中藥中有機酸的提取分離與測定

1、中藥中有機酸的提取分離與測定摘要：綜述了中藥中有機酸類成分的提取分離及測定方法研究進展。 隨著天然產(chǎn)物的化學和藥理學研究不斷深入及分析手段突飛猛進的發(fā)展,中藥有機酸類成分的研究引起了國內(nèi)外許多學者極大的興趣。我國天然有機酸資源豐富,在中藥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了較多種類和數(shù)量的有機酸類成分,越來越多的研究證明,中藥中的有機酸類成分具有廣泛的生物活性1。傳統(tǒng)的和現(xiàn)代的提取分離和測定方法各有優(yōu)劣，采用合適的提取分離和測定方法，不僅可以提高提取及檢測效率，還可以為后續(xù)有機酸的提取分離及測定帶來方便。關(guān)鍵詞:有機酸;提取分離;測定1 中藥有機酸類成分的提取分離 中藥中有機酸提取分離方法的選擇主要是根據(jù)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的

2、不同來確定最佳方法。 1.1 堿提酸沉法有機酸在植物中成鹽或者呈游離態(tài)時,可用水或者稀堿水(如1%碳酸氫鈉)直接提取,提取液酸化后濾出沉淀,提取液加無機酸酸化后,析出總游離有機酸,以過濾法或非極性有機溶劑萃取法得總有機酸。陳琦等2通過比較別采用超聲提取法、堿提酸沉法、酸沉后有機溶劑萃取法、有機溶劑加酸水直接提取法等多種方法提取鵝不食草總有機酸，并用分光光度法測定總有機酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿提酸沉法為鵝不食草總有機酸最佳提取方法，總有機酸含量為67.3%。 1.2 有機溶劑提取法溶劑提取法一般指從中草藥中提取有效部位的方法，根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性，選用對活性成分溶解度大、對不需要溶出成

3、分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。由于游離的有機酸(分子量小的除外)易溶于有機溶劑而難溶于水,有機酸鹽則易溶于水而難溶于有機溶劑,所以一般可先酸化使有機酸游離,然后選用合適的有機溶劑提取。張毅等3利用正交試驗優(yōu)選宣木瓜總有機酸，采用不同乙醇濃度對宣木瓜進行提取，最佳提取工藝為乙醇濃度80%，料液比為1:25，提取溫度為90，提取時間為3h，宣木瓜總有機酸的得率為10.46%，表明該工藝穩(wěn)定、可行，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。魯旺旺等4考察低溫酶解輔助乙醇浸提法代替?zhèn)鹘y(tǒng)乙醇回流法提取青梅中有機酸的得率，研究結(jié)果表明果膠酶對青梅酶解能力顯著，影響青梅有機酸提取效果的主要因素為酶解溫度

4、、酶解時間、酶添加量。青梅中有機酸適宜酶解輔助浸提提取的工藝條件為酶添加量31.6U/mL、酶解溫度45.67、酶解時間3.41，相應(yīng)提取液中總有機酸的提取率為35.49，較傳統(tǒng)乙醇回流法提取率（29.10）有顯著提高。1.3 超臨界提取法 一種流體（氣體或液體），當溫度和壓力均超過相應(yīng)臨界點值時，則稱該狀態(tài)下的流體為超臨界流體。超臨界流體萃取技術(shù)（SFE）是一種以超臨界流體代替常規(guī)有機溶劑對重要有效成分進行提取分離的新型分離技術(shù)，在超臨界狀態(tài)下，流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地依次把極性大小、沸點高低和分子質(zhì)量大小的不同成分萃取出來5-6。蔣盛巖等7采用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)，提取

5、夏枯草果穗中的熊果酸，并用高效液相色譜法測定萃取物中熊果酸含量在萃取溫度為30，萃取壓力為15MPa，攜帶劑甲醇:乙醇=1:1，萃取時間為90min時萃取效果好，萃取物中熊果酸含量高，熊果酸提取比較完全1.4 超聲提取法 超聲提取技術(shù)(UAE)是利用超聲波的強振動、高加速度、強空化效應(yīng)、強攪拌作用來縮短天然產(chǎn)物有效成分進入溶劑的時間,加快提取過程,提高提出率,并有效避免高溫對有效成分的破壞8。潘明等9采用超聲波強化提取薺菜中有機酸，在溫度70,時間35min,料液比1:18(g/mL),超聲波功率140W組合參數(shù)條件下,有機酸提取率1.76%。1.5 微波提取法微波提取(萃取)即微波輔助提取(

