基因表達調(diào)控習題

1、（一）名詞解釋1.操縱子；2 .啟動子；3 .增強子；4 .衰減子；5 .反式作用因子；6 .降解物 基因活化蛋白；7.克隆技術；8 .限制性核酸內(nèi)切酶；9 .基因組DNA文庫；10 . cDNA文庫。（二）填充題1 .正調(diào)控和負調(diào)控是基因表達的兩種最基本的調(diào)節(jié)形式，其中原核細胞常用模式，而真核細胞常用模式。2 .在原核細胞中，由同一調(diào)控區(qū)控制的一群功能相關的結構基因組成一個基因表達調(diào) 控單位，稱為，其調(diào)控區(qū)包括基因和基因。3 .有些基因的表達較少受環(huán)境的影響，在一個生物體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，因 此被稱為；另有一些基因表達極易受環(huán)境的影響，在特定環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達

2、產(chǎn)物增加，這種基因是可的基因，相反，如果基因?qū)Νh(huán)境信號應答時被抑制，這種基因是可的基因。4 .在基因重組技術中，切割DN刖,連接DN刖。5 .除噬菌體外，和也是分子克隆的常用載體。6 .用動物病毒DNA改造的基因載體有和 。用于植物基因工程的常用載體是 。7 .將重組質(zhì)粒導入細菌稱8 . Southern 印跡法、Northern 和轉(zhuǎn)移和鑒定的幾種常規(guī)技術。（三）選擇題（在備選答案中選出 1. 一個操縱子通常含有A. 一個啟動序列和一個編碼基因 C.數(shù)個啟動序列和一個編碼基因 E兩個啟動序列和數(shù)個編碼基因2.A.B.C.D.E.3.A.C.E.4.A.,將噬菌體DNA專入細菌稱。印跡法和We

3、stern印跡法是分別用于研究1個或多個正確答案）B.一個啟動序列和數(shù)個編碼基因D.數(shù)個啟動序列和數(shù)個編碼基因有關操縱子學說的論述，正確的是操縱子調(diào)控系統(tǒng)是真核生物基因調(diào)控的主要方式操縱子調(diào)控系統(tǒng)是原核生物基因調(diào)控的主要方式操縱子調(diào)控系統(tǒng)由調(diào)節(jié)基因、操縱基因、啟動子和結構基因組成誘導物與阻遏蛋白結合啟動轉(zhuǎn)錄誘導物與啟動子結合而啟動轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)DNA結合活性的小分子代謝效應物B.調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸速度的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始速度的蛋白質(zhì)D.調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分解速度的蛋白質(zhì)促進轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工的蛋白質(zhì)阻遏蛋白（阻抑蛋白）識別操縱子中的啟動基因B.結構基因C.操縱基因D.內(nèi)含子E.調(diào)節(jié)基因7 .在下列哪種情況下

4、，乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄活性最高A.D.6.高乳糖，低葡萄糖 低乳糖，高葡萄糖 順式作用元件是指B.高乳糖，高葡萄糖E.不一定C.低乳糖，低葡萄糖A.基因的5,側翼序列B.基因的3,側翼序列C.基因的5,和3,側翼序列D.基因的5,和3,側翼序列以外的序列E .具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DN際列7.反式作用因子是指A.具有激活功能的調(diào)節(jié)蛋白B.具有抑制功能的調(diào)節(jié)蛋白C.對自身基因具有激活功能的調(diào)節(jié)蛋白D.對另一基因具有激活功能的調(diào)節(jié)蛋白E.對另一基因有調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)因子8.卜列關于限制性內(nèi)切酶的敘述哪一項是錯誤的A.B.它能識別DNA寺定的堿基順序，并在特定的位點切斷DNA切割點附近的堿基順序一般呈回

5、文結構C.D.它能專一性降解經(jīng)甲基化修飾的DNA是重組DNA勺重要工具酶E.主要從細菌中獲得9.基因工程中，不常用到的酶是A.限制性核酸內(nèi)切酶B. DNA聚合酶C. DNAM鏈酶D. DNA1接酶E.反轉(zhuǎn)錄酶10下列哪項不能作為表達載體導入真核細胞的方法A.磷酸鈣轉(zhuǎn)染C.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染D.氯化鈣轉(zhuǎn)染E.顯微注射11 .重組體的篩選方法有A.抗藥標志篩選 檢測B.標記補救C.分子雜交D.免疫化學E.酶聯(lián)免疫12 . cDNt指A.在體內(nèi)合成的與病毒 DNA< RNAM補的DNAB.在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與DNAM補的 DNAC.在體外經(jīng)轉(zhuǎn)錄合成的與DNA5補的 RNAD.在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與R

