新城疫油苗和凍干苗疫苗的生產(chǎn)工藝流程

1、新城疫凍干疫苗生產(chǎn)工藝流程1 生產(chǎn)用毒種制備1.1毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋( 如 10-4 或 10-5 ), 尿囊腔內(nèi)接種10 日齡 SPF雞胚 , 每胚 0.1ml 。選接種后 72120 小時(shí)死亡、且病痕明顯的雞胚 , 分別收獲雞胚液 ( 尿囊液及羊水 ), 裝于滅菌容器內(nèi)。 將檢驗(yàn)無菌、 且對 1%雞紅細(xì)胞凝集價(jià) 1:640( 微量法 1:512) 的雞胚液混合 , 定量分裝于安瓿中 , 冷凍保存。注明收獲日期 , 毒種代數(shù)等。1.2毒種鑒定1.2.1病毒含量按含毒雞胚液量用滅菌生理鹽水作為10 倍系列稀釋，取10-7 、10-8 、10-9 3 個(gè)稀釋度各尿囊腔內(nèi)接種1

2、0 日 SPF雞胚 5 個(gè)，每胚 0.1ml ，置 3637繼續(xù)孵育，48 小時(shí)以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，在 48120 小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120 小時(shí)，取出所有活胚,逐個(gè)收獲雞胚液，分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)1:160( 微量法 1:128) 者判為感染，計(jì)算 EID50，每 0.1ml 病毒含量應(yīng) 10 8EID50。1.2.2純凈應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染，分別按無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 、支原體檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。1.3毒種保存在 - 15以下保存 , 應(yīng)不超過 1

3、年。1.4毒種繼代應(yīng)不超過 3 代。2制苗材料選擇選擇發(fā)育良好的911 日齡 SPF雞胚作為制苗材料。3 制苗用毒液的制備3.1 接種取生產(chǎn)用毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋( 如 10-4 或 10-5 ), 每胚尿囊腔內(nèi)接種 0.1ml ，接種后密封針孔，置3637繼續(xù)孵育，不必翻蛋。3.2孵育和觀察雞胚接種后 , 每日照蛋一次，將在60 小時(shí)前死亡的雞胚棄去。60 小時(shí)后 , 每 48 小時(shí)照蛋一次 , 死亡的雞胚隨時(shí)取出 , 直至 96 或 120 小時(shí) , 不論死亡與否 , 全部取出 , 氣室向上直立 , 置于 28冷卻。3.3收獲將冷卻424 小時(shí)的雞胚取出 , 用碘酊消毒氣室部位,

4、然后以無菌手術(shù)剝除氣室部卵殼，剪開尿囊膜，吸雞胚液, 每若干個(gè)雞胚的胚液混合為一組。收獲后的胚液置于滅菌瓶中，作好標(biāo)識，留樣后，結(jié)凍保存。在收獲胚液的同時(shí),應(yīng)逐個(gè)檢查雞胚 ,如胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者棄去不用。4 半成品檢驗(yàn)4.1無菌檢驗(yàn)經(jīng)處理過的胚液 , 每組分別取樣 , 按無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 進(jìn)行無菌檢驗(yàn) , 應(yīng)無細(xì)菌生長。4.2病毒含量測定按含毒雞胚液量用滅菌生理鹽水作為10 倍系列稀釋，取10-7 、10-8 、10-9 3 個(gè)稀釋度各尿囊腔內(nèi)接種10 日 SPF雞胚 5 個(gè)，每胚 0.1ml ，置 3637繼續(xù)孵育， 48 小時(shí)以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，在481

5、20 小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120 小時(shí)，取出所有活胚 , 逐個(gè)收獲雞胚液，分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)1:160 ( 微量法1:128) 者判為感染，計(jì)算EID50，每 0.1 ml病毒含量 >107EID50 者可用于配制疫苗。5 配苗及分裝將檢驗(yàn)合格的若干組雞胚液濾過, 混合于同一容器內(nèi), 按規(guī)定羽份 , 加一定比例的蔗糖脫脂奶粉作穩(wěn)定劑, 使其最終蔗糖含量為2.5%，脫脂奶粉含量為5%，同時(shí)加入適宜的抗生素, 充分搖勻 , 定量分裝 , 每羽份病毒含量應(yīng) 10 6 EID50。分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。6

6、成品檢驗(yàn)6.1物理性狀6.1.1外觀檢查疫苗瓶上的標(biāo)簽，打印出的羽份或頭份、生產(chǎn)批號、有效日期清晰可見、位置適當(dāng)。瓶上的鋁蓋穩(wěn)固不松動。6.1.2眼觀檢查將疫苗拿到與眼平行位置觀察呈微黃色，海綿狀疏松團(tuán)塊，然后再輕微振動，疫苗松動并與瓶壁分離，判為合格。6.1.3溶解性檢查用稀釋液注射到疫苗瓶內(nèi)，經(jīng)輕微振動，疫苗應(yīng)迅速完全溶解，無粘塊或粘團(tuán)出現(xiàn)，判為溶解性良好。6.2無菌檢驗(yàn)按無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，如有菌生長，應(yīng)進(jìn)行雜菌計(jì)數(shù)，并作病原性鑒定（按雜菌計(jì)數(shù)和病原性鑒定操作細(xì)則進(jìn)行）和禽沙門氏菌檢驗(yàn)每羽份非病原菌數(shù)應(yīng)不超過1 個(gè)（按 禽沙門氏菌檢驗(yàn)法進(jìn)行）。6.3支原體檢驗(yàn)按支原體檢驗(yàn)

