RNA病毒檢測簡述實用教案

1、RT-PCRRT-PCR原理原理(yunl)(yunl)提取總RNA以其中的mRNA作為模板 反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR作模板獲得目的基因第1頁/共28頁第一頁，共29頁。一、一、RNARNA的提取的提取(tq)(tq) RNARNA易降解，在提取過程中要嚴(yán)格防止易降解，在提取過程中要嚴(yán)格防止RNARNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。 RNARNA酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚(p f)(p f)、手指、試劑、手指、試劑、容器等。容器等。第2頁/共28頁第二頁，共29頁。采取的措施采取的措施(cush)(cush)：1 1、

2、全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常、全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。更換（使用一次性手套）。2 2、所用的玻璃器皿需置于干熱滅菌箱中、所用的玻璃器皿需置于干熱滅菌箱中200200烘烤烘烤2h2h以上。以上。3 3、不能用高溫烘烤的材料，如塑料容器、不能用高溫烘烤的材料，如塑料容器、試劑等可用試劑等可用0.1%0.1%的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)水水溶液處理，然后高壓滅菌以消除殘存的溶液處理，然后高壓滅菌以消除殘存的DEPCDEPC。 第3頁/共28頁第三頁，共29頁。注意事項：注意事項：1、DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物。與氨水溶液混合會產(chǎn)

3、生致癌物。2、DEPC能與氨基和巰基反應(yīng)能與氨基和巰基反應(yīng)(fnyng)，因而含因而含Tris和和DTT（二硫蘇糖醇）的試劑不（二硫蘇糖醇）的試劑不能用能用DEPC處理。處理。3、Tris溶液可用溶液可用DEPC處理的水配制然后高處理的水配制然后高壓滅菌。壓滅菌。4、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。 第4頁/共28頁第四頁，共29頁。總總RNA提取方法（試劑盒）：提取方法（試劑盒）：異硫氰酸胍苯酚法（異硫氰酸胍苯酚法（Trizol 法）法）原理：（原理：（1）Trizol的主要成分

4、是酚。主要作的主要成分是酚。主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚是有效的蛋白變性劑，但解聚得到釋放。酚是有效的蛋白變性劑，但不能完全抑制不能完全抑制RNA酶活性，因此酶活性，因此Trizol中中還加入了還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、羥基喹啉、異硫氰酸胍、-巰巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。 異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速二級結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核

5、蛋白迅速(xn s)與核酸分離。與核酸分離。第5頁/共28頁第五頁，共29頁。（2 2）氯仿可使蛋白變性，降低）氯仿可使蛋白變性，降低(jingd)(jingd)蛋白的溶解度。其主要作用是分相，實際上是加速有機(jī)相和水相的分蛋白的溶解度。其主要作用是分相，實際上是加速有機(jī)相和水相的分層。上層水相，左右，當(dāng)溶液層。上層水相，左右，當(dāng)溶液pHpH在酸性的時候，在酸性的時候，DNADNA分子就會沉淀在酚與溶液的界面，只有分子就會沉淀在酚與溶液的界面，只有RNARNA分子留在分子留在水相。而當(dāng)水相。而當(dāng)pHpH接近中性時，接近中性時，DNADNA就會溶解在水相，（導(dǎo)致就會溶解在水相，（導(dǎo)致pHpH中性的

6、原因可能是中性的原因可能是trizoltrizol與樣品比例不對，應(yīng)與樣品比例不對，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使該盡量保證提取量的前提下使trizoltrizol過量）。同時，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。過量）。同時，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。第6頁/共28頁第六頁，共29頁。（3 3）異丙醇作用是沉淀）異丙醇作用是沉淀RNARNA。異丙醇沉淀，優(yōu)點。異丙醇沉淀，優(yōu)點(yudin)(yudin)是容積小且速度快，主要沉淀是容積小且速度快，主要沉淀DNADNA和大分子和大分子rRNArRNA和和mRNAmRNA，對，對5sRNA5sRNA、tRNAtRNA不產(chǎn)生沉淀，所以不產(chǎn)生沉淀

