離時間分離時間分離速度快。分離速度快。分離速度慢。分離速度慢。分離成本分離成本成本低。成本低。需要很強的磁場來分離細胞，需要很強的磁場來分離細胞，需要一次性的分離柱，不能需要一次性的分離柱，不能在普通試管進行。在普通試管進行。免疫磁珠法細胞分選過程免疫磁珠法細胞分選過程免免疫疫磁磁珠珠細細胞胞分分選選裝裝置置全自動細胞分選系統(tǒng)全自動細胞分選系統(tǒng)流式細胞分析儀流式細胞分析儀第二節(jié)第二節(jié)

7、 淋巴細胞標志及亞群分類淋巴細胞標志及亞群分類 常用于鑒定和檢測淋巴細胞表面標常用于鑒定和檢測淋巴細胞表面標志是簇分化抗原（志是簇分化抗原（Cluster of Cluster of differentiationdifferentiation，CDCD）。）。 細胞表面分化抗原（細胞表面分化抗原（CDCD抗原抗原）適用于適用于T T、B B細胞的分離細胞的分離已知已知CDCD抗原細胞亞群的分離抗原細胞亞群的分離未知未知CDCD抗原細胞亞群的分離抗原細胞亞群的分離（陰性分選）（陰性分選）一、一、T T細胞表面標志及其亞群細胞表面標志及其亞群 CD3+CD4+CD8-輔助性輔助性T細胞細胞（he

8、lpTcell,Th） CD3+CD4-CD8+細胞毒性細胞毒性T細胞細胞（cytotoxicTcell,TcorCTL） CD4+CD25+調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性T細胞細胞（regulatoryTcell,TrorTreg）二、二、B B細胞表面標志細胞表面標志 SmIgSmIg、FcFc受體、補體受體、受體、補體受體、EBEB病毒受體，部分病毒受體，部分CDCD分子是分子是B B細胞的重要表面標志，其中以細胞的重要表面標志，其中以SmIgSmIg為為B B細胞所特有，是鑒定細胞所特有，是鑒定B B細胞可靠的指標。細胞可靠的指標。 CD19/CD5CD19/CD5分子：可將分子：可將B B細胞區(qū)分為細

9、胞區(qū)分為B1B1細胞和細胞和B2B2細胞，細胞，B1B1細胞為細胞為CD19CD19和和CD5CD5雙陽性，而雙陽性，而B2B2細胞細胞僅為僅為CD19CD19陽性，陽性，B2B2細胞為通常所指的細胞為通常所指的B B細胞細胞。 三、三、NKNK細胞表面標志細胞表面標志 人類人類NK細胞表面標志主要以細胞表面標志主要以CD16、CD56來認定，臨床上將來認定，臨床上將CD3-CD56+CD16+淋巴細胞認定為淋巴細胞認定為NK細胞。細胞。T細胞及細胞及NK細胞細胞第三節(jié)第三節(jié) 其他的免疫細胞其他的免疫細胞抗原提呈類細胞表面標志抗原提呈類細胞表面標志第四節(jié)第四節(jié) 免疫細胞表面標志的檢測及應用免疫

10、細胞表面標志的檢測及應用免疫細胞表面標志的檢測方法免疫細胞表面標志的檢測方法淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義一、免疫細胞表面標志的檢測一、免疫細胞表面標志的檢測抗體致敏細胞花環(huán)法抗體致敏細胞花環(huán)法 免疫細胞化學法免疫細胞化學法 免疫熒光法免疫熒光法 流式細胞分析法流式細胞分析法 二、淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義二、淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義 淋巴細胞表面標志檢測是評價免疫功淋巴細胞表面標志檢測是評價免疫功能的重要指標。能的重要指標。 對對CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T細胞的測定，有助于免細胞的測定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植疫缺陷疾病、

11、自身免疫性疾病和移植排斥反應的監(jiān)測。排斥反應的監(jiān)測。 臨床常見疾病中的臨床常見疾病中的T淋巴細胞的變化淋巴細胞的變化思考題思考題1.1.免疫細胞都包括哪些細胞？為什么要將其分離免疫細胞都包括哪些細胞？為什么要將其分離純化？純化？2.2.淋巴細胞有哪幾類細胞？能用形態(tài)學的方法加淋巴細胞有哪幾類細胞？能用形態(tài)學的方法加以區(qū)別嗎？以區(qū)別嗎？3.3.將細胞分離的原理有哪些？各有什么特點？將細胞分離的原理有哪些？各有什么特點？4.4.形態(tài)學相同的一類細胞為什么還要分亞群？形態(tài)學相同的一類細胞為什么還要分亞群？5.T5.T細胞和細胞和B B細胞進一步區(qū)分亞群的依據(jù)是什么？細胞進一步區(qū)分亞群的依據(jù)是什么？6

12、.6.什么是細胞表面標志？其作用是什么？什么是細胞表面標志？其作用是什么？7.7.細胞表面標志的檢測方法有哪些？細胞表面標志的檢測方法有哪些？8.8.利用細胞表面標志（利用細胞表面標志（CDCD抗原）分離細胞的方法抗原）分離細胞的方法有哪幾種？有哪幾種？9.T9.T細胞、細胞、B B細胞、細胞、NKNK細胞、單核細胞的主要生物細胞、單核細胞的主要生物標志是什么？標志是什么？10.10.淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義是什么？淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義是什么？小小 結結淋巴細胞并不是功能單一的群體，但其淋巴細胞并不是功能單一的群體，但其在光學顯微鏡下的形態(tài)基本是一樣的，在光學顯微鏡下的形態(tài)基本

13、是一樣的，因此要對其進行進一步的分類和觀察就因此要對其進行進一步的分類和觀察就不能采用形態(tài)學的方法，而要依靠對其不能采用形態(tài)學的方法，而要依靠對其表面標志的檢測。常用于鑒定和檢測計表面標志的檢測。常用于鑒定和檢測計數(shù)淋巴細胞的表面標志是數(shù)淋巴細胞的表面標志是CDCD抗原。抗原。進一步區(qū)分淋巴細胞亞群可使某一類淋進一步區(qū)分淋巴細胞亞群可使某一類淋巴細胞的功能趨向一致和單一。但目前巴細胞的功能趨向一致和單一。但目前看來，還很少有只通過一個看來，還很少有只通過一個CDCD抗原就能抗原就能將某一類淋巴細胞亞群指示出來的將某一類淋巴細胞亞群指示出來的CDCD抗抗原，原，CDCD抗原指示出來的淋巴細胞亞群多抗原指示出來的淋巴細胞亞群多數(shù)都是相對特異。數(shù)都是相對特異。根據(jù)根據(jù)T T細胞的免疫效應功能和表面細胞的免疫效應功能和表面CDCD分子分子表達至少可以分為：輔助性表達至少可以分為：輔助性T T細