6、NAM補的 DNAE.在體內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄合成的與DNA5補的 RNA13 .建cDNA文庫時，首先需分離細胞的D. tRNA E .rRNAA.染色體 DNA B .線粒體 DNA C.總 mRNA（四）判斷題1 .高等真核生物的大部分 DNA是不為蛋白質(zhì)編碼的。2 .大多數(shù)管家基因編碼低豐度的mRNA3 .乳糖可以誘導乳糖操縱子的表達，所以乳糖對乳糖操縱子的調(diào)控屬于正調(diào)控系統(tǒng)。4 .某些蛋白質(zhì)既可以作為阻遏蛋白又可以作為激活蛋白參與基因表達的調(diào)控。5.準備用原核生物表達真核基因時，最好通過cDNA獲取目的基因。6 .用原核生物表達真核生物的糖蛋白，其表達產(chǎn)物不會有正常的生物學功能。7 . Ti質(zhì)粒

7、可以隨土壤農(nóng)桿菌進入植物細胞。8 .用入噬菌體作克隆載體時，外源DNA片斷越小，克隆的成功率越高。9 .基因克隆選擇的宿主細胞必須無限制性核酸內(nèi)切酶。10 .采用藍白斑選擇法時，藍色菌落或噬菌斑是含有重組載體的克隆。（五）分析與計算題1 .簡述操縱子的基本結構。2 .舉例說明基因表達的誘導與阻遏，正調(diào)控與負調(diào)控。3 .概述原核生物基因表達調(diào)控的特點。4 .概述真核生物基因組的特點。5 .概述真核生物基因表達調(diào)控的特點。6 .簡答真核生物基因表達的調(diào)控方式。7 .常用的限制性核酸內(nèi)切酶有哪些特點？8 .在基因克隆中，目的基因有哪些主要來源？9 .什么是cDNA文庫？cDNA文庫與基因組文庫有何差

8、別 ？10 .用于DNA重組的載體應具備什么條件 ？常用的載體有哪一些？各有何特點？11 .簡述連接目的基因與載體的主要方法？12 .概述篩選和鑒定 DNAt組體的常用方法。參考答案（一）名詞解釋1 .原核生物的幾個功能相關的結構基因往往排列在一起，轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA然后分別翻譯成幾種不同的蛋白質(zhì)。這些蛋白可能是催化某一代謝過程的酶，或共同完成某種功能。這些結構基因與其上游的啟動子，操縱基因共同構成轉(zhuǎn)錄單位，稱操縱子。順式調(diào)控元件：指可影響自身基因表達活性的真核DNA列。根據(jù)順式作用元件在基因中的位置、轉(zhuǎn)錄激活作用的性質(zhì)及發(fā)揮作用的方式，分為啟動子、增強子及沉默子等。2 .是RNA聚合酶結合

9、位點周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，包括至少一個轉(zhuǎn)錄起始點。在真 核基因中增強子和啟動子常交錯覆蓋或連續(xù)。有時，將結構密切聯(lián)系而無法區(qū)分的啟動子、 增強子樣結構統(tǒng)稱啟動子。3 .是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約 200bp的一段DNA可使旁側的基因轉(zhuǎn)錄提高 100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都 發(fā)現(xiàn)了增強子。增強子通常占100200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，基本核心組件常為812bp,可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。4 .在原核生物的Trp操縱子結構中，第一個結構基因與啟動子 P之間有一個區(qū)域含 Trp 密碼子，稱衰減子。當環(huán)境中Trp濃

10、度很高時，它可通過編碼并翻譯，使正在轉(zhuǎn)錄的mRNA形成終止信號，從而終止Trp操縱子的表達。這種轉(zhuǎn)錄衰減實質(zhì)上是轉(zhuǎn)錄與一個前導肽翻譯 過程的偶聯(lián)，它是原核生物特有的一種基因調(diào)控機制。5 .大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達后，通過與特異的順式作用元件相互作用 （DN/V蛋白質(zhì)相互作用），或通過與基它調(diào)節(jié)因子的相互作用（蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用），反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用蛋白或反式作用因子。6 .也就是cAM咫體蛋白（cAMP receptor protein , CRP ,它與cAMP的復合物可以 促進某些原核操縱子（如乳糖操縱子）的轉(zhuǎn)錄。7 . “克隆”作為名詞指相同的分子或細胞