7、法進(jìn)行，應(yīng)無支原體生長。6.4鑒別檢驗(yàn)6.4.1選擇發(fā)育良好的10 日齡 SPF雞胚 10 只，劃出尿囊腔接種部位。6.4.2將疫苗用無菌生理鹽水稀釋至105.0 EID50/0.1mL ，與等量抗雞新城疫病毒特異性血清混合，室溫中和1 小時(shí)后，尿囊腔接種，每胚 0.1mL。6.4.3將接種后雞胚用石蠟封孔后，置 37繼續(xù)孵育， 觀察 120 小時(shí)，在 24120小時(shí)內(nèi)應(yīng)不引起特異死亡，且至少存活8 只，雞胚液作紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，應(yīng)為陰性。6.5外源病毒檢驗(yàn)按外源病毒檢驗(yàn)法進(jìn)行。6.6安全檢驗(yàn)下列方法任擇其一。6.6.1用雞胚檢驗(yàn)將疫苗用無菌生理鹽水稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10 日齡雞胚 10只，每胚

8、 0.1ml （含 10 個(gè)使用劑量），接種后 2472 小時(shí)，雞胚死亡率應(yīng)不超過20%為合格。 如死亡率超過 20%，可用 20 個(gè)雞胚重檢 1 次，重檢結(jié)果死亡率仍超過20%，該批疫苗判為不合格。6.6.2 鼻接種用雞檢驗(yàn)用 27 日齡 SPF雛雞 20 只，合成兩組，第1 組 10 只，每只滴0.05mL（ 10 個(gè)使用劑量）；第 2 組 10 只，不接種作為對照，兩組在相同條件下分別飼養(yǎng)管理，觀察 10 日，應(yīng)無不良反應(yīng)。如有非特異性死亡，免疫組與對照組均不超過 1 只。6.7效力檢驗(yàn)下列方法任擇其一。6.7.1用雞胚檢驗(yàn)6.7.1.1雞胚選擇選擇發(fā)育良好的10 日齡 SPF雞胚 15

9、 個(gè)，劃出尿囊腔接種部位，作出批組及滴度標(biāo)記，每一滴度接種5 個(gè)。6.7.1.2疫苗稀釋將疫苗按瓶簽注明羽份，用滅菌生理鹽水稀釋至1 羽份/0.1mL ，再作 10 倍系列稀釋至 10-7 。6.7.1.3接種 分別取 10-7 、10-6 、 10-5 三個(gè)稀釋度尿囊腔內(nèi)接種雞胚各5 個(gè)，每胚 0.1mL，用石蠟封孔。6.7.1.4孵育 置 37繼續(xù)孵育至 120 小時(shí)，每天上、下午各照檢1 次，48 小時(shí)以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，在48120 小時(shí)死亡的雞胚，隨時(shí)取出放在 28冰箱中，至120 小時(shí)取出全部活胚放在 28冰箱中24 小時(shí)。6.7.1.5凝集價(jià)（ HA）測定與計(jì)算雞胚半數(shù)感染量

10、（EID50） 將冷卻雞胚取出，將同一稀釋度的死亡雞胚液等量混合，分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)；將活胚逐個(gè)收獲雞胚液，分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)， HA160（微量法128）者判為感染，計(jì)算半數(shù)感染量，每羽份106.5 EID50 （國家標(biāo)準(zhǔn)每羽份 10 6.0 EID50），判為合格。6.7.2用雞檢驗(yàn)6.7.2.1雞的選擇 選取 30-60 日齡健康易感雞（血凝集抑制價(jià)應(yīng)4） 10 只。6.7.2.2疫苗稀釋將疫苗按瓶簽注明羽份，用滅菌生理鹽水稀釋成每0.05mL含1/100使用劑量。6.7.2.3免疫及攻毒每只雞滴鼻接種0.05mL，1014 日后，連同條件相同的對照雞 3 只，各肌肉注射雞新城疫北京

11、株強(qiáng)毒104.0 ELD50，觀察 10-14部發(fā)病死亡，免疫雞至少保護(hù)9 只為合格。6.8剩余水分測定按剩余水分測定方法進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。日，對照雞全6.9真空度測定按真空度測定方法進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。雞新城疫低毒力活疫苗生產(chǎn)工藝流程圖、主要過程控制點(diǎn)和控制項(xiàng)目種蛋消毒* SPF種胚種蛋選擇前孵化新城疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝流程1生產(chǎn)用毒種制備接種途徑1.1毒種繁殖* 接 種10-4-5），尿囊腔內(nèi)將毒種用滅活生理鹽水作適當(dāng)稀釋（如或 10照蛋時(shí)間接種劑量無菌檢驗(yàn)接種* 后孵化及照蛋。選接種后72120小時(shí)之間死亡且病痕明顯10 日齡 SPF雞胚，每胚 0.1ml培養(yǎng)溫濕度病毒含量的雞胚，分別收獲雞

12、胚液（尿囊液及羊水），裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無菌，且對冷蛋時(shí)間* 冷 蛋收獲-15 冷凍保存冷蛋溫度1： 512）以上的雞胚液混合，定量分裝于安1%雞紅細(xì)胞凝集價(jià)在 1：640（微量法鋁蓋分裝瓶保護(hù)劑膠瓿瓶中，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。1.2毒種鑒定純化水粗洗配苗無菌檢驗(yàn)粗洗清洗1.2.1病毒含量按含毒雞胚液量用滅菌生理鹽水作為10 倍系列稀釋，取 10-7 、* 滅菌-9注射水洗分裝前、中、后無檢純化水洗-810 日 SPF雞胚 5 個(gè)，每胚 0.1ml ，置 363710、10 3 個(gè)稀釋度各尿囊腔內(nèi)接種繼續(xù)孵育，48 小時(shí)以前死亡的雞胚棄去不計(jì)， 在 48120 小時(shí)死亡的雞胚

