發(fā)展戰(zhàn)略酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用

1、酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用隨著對多種重要生物的大規(guī)模基因組測序工作的完成，基因工程領(lǐng)域又迎來了一 個新的時代-功能基因組時代。它的任務(wù)就是對基因組中包含的全部基因的功 能加以認識。生物體系的運作與蛋白質(zhì)之間的互相作用密不可分，例如：DN給成、基因轉(zhuǎn)錄激活、蛋白質(zhì)翻譯、修飾和定位以及信息傳導(dǎo)等重要的生物過程均 涉及到蛋白質(zhì)復(fù)合體的作用。能夠發(fā)現(xiàn)和驗證在生物體中相互作用的蛋白質(zhì)與核 酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)是認識它們生物學(xué)功能的第一步。酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相 互作用的技術(shù)平臺，在近幾年來得到了廣泛運用。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式 生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋

2、白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間 的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏 度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。 大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以 用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基 因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。 本文就酵母雙雜交的技術(shù)平臺和應(yīng)用加以介紹。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4ft結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular）,往往由兩個或兩個以上結(jié)構(gòu)上可以 分開，功

3、能上相互獨立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有 DNA結(jié)合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain , DNA-AD。 這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4$專錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS ）的下游 啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這個特性，將編碼DNA-BD勺基因與已知蛋白質(zhì) Bait protein的基因構(gòu) 建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩

4、者的融合蛋白BD-Bait protein。將編碼AD的基因和cDN©庫的基因構(gòu)建在 AD-LIBRARYg達載體上。同時將上述兩 種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4又不能合成LEU TRP HIS、ADE因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法 正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式 作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE LACZ MEL1從而通過功能互補和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作。在酵母 雙雜

5、交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文 庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和 位點?；诮湍鸽p雜交技術(shù)平臺的特點，它已經(jīng)被應(yīng)用在許多研究工作當(dāng)中1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNW庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵 母菌株中可以分離得到AD-L舊RAR蹴體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入 的cDNA>t段，并對該片段的編碼序列在 GENEBANK進行比較，研究與已知基因 在生物學(xué)功能上的聯(lián)系

6、。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的 已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。例如： Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白 alpha-synuclein蛋白為誘餌蛋白，禾用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMARKERSYSTEM為操作平臺，從成人腦cDN©庫中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein 相互作 用的新蛋白Synphilin-1 ，并證明了 Synphilin-1 與alpha-synuclein之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病有密切相關(guān)。為了研究兩個蛋白之間的相互作用的結(jié)合 位點，找到影響或抑制兩個蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術(shù)和

7、基因修飾證明了 alpha-synuclein 的1-65個氨基酸殘基和 Synphilin-1的349-555個氨基酸殘基之間是相互作用的位點。研究它們之間的相互作用位點有利于基因治療藥物的開發(fā)。2、利用酵母雙雜交在細胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體問 的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非 細胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。 而在細胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚 積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進行檢測。例如：來源于矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應(yīng)中，抗體的單鏈的三個可變區(qū)

8、A4、G4 H3與抗原之間 作用有強弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術(shù)，將 DFR乍為誘餌蛋白，編碼 抗體的三個可變區(qū)的基因分別被克隆在 AD-LIBRAR蹴體上，將BD-BAIT載體和 每種AD-LIBRAR蹴體分別轉(zhuǎn)化改造后的酵母菌株中，并檢測報告基因在克隆的 菌落中的表達活性，從而在活細胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應(yīng)。3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、

9、肝炎等疾病，研究 發(fā)現(xiàn)它的病毒RNAM制與依賴于RNAW RN咪合酶（NS5與拓撲異構(gòu)酶NS3 以及細胞核轉(zhuǎn)運受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過酵母雙雜交 技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻 斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNAW毒的復(fù)制，從而達到治療這種疾 病的目的。4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（ Genome°rotein Linkage Map眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的。基因組中的 編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。 通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn) 了很多新的基因和

10、EST序歹I，HUA?人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和 EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間 的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導(dǎo)、 代謝途徑等有重要意義。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用作為后基因組時代出現(xiàn)的新興研究領(lǐng)域之一,蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)正受到越來越多的關(guān)注。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目標是對機體或細胞的所有蛋白質(zhì)進行鑒定和結(jié)構(gòu)功能分析。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究不局限任何特定的方法。高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)如二維凝膠電泳和高效液相層析，經(jīng)典的蛋白質(zhì)鑒定方法如氨基酸序列分析等，現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)，基因組學(xué)研究的各種