11、構成的群體，或一個共同的祖先通過無性繁殖所得到的群體，作為動詞指獲取“克隆”的過程?？寺〖夹g特指獲取“克隆”的過程，包括分子克隆，細胞克隆等技術。8 .就是識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶存在于細菌體內(nèi)，與相伴存在的甲基化酶共同構成細菌的限制、修飾體系，限制外源DNA保護自身DNA對保持細菌遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定具有重要意義。限制性核酸內(nèi)切 酶分為三類，其中的n類酶能特異性在一定的核甘酸序列處切割雙鏈DNA因而在基因工程中得到廣泛的應用。9 .利用限制性核酸內(nèi)切酶將染色體DNA切割成一定大小的片段，將這些片段分子與適當?shù)目寺≥d體拼接成重組 DN

12、酚子，繼而轉(zhuǎn)入受體菌，使每個細菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子。不同細菌中的重組 DN6子可能包含不同的染色體 DNA片段，這樣，只要得到的轉(zhuǎn)化 細菌所攜帶的重組 DN酚子種類足夠多，則全部轉(zhuǎn)化細菌所攜帶的各種染色體片段就代表了 染色體的整個基因組。 存在于轉(zhuǎn)化細菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合稱基因組DN成庫?；蚪MDNAt庫涵蓋了基因組的全部基因信息。10 .以mRN朋模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA與適當?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部 mRNA言息的cDNA隆集合稱為該組織細胞的 cDN

13、A文庫?；蚪M含有的基因 在特定的組織細胞中只有一部分表達，而且處在不同環(huán)境條件、 不同分化時期的細胞其基因表達的種類和強度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細胞特異性。cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。另外，對真核細胞來說，從基因組 DNAt庫獲得的基因與從 cDNA文庫獲得的不同，基因組 DNAt庫所含的 是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經(jīng)過剪接，去除了內(nèi)含子的cDNA 一般來說，從cDNA文庫獲得的基因，因不含內(nèi)含子而片段較小，更適合于用作 基因工程的目的基因。由于原核生物不存在將hnRN劭口工成mR

14、NA勺酶系統(tǒng)，若用原核生物表達真核基因，則目的基因一定要通過cDNA獲取。（二）填充題11 負調(diào)控，正調(diào)控； 2 .啟動子，啟動，操縱；3 .管家基因，誘導，阻遏； 4 .限 制性核酸內(nèi)切，DNA1接；5 .質(zhì)粒，病毒；6 .腺病毒載體，反轉(zhuǎn)錄病載體，Ti質(zhì)粒。7 .轉(zhuǎn) 化，轉(zhuǎn)導；8 . DNA RNA蛋白質(zhì)；（三）選擇題（在備選答案中選出1個或多個正確答案）1. （ B）操縱子均含有數(shù)個編碼基因，但啟動序列只有1個。2. (B, C, D)操縱子調(diào)控系統(tǒng)由調(diào)節(jié)基因，操縱基因，啟動子和多個結構基因組成， 是原核生物基因表達調(diào)控的主要方式，誘導物與組遏蛋白結合啟動轉(zhuǎn)錄。誘導物不能直接與啟動子結合

15、。真核生物不存在操縱子調(diào)控系統(tǒng)。3. (C)轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的蛋白質(zhì)，對轉(zhuǎn)錄延伸的速度，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分解的速度 和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工均無影響。4. (C)操縱基因位于啟動基因與結構基因之間，阻遏蛋白與操縱基因結合后，與啟動 基因結合的RNA聚合酶不能轉(zhuǎn)錄結構基因。5. (A)參與乳糖代謝的三種酶的表達同時受控于正負調(diào)控兩種機制，只有在正調(diào)控發(fā) 揮作用，負調(diào)控不起作用的時候，這三種酶才能有效的表達。當培養(yǎng)基中加入乳糖的時候， 參與負調(diào)控的阻遏蛋白將失去活性，但如果培養(yǎng)基中含有葡萄糖，則細菌優(yōu)先利用葡萄糖， 這時參與乳糖代謝的酶仍然不能有效的表達，這是因為葡萄糖降低了細胞內(nèi)的cAMPK平，而cAM瞰