13、隨時(shí)取出，* 隧道烘箱滅分裝* 脈動蒸汽滅菌收獲雞胚液，同一稀釋度加塞干 燥的胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120 小時(shí)，取出所有活胚 ,逐個(gè)收獲凍干物理性狀雞胚液，分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)1:160( 微量法 1:128) 者判為感染，計(jì)出箱安全檢驗(yàn)無菌檢驗(yàn)壓蓋外源病毒檢驗(yàn)貼簽抽樣裝箱入庫算 EID50，每 0.1ml 病毒含量應(yīng) 10 8EID50。1.3毒種保存在 - 15以下保存，應(yīng)不超過 6 個(gè)月。1.4毒種繼代應(yīng)不超過 3 代。2制苗材料選擇選擇發(fā)育良好9 10 日齡的易感雞胚作為制苗材料。3 制苗用毒液的制備3.1接種 取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋（

14、如10-4 或 10-5 ），每胚尿囊內(nèi)接種 0.1ml ，接種后密封針孔，置 36 37繼續(xù)孵育，不必翻蛋。3.2孵育和觀察 雞胚接種后，每日照蛋 1 次，將 60 小時(shí)前死亡的雞胚棄去。此后，每 4 6 小時(shí)照蛋 1 次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至96 小時(shí)，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于28冷卻 4 24 小時(shí)。3.3收獲3.3.1雞胚液的收獲 將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術(shù)破除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜（謹(jǐn)防卵黃破裂），吸取胚液。對每個(gè)雞胚在吸取胚液前均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。死胚和活胚分別收獲，每

15、若干個(gè)雞胚分為一組，吸取胚液放于同一滅菌的容器內(nèi)，每組抽樣測定血凝價(jià)，血凝價(jià)低于1：160（微量法 1：128）者應(yīng)棄去。同時(shí)作無菌檢查，應(yīng)無細(xì)菌生長。收獲的胚液滅活前在28左右保存，應(yīng)不超過5 日。3.3.2雞胚胎兒收獲及浸出液的制備在收獲及胚液的同時(shí)， 取病變胎兒，去頭、腳，用生理鹽水洗23 次，磨碎，制成（1： 5）（ 1：10）乳劑，加適宜的抗生素適量，然后離心或以4 層紗布一層銅紗網(wǎng)濾過，置自然沉淀12 日，然后取樣作無菌檢查。以上清夜作為配制雙相油乳劑疫苗用。4 滅活 將上述無菌胚液以 4 層紗布及一層細(xì)銅紗網(wǎng)濾過， 混合于一個(gè)大玻璃瓶內(nèi)，吸出數(shù)毫升樣品備測毒價(jià)。 其余胚液和雞胚浸

16、出液分別計(jì)量加入 10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其能充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.1%。加甲醛溶液后最好傾倒另一瓶中，以避免瓶口附近黏附的病毒未能接觸滅活劑。然后在37滅活 16小時(shí)（以瓶內(nèi)溫度達(dá)到37開始計(jì)時(shí)）。期間振搖 3 4 次。在 28保存，應(yīng)不超過 1 個(gè)月。5 半成品檢驗(yàn)5.1無菌檢驗(yàn) 取滅活的胚液及雞胚浸出液分別按附錄448 進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。5.2滅活檢驗(yàn)取 10 日齡無新城疫病毒抗體的雞胚6 個(gè)，每個(gè)接種滅活胚液0.23ml ，每日照蛋2 次，觀察 5 日，雞胚非特異死亡不應(yīng)超過1 個(gè)。對所有胚液分別測定血凝價(jià)，應(yīng)不出現(xiàn)血凝，認(rèn)為滅活完全。如有可疑，應(yīng)將可疑胚液進(jìn)行重檢，重

17、檢不合格者報(bào)廢。雞胚浸出液也按照上述方法檢查。5.3 毒價(jià)測定將滅活前取出的胚液進(jìn)行 10 倍系列稀釋，取 10-7 、10-8 、 10-9 3 個(gè)稀釋度分別接種9 10 日齡無雞新城疫病毒抗體的雞胚5 個(gè)，每胚尿囊內(nèi) 0.1ml ，每日照蛋 2 次，觀察 5 日，無論死胚、活胚均應(yīng)測定血凝價(jià)，血凝價(jià)1：80（微量法 1：64）以上者，判為感染，計(jì)算 EID , 每 0.1ml病毒含量 108EID , 方可用5050于制苗。6 單相油乳劑滅活疫苗制備6.1油相制備取注射用白油94 份，加司本 -80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。6.2水相制備取吐溫 -

18、80 4份裝入帶玻璃珠的瓶中滅菌，冷卻后加滅活胚液96 份，充分振瑤使吐溫-80 完全溶解為止。6.3乳化取油相 3 份放于乳化罐內(nèi)，開動電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時(shí)徐徐加入水相 1 份，加完后再以10000r/min攪拌 2 5 分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。乳化后，取 35ml 以 3000r/min 離心 15 分鐘，若有分層現(xiàn)，應(yīng)重復(fù)攪拌1 次。7 雙相油乳劑疫苗制備7.1用乳化罐乳化7.1.1水相、油相制備同單相苗，但水相制備中，雞胚液是按4%加入吐溫，而雞胚浸出液則按6%加吐溫。7.1.2 取油相 2 份放入乳化罐內(nèi)，開動電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時(shí)徐徐加入胚