6、MAE)，是利用微波場的特性和優(yōu)點來強化天然藥物(中藥)有效物質(zhì)浸出的新型提取方法。微波提取方法適用于對熱穩(wěn)定的有效成分，但對于熱敏性物質(zhì)，微波加熱能導(dǎo)致其變性失活，富含淀粉、樹膠的天然植物也不適合10。在比較煎煮法、加熱回流法及微波法提取升麻中阿魏酸時，趙志添等11對其提取工藝進行比較,確定微波法為最佳提取方法。在乙醇體積分數(shù)70%、液料比20:1(mL/g)、微波輻射時間90s、微波輻射功率385W,在此條件下,阿魏酸提取率可達0.0593%。1.6 水蒸汽蒸餾法 某些揮發(fā)性的低級脂肪酸或者芳香酸還可以用水蒸氣蒸餾法分得,操作簡單方便,但使用范圍有限。 2 中藥有機酸類成分的測定 2.1

7、中藥總有機酸的含量測定 中國藥典2010年版一部附錄A中采用電位滴定法測定總有機酸的含量。中藥提取液的顏色往往比較深,從而干擾了摘定終點的確定,限制了它的應(yīng)用。這種情況下可采用電位滴定法,即利用電位的變化來確定滴定終點,此法用于中藥中總有機酸含量的測定更為準確。李永慧等12采用用85%乙醇回流提取五味子中有機酸，避免了酸堿滴定法中有機酸提取液顏色較深對滴定終點的干擾。朱晨晨等13以水為溶劑，通過試驗，采用電位滴定法考察不同加工方法和不同貯藏時間對木瓜藥材中水溶性有機酸含量的影響。研究表明，木瓜水溶性總有機酸的滴定曲線呈現(xiàn)出明顯的滴定突躍和較大的突躍范圍，與蘋果酸對照品的滴定曲線極其相似。 直接

8、電位滴定法可以定量測定但沒有消除其他具有羧基的物質(zhì)如氨基酸類的干擾，對于一些同時含有氨基酸和有機酸的藥材及其制劑來說會使測定結(jié)果出現(xiàn)偏差。劉麗敏等14建立板藍根藥材及顆粒中總有機酸含量測定方法，將板藍根藥材、顆粒以70%乙醇回流提取或分次溶解后，通過SA-2陽離子樹脂消除氨基酸干擾后采用直接電位滴定法測定總有機酸的含量。張奇等15五味子提取物用水溶解,經(jīng)0011陽離子交換樹脂將鹽還原為酸，以琥珀酸為對照品,用電位滴定法測定五味子提取物中總有機酸的含量穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。為有效避免直接滴定法中因有機酸成分強弱不一而導(dǎo)致滴定反應(yīng)速度緩慢的特點可采用反滴定法16。以水楊酸為對照品，潘利明等17應(yīng)用電

9、位返滴定法測定了廣東省10個不同產(chǎn)地及廣州地區(qū)不同月份采集的玉葉金花藥材，方法的重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性都比較好,可操作性強。2.2 中藥有機酸類單體成分的分析測定方法2.2.1 高效液相色譜法 高效液相色譜法(HPLC)是目前應(yīng)用最廣泛的液相色譜法,其分離模式與檢測方法多種多樣,可以根據(jù)樣品的構(gòu)成與性質(zhì)來選擇合適的色譜條件(色譜柱、流動相、檢測器)。有機酸在水中很容易發(fā)生電離,產(chǎn)生多峰現(xiàn)象。為了使有機酸盡可能地以分子形式存在,一般使用酸性流動相來抑制有機酸的離解。通常在流動相中加入磷酸鹽緩沖液、冰醋酸、磷酸等。 査孝柱等18使用Shim-pack CLC-ODS色譜柱，流動相為甲醇-水-冰醋酸

10、-三乙胺(265:35:0.1:0.05)，二極管陣列檢測器，檢測波長為210nm,對含齊墩果酸和熊果酸的10種果實類中藥HPLC分析，所建立的色譜條件下，齊墩果酸與熊果酸之間分離度均較好(R1.68)。陶君彥等19Kromasil C18色譜柱流動相:(A)乙腈、(B)0.05%磷酸進行梯度洗脫,檢測波長325nm,測定了木瓜中綠原酸、咖啡酸的含量，所得結(jié)果重現(xiàn)性好,能很好控制木瓜的藥材質(zhì)量。2.2.2 高效毛細管電泳法高效毛細管電泳法(HPCE)為近年來發(fā)展最快的一種分離分析技術(shù),具有分離效率高、分析速度快和樣品用量少等優(yōu)點。HPCE是以高壓電場為驅(qū)動力,以毛細管為通道,依據(jù)樣品中各組分之

11、間電泳或分配行為的差異而實現(xiàn)分離的液相分離技術(shù)16。趙陸華等20建立了烏骨藤藥材及其制劑中綠原酸的毛細管電泳分離分析方法,分析測定了其中綠原酸的含量,色譜條件:緩沖液200mmmol/L硼酸和10%甲醇(調(diào)節(jié)PH=8.0),分離電壓30kV,檢測波長328nm,溫度25。測定結(jié)果準確、重復(fù)性好,可為烏骨藤藥材及其制劑的質(zhì)量研究提供一種新的分析方法。遲道兵等21將紫外分光光度計與高效毛細管電泳兩種測定熊果酸的方法進行比較分析，發(fā)現(xiàn)高效毛細管電泳法簡便、快速, 準確度和靈敏度均明顯高于紫外分光光度法, 并建立了高效毛細管電泳(HPCE)法測定山茱萸中熊果酸含量的方法。該方法建立的條件為以15mmo