16、度的降低，導致降解物激活蛋白喪失活性，正調(diào)控的機制失去作用，這時三種酶 不可能正常的表達。6. (E)順式作用元件是對某基因自身有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，其中的啟動子多在基因的5,側翼，但增強子既可以在 5,側翼，又可以在 3,側翼，一般距基因較遠。有些順式 作用元件甚至可以在基因內(nèi)部。7. ( E)反式作用因子是指對另一基因的表達有激活或抑制作用的蛋白質(zhì)因子。8. (C)限制性核酸內(nèi)切酶主要存在于細菌，它可以水解外源DNA而自身DN刖在特定位點被甲基化而可以免遭水解。限制性核酸內(nèi)切酶由于可識別特定的堿基序列并在特定的 位點切割雙鏈DNA因而在基因工程中得到廣泛的使用。9. (C) DNA聚合酶

17、可用來獲取目的基因，測序和PCR等項工作，限制性核酸內(nèi)切酶用于DNA酶切片段長度的多態(tài)性分析，載體和目的基因的特異性切割等工作，DNA1接酶可用于基因重組的連接反應。DNAB鏈酶在基因工程中幾乎用不到。10. (D) CaCl2處理受體細胞是提高細菌轉(zhuǎn)化率的常用方法，不適用于真核生物，題 中列出的其余4種方法均可用于將表達載體導入真核細胞。11. (A, B, C, D, E)題中列出的5種方法均可用于重組體的篩選。12. (D) cDNA旨在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與 RNA5補的DNA13. (C) cDNAC庫應包含某一細胞在某一狀態(tài)下所表達的基因，因此，構建cDNAC庫首先要分離細胞的總 m

18、RNA(四)判斷題1 .對。高等真核生物的 DNA中含有不少高度重復序列的非編碼序列，基因內(nèi)部又有內(nèi) 含子，不少基因內(nèi)含子的總長度遠遠大于外顯子。因此，真核生物的編碼區(qū)只占 DNA總長度的一小部分，一般認為，編碼區(qū)不超過總長度的5%2 .對。管家基因是持續(xù)表達的，mRNA度不高，但壽命較長，翻譯效率較高。3 .錯。乳糖被轉(zhuǎn)化為別乳糖后，與乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白結合，使阻遏 蛋白失去活性。由于這一調(diào)控方式起作用的是阻遏蛋白，故屬于負調(diào)控。4 .對。某些蛋白質(zhì)能夠與 DNA分子的不同區(qū)域結合，分別發(fā)揮激活蛋白或阻遏蛋白的 作用。5 .對。真核生物的基因多數(shù)含有內(nèi)含子，原核生物缺乏從轉(zhuǎn)錄初

19、級產(chǎn)物切除內(nèi)含子的加工系統(tǒng)，另外，如果將基因組 DNA乍為目的基因，基因片段因含有內(nèi)含子而過大，也會降低基因轉(zhuǎn)移白成功率。cDNA是以成熟mRN朋模板經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄制成的，不含內(nèi)含子，適合于 作為目的基因用于基因的克隆或表達。6 .對。原核生物缺乏真核生物的翻譯后加工系統(tǒng)。不能對蛋白質(zhì)進行糖基化。因此， 表達糖蛋白要用真核表達系統(tǒng)。7 .錯。土壤農(nóng)桿菌可以促進 Ti質(zhì)粒進入植物細胞，但農(nóng)桿菌本身并不進入植物細胞。8 .錯。入噬菌體的外殼蛋白只能包裝長度為噬菌體DNA78% 105%勺DNA若外源DNA片段太小，重組體 DNA勺長度小于 噬菌體DNA的78%就不能在體外包裝成噬菌體，因而， 克隆很難

20、成功。9 .對。如果宿主細胞有限制性核酸內(nèi)切酶，將會水解進入宿主細胞的重組體DNA導致克隆失敗。10 .錯。采用藍的斑選擇法時，克隆位點被選在表達一肽的基因內(nèi)，含有空載體的受體菌可以在IPTG （異丙基硫代 D半乳糖甘）的誘導下，表達 肽，通過與受體菌的 一互補，能夠水解 X gal （5-澳一 4氯一 3-口引喋 D半乳糖甘）生成藍色的水解產(chǎn) 物，因而菌落或噬菌斑為藍色。含有重組DNA的受體菌，由于外源基因插入表達一肽的基因內(nèi)，不能表達 一肽，因而，菌落或噬菌斑為白色。（五）分析與計算題1 .操縱子的調(diào)控區(qū)有一個操縱序列，一個啟動序列及一個CA暇點，調(diào)控區(qū)下游有幾個結構基因，還有一個調(diào)節(jié)基因