19、液1份，加完后再以10000r/min攪拌。7.1.3取雞胚浸出液（單相苗雞胚液等量）放于乳化罐，開動電機(jī)緩緩加入上述油包水單相苗，加完后再以10000r/min攪拌 25 分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使最終濃度為0.01.% 。乳化后取3 5ml 以 3000r/min離心 10 分鐘，若分層嚴(yán)重應(yīng)再攪拌1 次。7.2用乳化罐乳化。8 分裝 定量分裝，加蓋密封。9 成品檢驗(yàn)9.1物理性狀9.1.1外觀為乳白色乳劑。9.1.2劑型單相苗為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴(kuò)散。雙相苗為水包油包水型，滴于冷水中，應(yīng)呈云霧狀擴(kuò)散。9.1.3穩(wěn)定性在 37左右條件

20、下放置 21 日，應(yīng)不破乳。9.1.4粘度用 1ml 吸管（出口內(nèi)徑 1.2mm），吸取 25左右的疫苗 1ml，令其垂直自然流出，記錄流出 0.4ml 所需時(shí)間。單相苗在 8 秒以內(nèi)，雙相苗在5 秒以內(nèi)為合格。9.2無菌檢驗(yàn)按無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。9.3安全檢驗(yàn)用 30 60 日齡健康易感雞（ HI 抗體 1： 4） 6 只，各肌肉或頸部皮下注射疫苗1ml，觀察 14 日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。9.4效力檢驗(yàn)用 30 60 日齡健康易感雞（ HI 抗體 1： 4） 15 只，其中 10 只各皮下或肌肉注射疫苗 20l （用 0.5ml以下的注射

21、器注射） ，另 5 只不免疫作對照， 21 28 日后，連同條件相同的對照雞5 只，各肌肉注射510 ELD 強(qiáng)毒，觀察5014 日，對照組全部死亡，免疫組至少保護(hù)7 只為合格。9.5甲醛含量測定按甲醛含量測定法 進(jìn)行，應(yīng)符合制品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定 。雞新城疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝流程圖、主要過程控制點(diǎn)和控制項(xiàng)目*種蛋消毒非免疫種蛋前孵化種蛋選擇無相應(yīng)抗體附錄1. 剩余水份測定法接種途徑1* 接 種技術(shù)依據(jù)及原理接種劑量無菌檢驗(yàn)照蛋時(shí)間* 后孵化及照蛋滅活檢驗(yàn)培養(yǎng)溫濕度卡氏法是利用卡氏試劑中的碘和二氧化硫在砒啶和甲醇溶液中能與水起定量毒價(jià)測定冷蛋時(shí)反應(yīng)的原理，從而測定水份。間* 冷 蛋收 獲* 滅活-1

22、5 冷凍保存冷蛋溫度材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求2鋁蓋分裝瓶膠 塞2.1儀器及設(shè)備*油相制*水相制清洗清洗清洗* 乳化* 滅菌分裝前、中、后無檢* 脈動蒸汽滅菌電子分析天平（精度0.1mg，稱量范圍0 110g），費(fèi)休水份滴定儀( 梅特勒DL31)。2.2試劑卡氏試劑、無水甲醇，純水。2.3檢驗(yàn)器具止血鉗（開啟苗瓶） ，玻璃棒（或能搗碎檢品的器具）， 10ul 注射器，燒杯。2.4樣品 每批疫苗 4 個(gè)樣品。2.5其它 檢驗(yàn)記錄紙、筆、紗布和汗布手套。3 檢驗(yàn)步驟3.1接通電源、打開費(fèi)休水份滴定儀( 梅特勒 DL31)主機(jī)、打印機(jī)、天平開關(guān)。3.2按滴定儀的 RUN鍵滴定儀自動滴定至終點(diǎn)。

23、3.3滴定儀屏幕顯示待機(jī)模式Drift值在 25 以下指示箭頭穩(wěn)定 ( 平指 ) 時(shí)，開始滴定標(biāo)定滴度：3.3.1按 F2 鍵至顯示屏出現(xiàn) H2O ISO 36963.3.2連續(xù)按 F3 鍵至顯示屏出現(xiàn) please add sample 0.0100 g<approx>3.3.3天平去皮，通過進(jìn)樣孔注入已稱重的純水，( 用 10l 注射器抽取 10l純水置天平稱重 )注射器放回天平后按F3;3.3.4按 F1 自動輸入樣品量；3.3.5按 F2 顯示樣品重量；3.3.6按 F3 確認(rèn)樣品重量；3.3.7滴定至終點(diǎn)自動打印出結(jié)果，打印結(jié)束按F3 返回到待機(jī)模式；3.3.8重復(fù)標(biāo)定只

24、需依上述第1 條開始同法操作。3.4水份測定：3.4.1將樣品置天平稱重3.4.2連續(xù)按 F3 鍵，顯示屏出現(xiàn) please add sample 0.0000g 5.000g;3.4.3天平去皮后通過進(jìn)樣口將已稱重的樣品加入滴定杯中，將載樣杯放回天平。3.4.4按 F3預(yù)滴定3.4.5按 F1自動輸入樣品量3.4.6按 F2顯示樣品重量3.4.7按 F3確認(rèn)樣品重量3.4.8滴定至終點(diǎn)自動打印出結(jié)果，打印結(jié)束，按F3 返回到待機(jī)模式3.4.94 記錄與計(jì)算5 結(jié)果判定每瓶樣品含水量不得超過4.0 ，如有超過時(shí)，可重檢一次。2. 真空度測定法1 技術(shù)依據(jù)及原理依據(jù)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附錄中的真

