動物實驗室疾病診斷工作流程

1、生物實驗室疾病診斷工作流流程程接收流程：內(nèi)勤一一研發(fā)部一一生物實驗室業(yè)務(wù)反饋流程：生物實驗室實施細(xì)貝I:、樣品采集與運輸1 .病料的采集要求：(1) 新鮮，代表性。病料存放時間夏天少于6h,冬天12-24h.(2)減少污染。第一時間采取病料，減少病料因暴露于空氣中而造成的污染。(3)病料采集后，應(yīng)先存放于冰箱中 1-2小時后，再做微生物檢驗2 .病料的采集方法(1 )組織和實質(zhì)器官的采集 采集病料心、肝、脾臟、胰腺、肺等，剪切小塊組織，密封。放入滅菌試管(青霉素瓶)(2)液體病料的采集血液、膽汁、膿腫液、滲出物等液體病料，使用注射器(或滅菌吸管)吸 取病變組織的液體，將病料注入滅菌試管(青霉素

2、瓶)(3 )全血的采集方法用注射器自雞的心臟或遹靜愉篥海檢。(4)血清的采集方法2-5毫升，注入滅菌試管(青霉素瓶)中。用滅菌注射器自雞的心臟或翅靜脈采血2毫升，注入滅菌試管中(青霉素瓶)擺成斜面，待血 液凝固血清析出后，將血清吸出注入另一個滅菌試管中，備用。采樣的比例：按每個舍0.5%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常規(guī)采樣15-30份即可。、檢測項目項目一、藥敏試驗試驗步驟1 .試驗材料：培養(yǎng)基、藥敏試紙、細(xì)菌、接種環(huán)、酒精燈、打 孔器、移液器、滴頭。2 .試驗準(zhǔn)備：藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按商品藥使用治療量的比例配制藥 液；如商品藥“百病消”按其說明量治療量0.01%飲水，

3、可按這個比例配制藥液, 可取1 o毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏 試驗的藥液。3 .試驗操作方法： 3. 1藥敏片法3. 1. 1在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培 養(yǎng) 物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別 在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的l/2o找到第 二點劃線至平皿 的1/2,依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培 養(yǎng)基表面，涂布均勻致密）。3. 1.2將鎮(zhèn)子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)

4、基表面。為了使 藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鐐子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求 藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若 干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。3. 1. 3將平皿培養(yǎng)基置于37C溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。二、結(jié)果觀察:過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小， 若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直 接關(guān)系。三、結(jié)果判定藥敏試驗的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。實驗條件不同，判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同。對于一般抑菌環(huán)的直徑，20

5、mn以上極敏；15mm以上者為高度敏感；10-15 mn為中度敏感；10mm以下為低度敏感；無抑菌環(huán)者為 耐藥?？咕幬锛埰幜恳志χ睆?mm)(p g不敏感低度敏感中度敏感敏感青霉素/mL)0< 1010 -26>26鏈霉素5000< 1010 -15>15氯霉素7000< 1010 -20>20新霉素3000< 1010 -25>25多黏菌素抑菌圈在9毫米以上為高敏，6-9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。四、應(yīng)用藥物敏感試驗后，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用。在選擇高敏藥物時應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，這樣才會達(dá)到好的治療效果。項

6、目二、抗體試驗一、實驗用設(shè)備：離心機1臺、冰箱1臺、振蕩器1臺、抗原、96孔V型板、八道移液器、吸頭、積液槽、一次性 采血管、2毫升注射器、紅細(xì)胞、檸檬酸三鈉、重銘酸鉀、硫酸、吸管、吸耳球、針頭、蒸儲水、10 毫升離心管、生理鹽水。二、實驗過程：（一）血凝（HA ）試驗：采用96孔V型反應(yīng)板，測定抗原效價（二）4單位抗原校正：HI ）試驗：每排孔檢查1份血清。（三）血凝抑制（四）結(jié)果判定：以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的1）判定結(jié)果：指數(shù)表示。2）判足標(biāo)準(zhǔn)：育雛育成雞在7以上，產(chǎn)蛋雞在9以上。2 .H5抗體：抗體值在6以上。3 .H9抗體：抗體值在7以上。注：低于

7、以上標(biāo)準(zhǔn)，則需要進(jìn)行免疫。4 ）免疫后抗體規(guī)律一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體，2-3周抗體到達(dá)峰值，可以維持2個月。滅活疫苗免后10- 15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達(dá)峰值，可以維持3-4個月。項目三、PCR檢測一、PCR反應(yīng)的條件設(shè)置PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。1 .溫度與時間的設(shè)置基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點 法，雙鏈 DNA在90695c變性，再迅速冷卻至40s60C,弓I物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70s 75C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短 靶基因（長度為100300bp時） 可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94c變性，65c左右退火 與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活 性）。2 .循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度，一般的循環(huán)次數(shù)選在 30s40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。二、PCR擴增產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出 正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。三、PCR結(jié)果異常分析PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大