21、編碼阻遏蛋白，阻遏蛋白與操縱序列結合，使操縱子受阻遏而處于關閉狀態(tài)。若 cAMP與CAP結合，形成的復合物與 CAP位點結合，可增大操縱子的轉(zhuǎn) 錄活性。阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)和 CAP的正性調(diào)節(jié)共同調(diào)節(jié)結構基因的表達，操縱子機制在原核基因表達調(diào)控中具有較善遍的意義，因其多是幾個功能相關基因串聯(lián)于同一操縱子上，故在同一啟動序列控制下，可轉(zhuǎn)錄出能為多種蛋白質(zhì)編碼的mRNA即多順反子mRNA2 .在特定的環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達產(chǎn)物增加，則這種基因是可誘導的?？烧T導基因在特定的環(huán)境中表達增強的過程稱為誘導。例如有DNA損傷時，修復酶基因就會在細菌內(nèi)被誘導激活，使修復酶的活性增加。相反，

22、如果基因?qū)Νh(huán)境信號應答時被抑制則這種基因是可阻遏的，可阻遏基因表達產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏，例如，當培養(yǎng)液中色氨酸供應充分時，在細菌內(nèi)編碼色氨酸合成相關酶的基因表達會被抑制。如果某種基因在沒有調(diào)節(jié)蛋白存在時是表達的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白后基因表達活性便被關閉，這樣的控制為負調(diào)控。例如，乳糖操縱子。相反，若某種基因在沒有調(diào)節(jié)蛋白存在時是關閉的，加 入某種調(diào)節(jié)蛋白后基因活性就被開啟，這種控制稱為正調(diào)控。例如代謝物阻遏。3 .原核基因表達調(diào)控與真核存在很多共同之處，但因原核生物沒有細胞核和亞細胞結 構，其基因組結構要比真核生物簡單，基因表達的調(diào)控因此而比較簡單。雖然原核基因的表達也受轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄終止

23、、翻譯調(diào)控及RNA蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等多級調(diào)控，但其表達開、關的關鍵機制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始。其特點包括以下3方面：（1） b因子決定RNAm合酶的識別特異性：原核生物只有一種RNA聚合酶，核心酶催化轉(zhuǎn)錄的延長，亞基識別特異啟動序列，即不同的 因子協(xié)助啟動不同基因的轉(zhuǎn)錄。（2）操縱子模型的普遍性：除個別基因外，原核生物絕大數(shù)基因按功能相關性成簇地連續(xù)排列在染色體上，共同組成一個轉(zhuǎn)錄單位即操縱子，如乳糖操縱子等。一個操縱子含一個啟動序列及數(shù)個編碼基因。在同一個啟動序列控制下，轉(zhuǎn)錄出多順反子 mRNA （3）阻遏蛋白與阻遏機制的普遍性：在很多原核操縱子 系統(tǒng)，特異的阻遏蛋白是控制啟動序列活性的重要因素。

24、當阻遏蛋白與操縱基因結合或解離時，結構基因的轉(zhuǎn)錄被阻遏或去阻遏。4 （1）基因組結構龐大：哺乳動物基因組DNA由約bp的核甘酸組成。大約有 3萬個左右的基因，90%以上的DNA不為蛋白質(zhì)編碼。真核細胞 DNAf組蛋白結合形成復雜的染色質(zhì) 結構，基因表達調(diào)控機制更加復雜。（2）單順反子：真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，即一個編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個 mRN粉子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈。許多蛋白質(zhì)由幾條不同的多 肽鏈組成，因此存在多個基因的協(xié)調(diào)表達。（3）重復序列：重復序列在真核 DNA中普遍存在，重復序列長短不一，短的在10個核甘酸以下，長的達數(shù)百，乃至上千個核甘酸。據(jù)重復頻率不同分為高度重復序列、中度重