25、空度測定法，即使用高頻火花真空測定器測定。它的基本原理是利用本儀器振動形成火花束，激勵(lì)諧振蕩回路，使次線線圈感應(yīng)出高頻高壓脈沖電壓，使被檢物產(chǎn)生不同顏色的輝光，根據(jù)顏色的變化來判斷疫苗的真空度。2 注意事項(xiàng)2.1按照規(guī)定要求，在檢驗(yàn)過程中至少要有一名檢驗(yàn)員和一名復(fù)核員共同進(jìn)行，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.2檢驗(yàn)要在光線較暗的操作室里進(jìn)行，便于結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。2.3被檢樣品從冷庫中取出應(yīng)擦干瓶壁上的水份，樣品達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求3.1儀器及設(shè)備電火花真空檢測器。3.2樣品 所有被檢樣品。3.3檢驗(yàn)記錄紙、筆。4 檢驗(yàn)步驟4.1取待檢樣品，一字排列于暗室的操作

26、臺上，使瓶與瓶之間有一定距離。4.2將真空檢測器尾部電源插頭插入220V 電源插座里。4.3將放電簧頭對準(zhǔn)被檢樣品（簧頭不要觸到瓶壁），打開開關(guān)，間歇適用（時(shí)開時(shí)關(guān)）。4.4觀察并記錄逐瓶樣品的真空狀態(tài)。5 安全措施5.1使用真空檢測器時(shí)，人體不要接近儀器的頭部電簧，以免高頻電流的電擊，（但沒有生命危險(xiǎn)） 。5.2測定樣品真空時(shí)，檢測器必須緩慢移動，放電簧不應(yīng)在一點(diǎn)停留時(shí)間過長，以免把玻璃擊穿，影響樣品本身的效果。5.3測定樣品真空時(shí)，注意遠(yuǎn)離疫苗瓶上的金屬帽，否則會造成錯(cuò)誤信號，甚至在金屬處將玻璃擊穿而造成漏洞。6 結(jié)果判定如果容器內(nèi)出現(xiàn)白色、粉色或紫色輝光，則真空度檢查合格。3. 無菌檢驗(yàn)

27、和純粹檢驗(yàn)1 技術(shù)依據(jù)及原理 :生物制品（除另有規(guī)定者外）都不應(yīng)有外源微生物污染。滅活疫苗不得含有活的本菌或本毒。各類生物制品必須按規(guī)定作無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)，全部操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。2 注意事項(xiàng)2.1抽樣后逐瓶檢查包裝、膠塞、瓶簽有無破損和毀壞，瓶內(nèi)有無雜質(zhì)。2.2為防止交叉污染，一個(gè)樣品用一個(gè)吸管或一個(gè)注射器。2.3各類生物制品的檢驗(yàn)操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。2.4檢驗(yàn)過程要仔細(xì)、認(rèn)真。2.5保持實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生，嚴(yán)格遵守常規(guī)的消毒制度。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求3.1儀器2426、 3638溫箱，檢驗(yàn)器具，試管架，10ml、 5ml、1ml 吸管，記號筆，記錄紙。3.2檢驗(yàn)用培

28、養(yǎng)基3.2.1無菌檢驗(yàn)厭氧性及需氧性細(xì)菌的檢驗(yàn)用含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（簡稱T.G）和酪胨瓊脂培養(yǎng)基 ( 簡稱 G.A) 。霉菌及腐生菌檢驗(yàn)用葡萄糖蛋白胨湯（簡稱G.P）。3.2.2純粹檢驗(yàn)用適宜本菌生長的培養(yǎng)基。4 檢驗(yàn)步驟4.1抽樣應(yīng)隨機(jī)取樣并注意代表性。4.1.1制造疫苗用的各種原菌液、毒液和其它配苗組織乳劑、穩(wěn)定劑及半成品的無菌或純粹檢驗(yàn)，應(yīng)每瓶（罐）分別抽樣進(jìn)行，抽樣量為2 10ml。4.1.2成品的無菌或純粹檢驗(yàn)應(yīng)按每批或每個(gè)亞批進(jìn)行，每批按瓶數(shù)百分之一抽樣，但不應(yīng)少于5 瓶，最多不超過10 瓶，分別進(jìn)行檢驗(yàn)。4.2檢驗(yàn)用培養(yǎng)基4.2.1無菌檢驗(yàn)4.2.1.l厭氧性及需氧性細(xì)菌的檢驗(yàn)用

29、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）及酪胨瓊脂（ G.A）。4.2.1.2霉菌及腐生菌檢驗(yàn)用葡萄糖蛋白胨湯（G.P）。4.2.2活菌純粹檢驗(yàn)用適于本菌生長的培養(yǎng)基。4.2.3滅活檢驗(yàn)用適于本菌生長的培養(yǎng)基，或?qū)Ρ径久舾械募?xì)胞、組織和動物。4.2.4雜菌計(jì)數(shù)用馬丁瓊脂或 G.A 培養(yǎng)基。4.2.5病原性鑒定用 T.G 培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。4.3檢驗(yàn)方法及結(jié)果判定4.3.l細(xì)菌原菌液及活菌苗半成品的純粹檢驗(yàn)取樣接種 T.G 小管及適宜于本菌生長的其他培養(yǎng)基斜面各2 支，每支 0.2ml ，1 支置 37培養(yǎng)； 1 支置 25培養(yǎng)，觀察 3 5 日，應(yīng)純粹。4.3.2病毒原毒液和其它配苗組織乳劑、穩(wěn)定劑及