11、手段，現(xiàn)代計算機信息學(xué)和計算機網(wǎng)絡(luò)通訊技術(shù)等等，任何可用于蛋白質(zhì)研究的技術(shù)手段蛋白質(zhì)組學(xué)都可能會采用。它體現(xiàn)的是一個開放的思維和研究方式。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用是細胞生命活動的基礎(chǔ)和特征。這種千變?nèi)f化的相互作用以及由此形成的紛繁復(fù)雜的蛋白質(zhì)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)同樣也是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容，相應(yīng)的工作也已經(jīng)開展。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)自建立以來已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強 有力的方法之一。該方法在不斷完善，如今它不但可用來在體內(nèi)檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)，在對蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的認識上發(fā)揮了重要的作用。實驗

12、表明雙雜交技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)上的應(yīng)用是成功的。本文將就雙雜交技術(shù)的產(chǎn)生、發(fā)展及其在蛋白質(zhì)組研究方面的初步應(yīng)用作一介紹。1蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生背景基因組研究自從開展以來已經(jīng)取得了舉世矚目的成就。在過去幾年中，已經(jīng)陸續(xù)完成了包括大腸桿菌、釀酒酵母等十多種結(jié)構(gòu)比較簡單的生物的基因組DNA的全序列分析1。線蟲(C.elegans)的基因組DNA測序工作已基本完成2。規(guī)模更為龐大的人類基因組計劃 預(yù)期在下一世紀的前幾年 (20032005年)也將完成全部基因組DNA的序列分析。這些進展是非常令人振奮的。但是也隨之產(chǎn)生了新問題。大量涌出的新基因數(shù)據(jù)迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質(zhì)有什么功能這個問題。不僅如

13、此，在細胞合成蛋白質(zhì)之后，這些蛋白質(zhì)往往還要經(jīng)歷翻譯后的加工修飾。也就是說，一個基因?qū)?yīng)的不是一種蛋白質(zhì)而可能是幾種甚至是數(shù)十種。包容了數(shù)千甚至數(shù)萬種蛋白質(zhì)的細胞是如何運轉(zhuǎn)的？或者說這些蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)是怎樣工作、如何相互作用、相互協(xié)調(diào)的？這些問題遠不是基因組研究所能回答得了的。正是在此背景下，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)應(yīng)運而生。蛋白質(zhì)組(proteome)一詞是馬克.威爾金斯(Marc Wilkins)最先提出來的3,最早見諸 于1995年7月的“Electrophoresis雜志上4,它是指一個有機體的全部蛋白質(zhì)組成及其活 動方式。 蛋白質(zhì)組研究雖然尚處于初始階段 ，但已經(jīng)取得了一些

14、重要進展。當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的主要內(nèi)容是，在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)方法的同時，進行蛋白質(zhì)組分析。對蛋白質(zhì)組的分析工作大致有兩個方面。一方面，通過二維凝膠電泳得到正常生理條件下的機體、組織或細胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜，相關(guān)數(shù)據(jù)將作為待檢測機體、組織或細胞的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫。一系列這樣的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立并且可通過聯(lián)網(wǎng)檢索。二維參考圖譜建立的意義在于為進一步的分析工作提供基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組分析的另一方面，是比較分析在變化了的生理條件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化。如蛋白質(zhì)表達量的變化，翻譯后修飾的變化，或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細胞水平上的定位的改變等。關(guān)于蛋白質(zhì)組 學(xué)的介紹可參閱文獻5,6。

15、細胞或組織的蛋白質(zhì)不是雜亂無章的混合物，蛋白質(zhì)間的相互作用、相互協(xié)調(diào)是細胞進行一切代謝活動的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)間的相互作用及作用方式同樣也是蛋白質(zhì)組研究所面臨的問題。 研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質(zhì)交聯(lián)等。其中，酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。2酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular）,即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA bi

16、nding domain,簡稱為 D和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 （activation domain,簡稱為 AD）, 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點并激活轉(zhuǎn)錄7。Fields等人的工作標志雙雜交系統(tǒng)的正式建立8。他們以與調(diào)控 SUC2基因有關(guān)的兩個蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的DB結(jié)構(gòu)域融合，另外一個與Gal4的AD 結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB

17、和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為誘餌"（bait）口獵物”或靶蛋白（prey or target protein）。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用，那么分別位 于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達。這個被激活的、能顯示誘餌”和 獵物”相互作用的基因稱之為報道基因（reporter gene）。通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測，反過來可判別作為誘餌”和 獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此Fields等人采用編碼伊半乳糖昔酶的LacZ作為報道基因，并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這

18、個改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。 而酵母的GAL4基因和GAL80基因（Gal80是Gal4的負調(diào)控因子）被缺失，從而排除了細胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達載體的酵母細胞才有伊半乳糖昔酶活性，單獨轉(zhuǎn)化其中任何一個載體都不能檢測出3半乳糖昔酶活性。目前發(fā)展起來的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以Fields等人建立的系統(tǒng)為基礎(chǔ)的。這些新系統(tǒng)主要對報道基因、誘餌”表達載體以及獵物”表達載體等做了一些改進。其中一個重要改進是引入額外的報道基因，如廣泛采用的HIS3基因。 經(jīng)過改造帶有 HIS3報道基因的酵

19、 母細胞，只有當(dāng)HIS3被啟動表達才能在缺乏組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長。HIS3報道基因的轉(zhuǎn)錄表達是由誘餌”和 獵物”的相互作用所啟動的。大多數(shù)雙雜交系統(tǒng)往往同時使用兩個甚至三個報道基因，其中之一是LacZ。這些改造后的基因在啟動子區(qū)有相同的轉(zhuǎn)錄激 活因子結(jié)合位點，因此可以被相同的轉(zhuǎn)錄激活因子（如上述的Gal4蛋白）激活。 通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現(xiàn)象。其他還有針對 誘餌”或 獵物”表達載體等所作的改進，這里不一一詳述。在雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化，這個工作量是相當(dāng)大的，特別是尋找新的作用蛋 白質(zhì)的時候尤其如此。而且，酵母細胞的轉(zhuǎn)化效率比細菌要低約4個數(shù)量級。

20、因此轉(zhuǎn)化步驟就成為雙雜交技術(shù)的瓶頸。Bendixen等人通過酵母接合型的引用，避免了兩次轉(zhuǎn)化操作，同時又提高了雙雜交的效率9。在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型：a接合型和“接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a接合型細胞之間或 “接合 型細胞之間不能接合形成二倍體。根據(jù)酵母有性生殖的這一特點，他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化”接合型酵母細胞，誘餌”表達載體轉(zhuǎn)化a接合型細胞。然后分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔(lawn),再將兩種菌苔復(fù)印到同一個三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB融合蛋白和AD融合

21、蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進一步通過3半乳糖甘酶活力進行鑒定。 這項改進不僅簡化了實驗操作，而且也提高了雙雜交的篩選效率。在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能特點、作用方式過程中，有時還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。針對實際工作中的這種需要，Vidal等人發(fā)展了所謂的逆雙雜交系統(tǒng)(reverse two-hybrid system) 10,11。這項技術(shù)的關(guān)鍵是報道基因URA3的引入。URA3基因在這里起到了反選擇的作用，它編碼的酶是尿喀咤合成的關(guān)鍵酶。該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化成對細胞有毒的物質(zhì)。Vidal等人通過改造在 URA3基因的啟動子內(nèi)引入Gal4的結(jié)合

22、位點。這個改造的酵母菌株在缺乏尿喀咤的選擇性培養(yǎng)基上只有當(dāng)誘餌”和獵物”相互作用激活 URA3基因的表達才能生長。在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上 誘餌”和獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。然而如果目的蛋白，即與DB或AD融合的蛋白質(zhì)發(fā)生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用，URA3基因不表達，則細胞能在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上生長。通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉(zhuǎn)錄因子E2F1的突變物，這些突變物仍然能結(jié)合視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白RB,但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果得到了體外結(jié)合實驗的驗證。通過對這些突變蛋白基因的測序，他們發(fā)現(xiàn)了新的E2F1同DP1結(jié)合的位點。以上