25、復序列及單拷貝序列。（4）基因的不連續(xù)性：結構基因的兩側有不被轉(zhuǎn)錄的非編碼序列，往往是基因表達的調(diào)控區(qū)。在編碼基因內(nèi)部有一些不為蛋白質(zhì)編碼的間隔序列，稱內(nèi)含子，而編碼序列稱外顯子，因此真核基因是不連續(xù)的。5 .同原核生物一樣，真核基因表達調(diào)控的最基本環(huán)節(jié)也是轉(zhuǎn)錄起始，而且某些機制是 相同的，但也存在明顯差別：（1） RNA聚合酶：真核有3種RNA聚合酶，分別負責 3種RNA轉(zhuǎn)錄。（2）活性染色質(zhì)結構變化：當基因被激活時，可觀察到染色體相應區(qū)域發(fā)生結構和 性質(zhì)變化。包括對核酸酶敏感，DN麗撲結構變化，DNA堿基修飾變化和組蛋白變化。（3）正調(diào)節(jié)占主導地位：真核RNA聚合酶對啟動子的親和力極小或根

26、本沒有實質(zhì)性的親和力，二者的結合必須依賴一種或多種激活蛋白。盡管發(fā)現(xiàn)少量基因存在負性順式作用元件，但普遍存在的是正性調(diào)節(jié)機制。（4）轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進行：真核細胞有胞核及胞質(zhì)等區(qū)間分布， 轉(zhuǎn)錄與翻譯在不同亞細胞結構中進行。（5）轉(zhuǎn)錄后加工：真核基因的內(nèi)含子和外顯子均被轉(zhuǎn)錄，內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄后要被剪接去除，使外顯子連接在一起，形成成熟的mRNA不同剪接方式可形成不同的 mRNA翻譯出不同的多肽鏈。因此，轉(zhuǎn)錄后加工是真核基因表達調(diào)控的 另一重要環(huán)節(jié)。6 . （1） DNA水平的調(diào)控：a.基因丟失，即 DNA片段或部分染色體的丟失，如蛔蟲胚 胎發(fā)育過程有27%勺DNA丟失。b.基因擴增，即特定基因在特定階

27、段的選擇性擴增，如非 洲爪蟾卵母細胞中的 rDNA是體細胞的4000倍。c. DNA序列的重排，如哺乳動物免疫球蛋 白各編碼區(qū)的連接。d.染色質(zhì)結構的變化，通過異染色質(zhì)關閉某些基因的表達。e. DNA的修飾，如DNA勺甲基化關閉某些基因的活性。（ 2）轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 。a.染色質(zhì)的活化， 如核小體結構的解開、非組蛋白的作用等。b.轉(zhuǎn)錄因子的作用，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶及特定的DN際列（啟動子、增強子）相互作用實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。（3）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 。a. mRN廁體的加工，如 5'端加帽、3'端加尾、拼接、修飾、編輯等。B. mRNA勺選擇性拼接，如抗體基因的選擇性拼接。（4

28、）翻譯水平的調(diào)控。a.控制mRNA勺穩(wěn)定T如5'端的帽子結構、3'端polyA尾巴和mRNAf蛋白質(zhì)的結合有利于 mRNA內(nèi)穩(wěn)定。b.反義RNA 的作用，反義 RNA可以選擇性抑制某些基因的表達。c.選擇性翻譯，如血紅素缺乏時，通過級聯(lián)反應使eIF2磷酸化。d.抑制翻譯的起始。（5）翻譯后水平的調(diào)控。a.多肽鏈的加工和折疊，如糖基化、乙?；?、磷酸化、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)的降解。b.氨基酸的重排，如合成伴刀豆蛋白 A時，氨基酸序列大幅度地被剪接重排。c.通過肽鏈的斷裂等的加工方式產(chǎn)生不同的活性多肽。7. n型限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）是基因工程中常用的重要工具酶，是一類能識別 雙鏈

29、DNA分子中特異核甘酸序列的核酸內(nèi)切酶，常用的限制酶主要有以下特點：（1）均來自于微生物，并以其來源的微生物學名進行命名；（2）相對分子質(zhì)量小，僅需 Mg2+作為輔助因子，無需 ATR （ 3）識別特異性DNA鏈順序，在序列內(nèi)特異切割產(chǎn)生特異性DNA片段；（4）識別序列長度為連續(xù)的 4/6/8bp ; （5）識別序列呈二重旋轉(zhuǎn)對稱，稱回文結構， 富含GC （6）有3種切口： 5'端突出的黏性末端 （如Hindm），3'端突出的黏性末端 （如 Pst I）和平末端（如 H加工）。8. （1）從染色體DNA中直接分離：主要針對原核生物。（2）化學合成法：由已知多肽的氨基酸序列，推得