30、半成品的無菌檢驗(yàn)取樣接種T.G 小管及 G.A 斜面各 2 支，每支 0.2m1，1 支置 37培養(yǎng)； 1 支置 25培養(yǎng)，觀察 3 5 日，應(yīng)無菌生長。4.3.3滅活檢驗(yàn)細(xì)菌滅活后，用適于本菌生長的培養(yǎng)基2 支，各接種0.2ml ，置 37培養(yǎng) 5 日，應(yīng)無菌生長。病毒液滅活后和細(xì)菌毒素脫毒后接種對本毒敏感的細(xì)胞、禽胚或?qū)嶒?yàn)動物，應(yīng)正常。4.3.4含甲醛、苯酚、汞類等防腐劑和抗生素的制品用 T.G 培養(yǎng)基 50ml，接種樣品（凍干制品先做10 倍稀釋） 1ml ，置 37培養(yǎng)， 3 日后自小瓶中吸取培養(yǎng)物。分別接種 T.G 小管和 G.A 斜面各 2 支，每支 0.2m1，1 支置 37；1

31、 支置 25，另取 0.2ml ，接種 1 支 G.P 小管置 25，均培養(yǎng) 5 日，應(yīng)無菌生長。如制品允許含一定數(shù)量非病原菌，應(yīng)進(jìn)一步作雜菌計(jì)數(shù)和病原性鑒定。4.3.5細(xì)菌性活疫苗（凍干制品恢復(fù)原量）及不含防腐劑、抗生素的其它制品或稀釋液，將樣品直接接種T.G 小管、 G.A 斜面或適于本菌生長的其他培養(yǎng)基各2支，每支 0.2m1，1 支置 37； 1 支置 25，另用 1 支 G.P 小管，接種 0.2m1 置 25，均培養(yǎng) 5 日。細(xì)菌性活疫苗應(yīng)純粹，其他制品應(yīng)無菌生長。4.3.64.3.7如培養(yǎng)后混濁不易判定時(shí)，可移植l 次，再判定。4.3.8每批抽檢的樣品必須全部無菌或純粹生長。如發(fā)

32、現(xiàn)個(gè)別瓶有雜菌或結(jié)果可疑時(shí)，可重檢原瓶（如為安瓿或凍干制品，可重抽樣品），如無菌或無雜菌生長，可作無菌或純粹通過。如仍有雜菌，可抽取加倍數(shù)量的樣品重檢，個(gè)別瓶仍有雜菌，則作為污染雜菌處理。5 安全措施5.1檢驗(yàn)過程中注意防止對檢驗(yàn)人員和環(huán)境的污染。5.2檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。5.3滴撒在操作臺、地面的異物要進(jìn)行消毒處理。5.4檢驗(yàn)完畢后開封的檢品均要經(jīng)過高壓滅菌處理。6 記錄和計(jì)算檢品在接種相關(guān)培養(yǎng)基后，每天觀察溫箱內(nèi)的培養(yǎng)情況并記錄觀察結(jié)4. 雜菌計(jì)數(shù)1 技術(shù)依據(jù)及原理某些疫（菌）苗允許有一定數(shù)量的非病原性雜菌，但這類制品如污染雜菌，必須作雜菌計(jì)數(shù)。2 注意事項(xiàng)2.1為防止交叉污染，

33、一個(gè)樣品用一個(gè)吸管或一個(gè)注射器。2.2各類生物制品的檢驗(yàn)操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。2.3檢驗(yàn)過程要仔細(xì)、認(rèn)真。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求3.1儀器3638普通溫箱，試管架，10ml、5ml 、 1ml 吸管，記號筆，記錄紙，顯微鏡。3.2培養(yǎng)基（含4%血清及0.1%裂解血球全血）馬丁瓊脂或酪胨瓊脂培養(yǎng)基（ G.A）。4 檢驗(yàn)步驟污染雜菌的制品至少重新抽檢3 瓶，分別進(jìn)行雜菌計(jì)數(shù)。 用普通肉湯或蛋白胨水 50 倍稀釋，接種于含4%血清及 0.1%裂解血球全血的馬丁瓊脂平板或酪胨瓊脂（ G.A）平板上，每個(gè)樣品接種2 付平板，放置3638培養(yǎng) 48 小時(shí)，再放置室溫 24 小時(shí)，然后分別計(jì)

34、算雜菌菌落（CFU）。5 安全措施5.1檢驗(yàn)過程中注意防止對檢驗(yàn)人員和環(huán)境的污染。5.2檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。5.3滴撒在操作臺、地面的異物要進(jìn)行消毒處理。5.4檢驗(yàn)完畢后開封的檢品均要經(jīng)過高壓滅菌處理。6 記錄和計(jì)算培養(yǎng) 72 小時(shí)后，分別計(jì)算每個(gè)平板的雜菌數(shù)，并把兩付平板的雜菌數(shù)相加后求平均數(shù)，作為該瓶的雜菌數(shù)。如污染霉菌，亦作為雜菌計(jì)算。7 結(jié)果判定任何 1 瓶每克組織（或每頭劑） 的非病原菌數(shù)， 不應(yīng)超過所檢產(chǎn)品的規(guī)定數(shù)量。5. 支原體檢驗(yàn)1 技術(shù)依據(jù)及原理病毒性活疫苗不得含有支原體。2 注意事項(xiàng)2.1在檢測中必須遵守規(guī)定的程序，每次都必須設(shè)陽性和陰性對照。2.2對每批支原體檢