7、，所以RNARNA電泳的標(biāo)志性三條帶中電泳的標(biāo)志性三條帶中5sRNA5sRNA帶很不清楚，未必是你的帶很不清楚，未必是你的RNARNA降解。但是異丙醇難以揮發(fā)出去。降解。但是異丙醇難以揮發(fā)出去。（4 4）因為上述試劑會影響后續(xù)實驗，所以用）因為上述試劑會影響后續(xù)實驗，所以用75%75%乙醇洗乙醇洗1-21-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有機(jī)物雜次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有機(jī)物雜質(zhì)；二是洗掉異丙醇、氯仿，乙醇易揮發(fā)，痕量的乙醇很容易揮發(fā)掉。質(zhì)；二是洗掉異丙醇、氯仿，乙醇易揮發(fā)，痕量的乙醇很容易揮發(fā)掉。第7頁/共28頁第七頁，共29頁。Yeast Total RNA第8頁/共28

8、頁第八頁，共29頁。二、二、cDNAcDNA的合成的合成(hchng)(hchng) 反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 種類：兩種種類：兩種 1 1、禽類成髓細(xì)胞病毒（、禽類成髓細(xì)胞病毒（AMVAMV）反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶 包括兩個多肽亞基（最適溫度包括兩個多肽亞基（最適溫度4242） 活性：依賴于活性：依賴于RNARNA的的DNADNA合成，依賴于合成，依賴于DNADNA的的DNADNA合成以及對合成以及對DNA:RNADNA:RNA雜交雜交(zjio)(zjio)體的體的RNARNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA(RNA酶酶H H活性活性)

9、)。第9頁/共28頁第九頁，共29頁。2 2、鼠白血病病毒、鼠白血病病毒(M-MLV)(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 只有只有(zhyu)(zhyu)單個多肽亞基（最適溫度單個多肽亞基（最適溫度3737） 活性：依賴于活性：依賴于RNARNA和依賴于和依賴于DNADNA的的DNADNA合成活性，但降解合成活性，但降解RNA:DNARNA:DNA雜交體中的雜交體中的RNARNA的能力較弱，且對熱的穩(wěn)定性較的能力較弱，且對熱的穩(wěn)定性較AMVAMV反轉(zhuǎn)錄酶差。反轉(zhuǎn)錄酶差。 M-MLV M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(cDNA(如大于如大于2-3kb)2-3kb)。 第10

10、頁/共28頁第十頁，共29頁。 cDNAcDNA引物引物 種類：種類： 1 1、隨機(jī)引物：不特異的引物、隨機(jī)引物：不特異的引物 體系體系(tx)(tx)中所有中所有RNARNA分子全部充當(dāng)了分子全部充當(dāng)了cDNAcDNA第一鏈模板，第一鏈模板，PCRPCR引物在擴(kuò)增過程引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNAcDNA中中96%96%來源于來源于rRNArRNA。 第11頁/共28頁第十一頁，共29頁。2 2、Oligo(dT)Oligo(dT)：是一種對：是一種對mRNAmRNA特異的引物特異的引物絕大多數(shù)真核細(xì)胞絕大多數(shù)真核細(xì)胞m

11、RNAmRNA具有具有3-3-端端Poly(A)Poly(A)尾，此引物（尾，此引物（12-1812-18核苷酸）與其配對，核苷酸）與其配對，僅僅mRNAmRNA可被反轉(zhuǎn)錄?？杀环崔D(zhuǎn)錄。由于由于Poly(A)RNAPoly(A)RNA僅占總僅占總RNARNA的的1-4%1-4%，故此種引物合成，故此種引物合成(hchng)(hchng)的的cDNAcDNA比隨機(jī)引物比隨機(jī)引物得到的得到的cDNAcDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。 第12頁/共28頁第十二頁，共29頁。3 3、特異性引物、特異性引物 用含目標(biāo)用含目標(biāo)RNARNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅

12、產(chǎn)生的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生(chnshng)(chnshng)所需要的所需要的cDNAcDNA，導(dǎo)致更為特，導(dǎo)致更為特異的異的PCRPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。 第13頁/共28頁第十三頁，共29頁。第二章第二章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lin sh fn yng)（PCR）第14頁/共28頁第十四頁，共29頁。退火和中溫延伸過程。第15頁/共28頁第十五頁，共29頁。一、一、PCRPCR基本基本(jbn)(jbn)步驟步驟三個步驟：三個步驟：1、變性、變性(Denature)：雙鏈：雙鏈DNA目的目的(md)片段在片段在94下解鏈。下解鏈。2、退火、退火(Anneal)：

13、兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50左右左右)下與模板上的目的下與模板上的目的(md)序列通過氫鍵配對。序列通過氫鍵配對。3、延伸、延伸(Extension)：在：在Taq DNA聚合酶合成聚合酶合成DNA的最適溫度的最適溫度(72左右左右)下，以目下，以目的的(md)DNA為模板進(jìn)行合成。為模板進(jìn)行合成。 第16頁/共28頁第十六頁，共29頁。二、二、PCR反應(yīng)反應(yīng)(fnyng)中的主要成分中的主要成分 引物：好壞是引物：好壞是PCRPCR成敗的關(guān)鍵。成敗的關(guān)鍵。 設(shè)計原則：設(shè)計原則： 1 1、引物長度約為、引物長度約為16-30bp16-30bp。 2 2、引物中、

14、引物中G+CG+C含量通常為含量通常為40%-60%40%-60%，粗略估計引物的解鏈溫度，粗略估計引物的解鏈溫度TmTm4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)，且接近，且接近7272最好。最好。 3 3、四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在、四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3 3端不存在端不存在(cnzi)(cnzi)連續(xù)連續(xù)3 3個個G G或或C C，因這樣會使引物在，因這樣會使引物在G+CG+C富集序列區(qū)引發(fā)錯誤。富集序列區(qū)引發(fā)錯誤。 第17頁/共28頁第十七頁，共29頁。4 4、引物、引物3-3-端最好與目的序列閱讀框架端最好與目的序列閱讀框架(kun ji)(kun ji)中密碼子第一或第二位

15、核苷酸中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。5 5、在引物內(nèi)，尤其在、在引物內(nèi)，尤其在3-3-端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)，且端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)，且3-3-端盡量不用端盡量不用A A，尤應(yīng)避，尤應(yīng)避免連續(xù)免連續(xù)2 2個或個或2 2個以上個以上A A，因為，因為A A引發(fā)錯配的幾率高；最好選擇引發(fā)錯配的幾率高；最好選擇T T。第18頁/共28頁第十八頁，共29頁。6 6、兩引物之間尤其在、兩引物之間尤其在3-3-端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在物間最好不存在4 4個

16、連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。7 7、引物、引物5-5-端對擴(kuò)增特異性影響端對擴(kuò)增特異性影響(yngxing)(yngxing)不大，可在引物設(shè)計時加上限制酶不大，可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點等，通常應(yīng)在位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點等，通常應(yīng)在5-5-端限制酶位點外再加端限制酶位點外再加1-21-2個保護(hù)堿基。個保護(hù)堿基。 第19頁/共28頁第十九頁，共29頁。8 8、引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補(bǔ)。、引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補(bǔ)。引物濃度：引物濃度： 一般一般(ybn)PCR(ybn)P

17、CR反應(yīng)中的引物終濃度為。反應(yīng)中的引物終濃度為。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。 第20頁/共28頁第二十頁，共29頁。 4 4種三磷酸脫氧核苷酸種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)(dNTP)： dNTPdNTP原液一般配成分裝，原液一般配成分裝，-20-20貯存。貯存。 一般反應(yīng)中每種一般反應(yīng)中每種dNTPdNTP的終濃度為的終濃度為20-200mol/L20-200mol/L。 當(dāng)當(dāng)dNTPdNTP終濃度大于終濃度大于50mmol/L50mmol/L時可抑制時可抑制Taq DNATaq DNA聚合酶的活性。聚合酶的

