rna干擾與腫瘤研究及治療

1、LOGO2021-12-29整理課件1RNARNA干擾及其在腫瘤研究及治療方面的應(yīng)用干擾及其在腫瘤研究及治療方面的應(yīng)用LOGO2021-12-29整理課件2內(nèi)容LOGO2021-12-29整理課件3一、背景介紹 RNA 干擾( RNA interference, RNA i) 是一種由短雙鏈RNA ( double-stranded RNA, dsDNA )所引起的序列特異性基因沉默, 是真核生物體內(nèi)一種阻斷外源基因表達(dá)的自我防御體系, 是dsDNA 介導(dǎo)的,使與其互補(bǔ)的具有同源序列的單鏈RNA 進(jìn)行特異性降解的過程。 RNA干擾(RNA interference ，RNAi)最早是由Mell

2、o和Fire等1998 年在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。 RNAi 作為一種簡單、高效的基因敲除工具，正在基因組學(xué)和疾病基因治療領(lǐng)域掀起一場革命，為腫瘤的基因治療提供了新思路，可能成為今后的腫瘤治療策略之一。LOGO2021-12-29整理課件4二、RNA干擾作用機(jī)制轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄后水平轉(zhuǎn)錄后水平翻譯水平翻譯水平 RNA干擾的作用是在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多個(gè)不同層次上實(shí)現(xiàn)的。三三個(gè)個(gè)水水平平LOGO2021-12-29整理課件5轉(zhuǎn)錄后水平LOGO2021-12-29整理課件6LOGO2021-12-29整理課件7轉(zhuǎn)錄水平 小分子干擾核糖核酸( siRNA)與互補(bǔ)DNA直接結(jié)合而發(fā)揮作用,

3、激發(fā)同源DNA 甲基化的加強(qiáng), 使目的基因轉(zhuǎn)錄受限,表達(dá)關(guān)閉, 進(jìn)而加強(qiáng)基因沉默。如果甲基化出現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)域, 則轉(zhuǎn)錄不能進(jìn)行, 若甲基化出現(xiàn)在編碼區(qū), 則轉(zhuǎn)錄進(jìn)行, 但在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默。LOGO2021-12-29整理課件8翻譯水平 翻譯水平上的RNA i是抑制相應(yīng)mRNA的翻譯, 使相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)受阻, 其中起重要作用的是小時(shí)序RNA ( sm all temporal RNA,stRNA ), 它是由長度約70 nt的RNA形成的莖環(huán)樣前體經(jīng)dicer酶作用后形成長約21 23 nt的dsRNA, 通過R ISC結(jié)合在相應(yīng)mRNA 的3 末 端非翻譯區(qū)上, 進(jìn)而阻斷mRNA的翻譯。L

4、OGO2021-12-29整理課件9三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用（一） RNA干擾在腫瘤研究中的應(yīng)用1.基因功能研究： 由于RNA 干擾能高效特異地阻斷基因表達(dá)，通過基因沉默機(jī)制作用于癌基因、抑癌基因表達(dá)，影響腫瘤生長，在體外培養(yǎng)細(xì)胞中研究靶基因的功能。因而成為研究基因功能很好的工具。例如：腫瘤易感基因篩查和鑒定，Williams 等通過結(jié)合cDNA 芯片技術(shù)和RNAi 技術(shù)鑒定了多個(gè)結(jié)腸癌高度相關(guān)基因。LOGO2021-12-29整理課件10三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2.腫瘤發(fā)生機(jī)制研究: 設(shè)計(jì)多種小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）,

5、可以產(chǎn)生多基因沉默的效果，用于細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的研究。Harvey 等用RNAi 技術(shù)抑制Brk 蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞的增生受到抑制。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Brk的無激酶活性突變體，可以接合器的形式，通過非激酶依賴的機(jī)制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。結(jié)果表明Brk 可作為乳腺癌治療的新目標(biāo)。LOGO2021-12-29整理課件11三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用（二） RNA干擾在腫瘤治療中的應(yīng)用1.不同siRNA 之間的增效作用 由于腫瘤是一種多基因調(diào)控的疾病，采用 RNA干擾技術(shù)對腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行多重抑制會(huì)產(chǎn)生更好的療效。邵榮光針對不同的腫瘤相關(guān)基因，設(shè)計(jì)合成了靶向bcl-2、cdk-2、mdm

6、-2、H-ras、pkc- 的siRNA, 這些siRNA 各自都能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，其抑制率分別為68%、64%、72%、74%和53%。當(dāng)5 種siRNA 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能顯著提高復(fù)合siRNA 對黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用。LOGO2021-12-29整理課件12三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用對靶分子藥物具的增效作用 表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑埃羅替尼（erlotinib）被批準(zhǔn)在臨床上應(yīng)用，但大多數(shù)晚期肺癌患者不應(yīng)答, 早期肺癌患者總是發(fā)展為耐藥性,占一半的復(fù)發(fā)患者T790M-EGFR 基因發(fā)生了突變。研究證明，領(lǐng)用RNA干擾技術(shù)敲除肝細(xì)胞生長因子受體（MET）和表皮生