23、介紹的酵母雙雜交系統(tǒng)都是建立在對RNA聚合酶II的激活的基礎(chǔ)上的。這意味著雙雜交過程是在細胞核內(nèi)完成的。然而許多待研究的蛋白質(zhì)是膜蛋白，它們需定位到膜上之后才能表現(xiàn)正常的生物功能，與其他蛋白質(zhì)起作用。有些真核細胞蛋白還要經(jīng)過翻譯后的加工修飾如二硫鍵的形成、糖基化、聚異戊二烯基化等。這些加工修飾在正常的細胞核內(nèi)不可能發(fā)生。有些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄的活性，它們可不經(jīng)過雙雜交相互作用即能激活報道基因的表達。因此根據(jù)需要有人又發(fā)展了新的雙雜交系統(tǒng)。例如，Aronheim等人設(shè)計了一個Sos蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng) 12,也被作者稱為 Sos救活系統(tǒng)(Sos recruitment system)o人的鳥

24、甘酸交換因子-Sos蛋白是一種胞質(zhì)蛋白，而酵母的鳥甘酸交換因子 -cdc25 蛋白定位在內(nèi)膜上，可將相關(guān)受體信號傳導(dǎo)給Ras蛋白。 由cdc25突變產(chǎn)生的一種溫度敏感突變型細胞不能在 36 C條件下生長。 但是，如果Sos蛋白可以通過某種方式被定位到酵 母細胞內(nèi)膜上，那么它在這種溫度敏感突變型細胞中因替代cdc25蛋白的作用，而使酵母恢復(fù)在36 C條件下生長的能力。 在Aronheim等人設(shè)計的系統(tǒng)中，待研究的兩個蛋白質(zhì)分別 與豆蔻?；盘柶魏蚐os蛋白融合，前一個融合蛋白定位于膜上，如果兩個待研究蛋白質(zhì)之間存在相互作用，這將使Sos也定位到膜上，從而可激活Ras蛋白使酵母在 36 C下生

25、 長。利用該技術(shù)Aronheim等人找到了 c-Jun的兩個新的作用伙伴。此外還有其他類型的雙雜交甚至三雜交系統(tǒng)，本文不再詳述。3雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)組研究上的應(yīng)用可以說尚處于嘗試階段，這方面的文獻報道還很少，但已顯示其在分析鑒定細胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用方面的潛力。這里以兩家實驗室的工作為例作一介紹。Fromont-Racine等人13,14以10種功能已知的與 mRNA前體剪接有關(guān)的蛋白質(zhì)作起 始誘餌”，從含有約5X106個克隆的釀酒酵母基因組文庫中進行第一輪篩選(這些基因組DNA與AD的基因融合構(gòu)成 獵物”表達載體)。經(jīng)過對陽性克隆 獵物" DNA

26、勺序列分析，他 們把這些DNA分成兩大類共5項(圖1):編碼蛋白質(zhì)的DNA和非編碼蛋白質(zhì)的 DNA,前 一類分為四項：A1是在序列上彼此有部分重疊的克隆群。這一項也是首先分析考慮的對象；A2和A3分別是靠近ORF起始密碼子的編碼蛋白質(zhì)N-末端的片段和 ORF內(nèi)部的大編碼片段，A4是其他的編碼序列。這四項優(yōu)先考慮的順序是：A1>A2>A3>A4。根據(jù)分析把從中得到的4種靶蛋白做成新的誘餌”進行第二輪篩選。 再把從中得到的一種 獵物”做成誘餌”進行第三輪篩選。如此經(jīng)過三輪共十五次篩選，他們從中共得到約 700個陽性克隆 并且對大多數(shù)作了部分測序。這些篩選到的靶蛋白中，有9種是已知

27、的mRNA前體剪接因子，5種是新發(fā)現(xiàn)的剪接因子，8種是與RNA其他加工過程有關(guān)的因子，還有45種與其他的 功能有關(guān)。另外有9種是轉(zhuǎn)錄?t活因子，這主要來自假陽性克隆。他們不僅發(fā)現(xiàn)了已知剪接因子與其他因子的相互作用，鑒定了一些新的因子，而且建立了這個剪接途徑與其他代謝 途徑的聯(lián)系。據(jù)此Fromont-Racine等人聲稱，如果選擇不同的細胞代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為出發(fā)點，通過類似的雙雜交實驗最終有可能建立酵母細胞完整的蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜。推而廣之，這項技術(shù)同樣也能用到人類蛋白質(zhì)組研究中。Fromont-Racine等人能在較短的時間完成如此大量的篩選、分析工作，一個非常關(guān)鍵的因素是他們采用了上述 Bendixen等人建立的通過酵母的有性接合得到雙雜交菌株，并且對此技術(shù)作了進一步的改進。Ben