35、驗(yàn)用培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量檢測，并作記錄。2.3操作時(shí)禁止口吹吸管。2.4操作人員必須戴口罩、工作帽，穿工作服，禁止檢驗(yàn)人員將頭發(fā)留在帽外。2.5保持實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生，嚴(yán)格遵守常規(guī)的消毒制度。2.6必須在無菌、無支原體污染的環(huán)境條件下操作。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求3.1儀器3638普通溫箱， 3638二氧化碳培養(yǎng)箱，顯微鏡，試管架， 10ml、5ml、2ml、 1ml 吸管，小試管和 100ml 培養(yǎng)瓶，記號筆，記錄紙。3.2培養(yǎng)基檢測由禽胚組織或其細(xì)胞制成的活疫苗用改良Frey 氏培養(yǎng)基。檢測其他種類的活疫苗用支原體培養(yǎng)基。4檢驗(yàn)步驟4.1樣品處理每批制品取樣3 5 瓶，混合后備用。如為

36、凍干制品，則加液體培養(yǎng)基復(fù)原成混懸液后混合。4.2接種與觀察液體培養(yǎng)基培養(yǎng)取 5ml 疫苗混合物接種于盛20ml 小瓶液體培養(yǎng)基中，再從小瓶中分別取0.2m1 移植接種于 2 支小管液體培養(yǎng)基內(nèi)， 將小瓶與小管放3638培養(yǎng)，每日觀察培養(yǎng)物有無顏色變黃或變紅。如在5 日尚未見變化，再從小瓶中取 0.2m1 移植于另 2 支管液體培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)觀察5 日，如此重復(fù) 3 次。若仍無變化，在最后一次接種小管的培養(yǎng)物經(jīng)14 天觀察后停止觀察。在觀察期內(nèi)，如果發(fā)現(xiàn)小瓶或任何一支小管培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化，pH 值變化達(dá)± 0.5時(shí)，應(yīng)立即移植于小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，觀察在液體培養(yǎng)基中

37、是否出現(xiàn)恒定的 pH 變化，及在固體上有無典型的“煎蛋”狀支原體菌落。瓊脂固體平板培養(yǎng)在每次液體培養(yǎng)物移植小管培養(yǎng)的同時(shí)，取培養(yǎng)物0.1 0.2m1 接種瓊脂平板2 付，放在含5 10二氧化碳的潮濕環(huán)境下 3638培養(yǎng)。此外，在液體培養(yǎng)基顏色出現(xiàn)變化，pH值變化達(dá) ±0.5時(shí)，也同時(shí)接種瓊脂平板2 付。各瓊脂平板每57 天在低倍顯微鏡下觀察檢查有無支原體菌落出現(xiàn)，經(jīng)14天觀察，仍無菌落者停止觀察。4.3每次移植培養(yǎng)陽性對照，在同條件下培養(yǎng)觀察。禽類疫苗用滑液支原體作對照，非禽類疫苗用豬鼻支原體作對照。5 安全措施5.1檢驗(yàn)過程中注意防止對檢驗(yàn)人員和環(huán)境的污染。檢驗(yàn)完畢后開封的產(chǎn)品均要

38、經(jīng)過高壓滅菌處理。5.2檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。5.3滴撒在操作臺、地面的異物和污染的工作服要進(jìn)行消毒處理。5.4檢驗(yàn)完畢，開封的檢品均要經(jīng)滅菌后再進(jìn)行處理。6 記錄和計(jì)算檢品在接種相關(guān)培養(yǎng)基后，每天培養(yǎng)情況并記錄觀察結(jié)果。7 結(jié)果判定7.1任何一次瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落，判疫苗或血清不合格。7.2陽性對照中至少有一個(gè)平板長菌落，而陰性對照中無菌落生長，則檢驗(yàn)有效。8 附錄及附加說明上述小瓶培養(yǎng)基是指 100m 小瓶中盛培養(yǎng)基 20m1；小管培養(yǎng)基是指小試管 (1.0X10cm) 中盛入 1.0ml 培養(yǎng)基。小管與小瓶皆須用膠塞或螺旋塑料塞封口。6. 外源病毒檢驗(yàn)1 技術(shù)依據(jù)及原理由于

39、使用的生物活性原材料、生產(chǎn)過程等均可引起種毒、獸用病毒性活疫苗等污染外源病毒。因此用高效價(jià)單特異抗血清中和待檢物中相應(yīng)活性成分或經(jīng)適當(dāng)處理后，接種不同的培養(yǎng)基質(zhì)，觀察病變以檢出污染的外源病毒。2 注意事項(xiàng)2.1檢驗(yàn)所用原材料應(yīng)符合有關(guān)規(guī)定。2.2中和用抗血清應(yīng)高效價(jià)、單特異性。2.3嚴(yán)格無菌操作，防止交叉污染。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求3.1儀器及設(shè)備孵化器， CO2 培養(yǎng)箱，普通冰箱，普通顯微鏡，熒光顯微鏡，水浴鍋，照蛋箱。3.2試劑特異抗血清3.3檢驗(yàn)器具小試管、試管架、注射器(1ml) ，吸管 (1ml ， 5ml，10ml) ，記號筆3.4樣品每批樣品 35 瓶3.5其它檢驗(yàn)

40、用記錄紙、筆等4 檢驗(yàn)步驟4.1樣品處理4.1.1禽源細(xì)胞、種毒及其制品種毒或活疫苗除另有規(guī)定者外，液體樣品取23 瓶混合，凍干樣品取2 3瓶加入稀釋液溶解后混合，用相應(yīng)單特異抗血清在25中和 1 小時(shí)以完全中和樣品中的活性成分作為檢品。除另有規(guī)定者外，病毒中和劑量為10 羽份。4.1.2非禽源細(xì)胞（或細(xì)胞系） 、種毒及其制品種毒或活疫苗除另有規(guī)定者外，液體樣品取23 瓶混合，凍干樣品取2 3瓶加入稀釋液溶解后混合，用相應(yīng)單特異抗血清在25中和 1 小時(shí)以完全中和樣品中的活性成分作為檢品，除另有規(guī)定者外，病毒中和劑量為1 羽份。4.2檢驗(yàn)方法4.2.1禽源細(xì)胞、種毒及其制品用雞胚接種檢查法4.