18、活性。 4 4種種dNTPdNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于(yuy)(yuy)某種某種dNTPdNTP的不足出現(xiàn)的錯的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。誤摻入。 第21頁/共28頁第二十一頁，共29頁。 Mg2+Mg2+： Mg2+ Mg2+濃度對濃度對Taq DNATaq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。 通常通常Mg2+Mg2+濃度范圍濃度范圍(fnwi)(fnwi)為。對于一種新

19、的為。對于一種新的PCRPCR反應(yīng)，可以用的遞增濃度的反應(yīng)，可以用的遞增濃度的Mg2+Mg2+進(jìn)行預(yù)備實驗，選出最適的進(jìn)行預(yù)備實驗，選出最適的Mg2+Mg2+濃度。濃度。 第22頁/共28頁第二十二頁，共29頁。 在在PCRPCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)(j tun)(j tun)，例如磷，例如磷酸基團(tuán)酸基團(tuán)(j tun)(j tun)或或EDTAEDTA等可能影響等可能影響Mg2+Mg2+濃度的物質(zhì)，以保證最適濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+Mg2+濃度。濃度。 模板：模板： PCRPCR中模板中模板DNADNA可以是單鏈

20、分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子以是環(huán)狀分子( (線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好) )。 第23頁/共28頁第二十三頁，共29頁。 就模板就模板DNADNA而言，影響而言，影響PCRPCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。的主要因素是模板的數(shù)量和純度。 一般反應(yīng)中模板量為一般反應(yīng)中模板量為102-105102-105個拷貝。擴(kuò)增單拷貝基因，需要的人基因組個拷貝。擴(kuò)增單拷貝基因，需要的人基因組DNADNA，10ng10ng的酵母的酵母DNADNA，1ng1ng的大腸桿菌的大腸桿菌DNADN

21、A。多拷貝基因擴(kuò)增用量更少。多拷貝基因擴(kuò)增用量更少。 模板過多可能增加非特異性產(chǎn)物。模板過多可能增加非特異性產(chǎn)物。DNADNA中的雜質(zhì)中的雜質(zhì)(zzh)(zzh)也會影響也會影響PCRPCR的效率。的效率。 第24頁/共28頁第二十四頁，共29頁。 Taq DNATaq DNA聚合酶：聚合酶： 一般一般Taq DNATaq DNA聚合酶活性半衰期為聚合酶活性半衰期為92.5 130min92.5 130min，95 40min95 40min， 97 5min 97 5min。 Taq DNATaq DNA聚合酶的酶活性單位定義為聚合酶的酶活性單位定義為74 30min74 30min，摻入，

22、摻入10nmol/L dNTP10nmol/L dNTP到核酸中到核酸中所需的酶量。所需的酶量。 Taq DNATaq DNA聚合酶的一個致命聚合酶的一個致命(zhmng)(zhmng)弱點是它的出錯率，一般弱點是它的出錯率，一般PCRPCR中出錯率為中出錯率為2 210-410-4核苷酸核苷酸/ /每輪循環(huán)，在利用每輪循環(huán)，在利用PCRPCR克隆和進(jìn)行序列分析時尤應(yīng)注意。克隆和進(jìn)行序列分析時尤應(yīng)注意。 第25頁/共28頁第二十五頁，共29頁。 所用的酶量可根據(jù)所用的酶量可根據(jù)DNADNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過多會、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。 反應(yīng)結(jié)束后，需要滅活反應(yīng)結(jié)束后，需要滅活Taq DNATaq DNA聚合酶。聚合酶。 滅活滅活Taq DNATaq DNA聚合酶的方法有：聚合酶的方法有：(1) PCR(1) PCR產(chǎn)物經(jīng)酚產(chǎn)物經(jīng)酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀。氯仿抽提，乙醇沉淀。 (2) (2) 加入加入(jir)10mmol/L(jir)10mmol/L的的EDTAEDTA螯合螯合Mg2+ Mg2+ 。 (3) 99-100 (3) 99-100加熱加熱10mi