7、長因子受體（EGFR），能顯著的促進(jìn)埃羅替尼耐藥的H1975 細(xì)胞凋亡。LOGO2021-12-29整理課件13三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用3.siRNA 對DNA 損傷劑的增效作用 5-FU (5-氟尿嘧啶) 或羥基喜樹堿為兩種常用的抗腫瘤藥物，研究證明，Bcl-2/Bcl-xl siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞對5-FU (5-氟尿嘧啶) 或羥基喜樹堿表現(xiàn)出更高的敏感性，提示Bcl-2/Bcl-xl siRNA 介導(dǎo)的基因沉默結(jié)合化療藥物可能是潛在的人肝癌治療策略。LOGO2021-12-29整理課件14三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用4. siRNA 對放療的增敏作用 MDM2 蛋白

8、被證明在輻射應(yīng)答和腫瘤放射敏感性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用, 是一個(gè)有吸引力的臨床藥物靶標(biāo), 利用RNA干擾技術(shù)抑制MDM2 可以加強(qiáng)腫瘤對放射治療的敏感性。LOGO2021-12-29整理課件15三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用 5.抗腫瘤新藥研發(fā) 利用RNAi特異性地抑制癌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性致癌基因的表達(dá),而不影響正常細(xì)胞的基因表達(dá),在研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路以及表型變化可以發(fā)揮極大的作用,從而可以進(jìn)一步為腫瘤的早期診斷和后期治療找尋新的靶點(diǎn)。siRNA從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在的短十幾年時(shí)間內(nèi),很多研究工作者、生物技術(shù)公司和制藥公司己經(jīng)開始廣泛利用siRNA藥物治療腫瘤。 2008年,美國Calando P

9、harmaceuticals公司祀向核糖核苷酸還原酶M2亞基(M2 subunit of ribonucleotide reductase, RRM2)取得了突破性的進(jìn)展,申請的治療實(shí)體腫瘤的siRNA藥物CALAA-01被美國H)A批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)I期,成為最早siRNA藥物治療癌癥的首例臨床試驗(yàn)。 LOGO2021-12-29整理課件16三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用 2009年7月,德國著名制藥公司Silence Therapeutics公司開展了治療實(shí)體腫瘤的靶向蛋白激酶PKN-3基因RNA干擾藥物Atu027的I期臨床試驗(yàn),2011年,該公司報(bào)道了其進(jìn)展,資料顯示,24名患者

10、經(jīng)過Atu027多次治療后,有9名患者病情穩(wěn)定,6名患者的較好療效表現(xiàn)在研究終點(diǎn)(治療3個(gè)月),另外3名患者還在接受治療,目前的結(jié)果還比較令人滿意。 2010年12月,加拿大Tekmira制藥公司宣布開始siRNA藥物TKM-080301(靶向腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的polo樣激酶I (polo-like kinase I, Plkl)的I期臨床試驗(yàn)。目前臨床前研究證明TKM-080301能特異性地殺死腫瘤細(xì)胞,而對正常細(xì)胞無明顯毒副作用,對肝癌以及肝外腫瘤都有很好的抗腫瘤效果。 LOGO2021-12-29整理課件17三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用（三）RNA干擾技術(shù)在腫瘤治療方面的優(yōu)勢 與

11、基因替代、反義核苷酸治療、細(xì)胞因子基因治療方法相比，RNAi 技術(shù)有著無可比擬的優(yōu)勢。1.RNAi 基因抑制效果確切：微量的siRNA 即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上。因此，注入少量的siRNA 足以產(chǎn)生強(qiáng)大的干擾效應(yīng)，減少了傳統(tǒng)基因治療方法大劑量用藥帶來的毒副作用及免疫效應(yīng)。LOGO2021-12-29整理課件18三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2. RNAi 抑制具有嚴(yán)格的序列特異性，將一段與基因同源的siRNA 注入細(xì)胞，它可以特異性地干擾相應(yīng)基因的表達(dá)，其他基因即使與靶基因同屬于一個(gè)基因家族也不會(huì)受到干擾。因此，RNAi 干擾治療的針對性很強(qiáng)，副作用小。3.腫瘤是多

12、基因、多因素疾病，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制腫瘤的生長，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi 可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對這一區(qū)段序列的dsRNA 分子，只注射一種dsRNA 即可以剔除多個(gè)基因，也可以同時(shí)注射多種dsRNA 而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除，而且抑制效果互補(bǔ)干擾。LOGO2021-12-29整理課件19四、問題及展望（一） RNA干擾技術(shù)在腫瘤治療方面要克服的問題理論上只有在siRNA和靶mRNA特異性結(jié)合才會(huì)沉默靶基因表達(dá)。脫靶效應(yīng)在疾病治療上存在潛在的危險(xiǎn)。由拖把效應(yīng)產(chǎn)生的意外的基因調(diào)控成為RNAi技術(shù)治療的一個(gè)主要障礙。一些研宄工作者發(fā)現(xiàn),由于siRNA的特殊結(jié)構(gòu)、序列以及藥物釋放方式,會(huì)引起人體強(qiáng)烈的先天免疫反應(yīng),刺激干擾素和炎癥細(xì)胞因子等化學(xué)物質(zhì)的釋放。由于siRNA本身穩(wěn)定性差,穿透細(xì)胞膜的能力差,無靶向功能,在生理環(huán)境中極不穩(wěn)定,易被血清中的酶迅速降解,被肝臟和腎臟清除,因此如何siRNA體內(nèi)給藥以及開發(fā)siRNA輸送體系是siRNA療法的最大挑戰(zhàn)。免疫刺激系統(tǒng)給藥脫靶效應(yīng)LOGO2021-12-29整理課件20四、問題