41、2.1.1尿囊腔內(nèi)接種試驗(yàn)4.2.1.1.1試驗(yàn)法 選擇發(fā)育良好的9 11 日齡 SPF 雞胚 10 枚，每枚尿囊腔內(nèi)接種 0.2ml檢品 ( 如為疫苗， 至少含 10個(gè)羽份 ) ，在 37培養(yǎng) 7 天，棄去在接種后24 小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，但雞胚至少成活8/10 ，試驗(yàn)方可成立。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)打開雞胚，觀察雞胚有無異常，取尿囊液做紅胞凝集試驗(yàn)，室溫靜置15 30 分鐘，觀察有無紅細(xì)胞凝集。4.2.1.1.2判定雞胚發(fā)育正常，尿囊液紅細(xì)胞凝集陰性，該批制品判合格。4.2.1.2絨毛尿囊膜 (CAM)接種試驗(yàn)4.2.1.2.1試驗(yàn)法選擇發(fā)育良好的9 11 日齡 SPF雞胚 10 枚，每枚 CAM上接種

42、 0.2ml 檢品 ( 如為疫苗，至少含10 個(gè)羽份 ) ，在 37培養(yǎng) 7 天，棄去在接種后24 小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，但雞胚至少成活8/10 ，試驗(yàn)方可成立。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)打開雞胚，觀察雞胚及 CAM有無異常，取尿囊液做紅胞凝集試驗(yàn)，室溫靜置 1530 分鐘，觀察有無紅細(xì)胞凝集。4.2.1.2.2判定雞胚發(fā)育正常， CAM無異常，尿囊液紅細(xì)胞凝集陰性，該批制品判合格。5 安全措施檢驗(yàn)過程中注意防止人員和環(huán)境的污染，檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作并在相應(yīng)安全等級（級別）的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，以防散毒。檢驗(yàn)結(jié)束后對操作臺、地面進(jìn)行徹底消毒，用過的吸管浸泡在消毒液中，檢驗(yàn)完畢后廢棄的產(chǎn)品均經(jīng)高

43、壓滅菌處理。7 鑒別檢驗(yàn)1 技術(shù)依據(jù)及原理將含有對病毒外殼或囊膜抗原的特異抗體的血清與相應(yīng)疫苗病毒混合，可使兩者結(jié)合（即中和） ，使病毒失去對其宿主的感染性。用上述中和物接種靶動物（方法 1）、雞胚（方法 2）或細(xì)胞培養(yǎng)（方法 3），觀察其是否感染病毒，即可判斷疫苗病毒與血清的特異性。2 試驗(yàn)過程的注意事項(xiàng)2.1應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。除接種動物外，所有操作均應(yīng)在生物安全試驗(yàn)室或超凈工作臺中進(jìn)行。2.2試驗(yàn)前應(yīng)知道疫苗病毒的含量或毒價(jià)，否則，須先行測定。2.3兩“中和”物的量要準(zhǔn)確，中和溫度要恒定，中和期間要適當(dāng)搖動，并有專人值守。2.4細(xì)胞瓶上要有標(biāo)記，防止錯(cuò)將細(xì)胞面放反。2.5接種動物要盡量輕柔，

44、保定要得當(dāng)、確實(shí)，以保證檢驗(yàn)人員的安全和接種部位及接種劑量的準(zhǔn)確。2.6試驗(yàn)完畢要及時(shí)清理現(xiàn)場，做好消毒處理工作。3 試驗(yàn)材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求3.1儀器及設(shè)備超凈工作臺（雙人、垂直） ，恒溫水浴鍋，計(jì)時(shí)鐘，孵化器，照蛋箱，架盤天平，恒溫培養(yǎng)箱或 CO2培養(yǎng)箱，低溫冰箱，普通冰箱，倒置顯微鏡。3.2試劑特異性血清，疫苗稀釋液（生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)液或適于病毒和宿主動物的其他稀釋液），無機(jī)鹽類，細(xì)胞培養(yǎng)液（ MEM、199、乳漢液、乳歐液） ，健康牛血清，抗生素（青、鏈霉素）， 0.25 胰酶， 細(xì)胞分散液 EDTA，酚紅（ 1），消毒劑（酒精、碘酊及脫脂棉球等） 。3.3試驗(yàn)器具試管及試管架若干，吸管（1ml、 5ml、10ml），注射器（ 1ml，5ml，10ml）及針頭（ 4 6），蛋盤，打孔器，石臘，細(xì)胞瓶及瓶塞3.4試驗(yàn)動物家兔（ 1.5 2.0kg ，用于豬瘟疫苗），雞胚（ SPF胚， 9 11 日齡，用于雞新城疫、支氣管炎疫苗）3.5細(xì)胞（根據(jù)待檢疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選用適宜細(xì)胞，