30、編碼這些氨基酸的核甘酸序列，利用DN蛤成儀人工合成其基因。（3）從基因組DNAC庫中篩選分離組織/細胞染色體DNA利用限制性核酸內(nèi)切酶將染色體DNA切割成片段，與適當?shù)目寺≥d體連接后轉(zhuǎn)入受體菌擴增，即獲得基因組DNA文庫，用核酸探針將所需目的基因從基因文庫中“釣”取出來。（4）從文庫中篩選cDNA提取mRNA利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與其互補的 DNA（cDNA分子，再復制成雙鏈 cDNA片段，與適當載體連接后 轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得 cDNA文庫，然后采用適當方法從cDNAC庫中篩選出目的 cDNA （5）用PCR從基因組DNAe cDNA中擴增目的基因。9. 同mRNAT補的DNA為cDNA cDNA文

31、庫是以某一細胞的總 mRN徼模板，在無細胞 系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成互補DNA的第一鏈，破壞RNA莫板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈， 得到雙鏈cDNA選用適合的載體，與合成的cDNA重組，導入寄主細胞， 經(jīng)篩選得到的cDNA克隆群稱為cDNA文庫。由于cDNA技術合成的是不含內(nèi)含子的功能基因， 因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細胞內(nèi)的基因在表達的時間上并非是統(tǒng)一 的，具有發(fā)育的階段性和時間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNAC庫不可能構建得十分完全，也就是說任何一個cDNAC庫都不可能包含某一生物的全部編碼基因。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別是：（1）基因組

32、文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的 DNA序列，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結構基因，包括調(diào)節(jié)基因。（2）基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響，cDNA文庫克隆的是被轉(zhuǎn)錄 DN際列（因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響）。（3）基因組文庫中的編碼基因是含有內(nèi)含子和外顯子，而cDNA克隆的基因不含內(nèi)含子。10. DNA重組載體應具備的條件：（1）能自主復制；（2）具有一種或多種限制性內(nèi)切 酶的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不影響其復制功能；（3）具有12個篩選標記；（4）克隆載體必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn) 入其他生物細胞；（5）易于操作，轉(zhuǎn)化效率

33、高。常用的基因載體有以下幾種：（1）質(zhì)粒：是細菌染色體以外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，本身有復制功能，且?guī)в心承┻x擇信息， 但可插入的目的基因片段較小。（2）噬菌體DNA是一種病毒 DNA能插入比較大的外源 DNA 片段，在DNA分子上有多種限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，便于多種外源DNA酶切片段的克隆。（4）柯斯質(zhì)粒載體和酵母人工染色體：前者結合了質(zhì)粒和 噬菌體載體的優(yōu)點，也是一種環(huán)形雙鏈DNA子，具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 并自行復制和增殖，但它不會產(chǎn)生 子代噬菌體，構建成的此種載體較小，因此能插入比較大的外源 DNA片段，所以被廣泛地用 于構建基因組文庫。后者既含有大腸桿菌來源的質(zhì)粒復

34、制起始位點，又含有酵母菌染色體 DNAt絲點，端粒和復制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因，可在轉(zhuǎn)化的酵母菌細 胞內(nèi)，按染色體DNAM制的形式復制重組 DNA容納外源DNA段的能力比前3種載體大得 多。11. （1）黏性末端連接：用同一限制酶切割載體及目的基因后，產(chǎn)生完全相同的黏性 末端，可以用DNA1接酶直接進行共價連接。 或兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的配 伍末端（相同類型的黏性末端）之間也可以進行黏性末端連接。（2）平端連接：某些限制酶切割DNA產(chǎn)生平頭末端，由于平頭末端5'端帶有磷酸，3'帶有游離羥基,可在 DNA連接酶作用下直接連接， 并且不管末端序列如何均可連接，但連接效率要比黏性末端之間的連接低。（3）同聚物加尾連接：利用同聚物序列，如多聚 A與多聚T之間的退火作用完成 連接。如果載體和目的基因上找不到共同的酶切點時，可經(jīng)不同的限制酶切割后，用單