12、l/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)-15 mmol/L硼砂(Na2B4O7)(pH9.22)、含10%甲醇(v/v)的緩沖體系作為運行電解質(zhì)溶液, 檢測波長214 nm分離電壓20.0kV, 可實現(xiàn)熊果酸分離檢測。2.2.3 液質(zhì)聯(lián)用法中藥材及中成藥中有機酸含量的測定多采用HPLC-UV法或HPLC-ELSD,但這兩種方法受外界條件影響大,試驗結(jié)果重現(xiàn)性和靈敏度等不夠理想。有報道稱采用高效液相色譜三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法,所得結(jié)果靈敏度高、選擇性好和穩(wěn)定性均能滿足要求,能夠更準確快速地分析樣品中有機酸的含量22。嚴志宏等22采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)法測定金櫻子中熊果

13、酸和齊墩果酸的含量,色譜柱DiamonsilC18,流動相甲醇-甲酸水(87:13),質(zhì)譜采用大氣壓電噴霧離子源,選擇性離子流模式(負離子)。所得結(jié)果表明該方法快速簡便,靈敏度高,重現(xiàn)性好，可用于金櫻子的質(zhì)量控制。朱根華等23采用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用法測定金櫻子中白樺脂酸，色譜柱Diamonsil C18流動相甲醇-0.2%的甲酸溶液(84:16)。2.2.4 氣質(zhì)聯(lián)用法 氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)技術(shù)在中藥有機酸類成分的測定分析在中藥有機酸類成分的測定中,主要用于長鏈脂肪酸的分析和測定。在酚酸和小分子脂肪酸方面的應(yīng)用較少。 脂肪甲酯化是氣相色譜測定脂肪酸的關(guān)鍵步驟,常用的如重氮甲烷法、三氟化硼催

14、化法、硫酸鹽酸催化法及快速甲酯化法等24-25。金高娃等26用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀并改良脂肪酸甲酯化法檢測出山楂果肉中的7種脂肪酸,分別為棕櫚酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸、花生酸及山崳酸。2.2.5 薄層掃描法薄層掃描法(TLC)系指用一定波長的光照射在薄層板上,對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點進行掃描將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。從最近研究來看,TLC用于中藥中萜酸的研究較多。鄭文媛等27采用薄層掃描法對山楂中的熊果酸進行含量測定，實驗表明其甲酸的加入量為0. 5ml時,熊果酸的斑點無拖尾現(xiàn)象且較集中,斑點無干擾等優(yōu)點。實驗以優(yōu)化的環(huán)己烷

15、-醋酸乙酯-甲酸(20:8:0.5)為展開條件對熊果酸進行測定，結(jié)果重現(xiàn)性好,便于快速、準確測定?？颠B香采用薄層掃描法28,點樣于硅膠G板上,展開劑為苯-乙酸乙酯-乙酸(2:0.8:0.3),上行展開,反射法鋸齒掃描,采用外標兩點法計算琥珀酸含量。半夏藥材中琥珀酸含量以山西產(chǎn)區(qū)最高,為0.0254%;其次為安徽產(chǎn)區(qū),含量為0.0211%;最低為湖南產(chǎn)半夏,含量為0.0038%。3.小結(jié) 有機酸作為中草藥的重要活性成分之一,受到越來越多的國內(nèi)外學者的關(guān)注,前景廣闊。本文僅針對中藥有機酸類成分在實踐中應(yīng)用最廣泛的幾種提起分離及測定方法做一綜述,隨著分析手段的不斷發(fā)展,肯定會不斷涌現(xiàn)出更多方便、快捷

16、、有效的分離提取及測定方法,但每種方法各有其適用范圍。在具體應(yīng)用中,還應(yīng)考慮到藥物中其他成分的干擾等因素,綜合分析,選用一種方法或者多種方法相結(jié)合,以達到最佳效果。參考文獻1王媚,吳皓.中藥有機酸類成分的提取分離及測定方法研究進展J.南京中醫(yī)藥大學學報,2004,20(3):190-192.2陳琦,王尚.鵝不食草總有機酸的提取與分析J.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(18):10-11. 3張毅,秦海軍,馬玲,等.正交試驗優(yōu)選宣木瓜總有機酸的提取工藝J.中南藥學，2014 ,12(7):647-650. 4魯旺旺,杜冰,溫升南,等.酶解輔助乙醇浸提法提取青梅中的有機酸J.食品與機械,2011,

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