X312基因工程的基本操作程序

1、1 12 23 34 4外顯子外顯子內含子內含子5 5結構基因結構基因外顯子外顯子內含子內含子轉錄、加工修飾轉錄、加工修飾成熟成熟mRNA6 67 7從基因文庫中提取目的基因從基因文庫中提取目的基因1 基因文庫(gene library)概念n又稱DNA文庫，是指某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當?shù)妮d體在體外重組后，轉化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。n基因文庫由外源DNA片段、載體和宿主組成。8 8基因文庫的分類按照外源按照外源DNADNA片段的來源：片段的來源：u從特定組織提取的染色體基因組從特定組織提

2、取的染色體基因組DNADNA - -基因組基因組DNADNA文庫文庫（總）（總）umRNAmRNA反轉錄成的反轉錄成的cDNAcDNA拷貝拷貝-cDNAcDNA文庫文庫（部分）（部分）基因文庫的目的 為了在不知目的基因序列的情況為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。下，便于獲得所需的目的基因。9 9基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫1010u基因文庫基因文庫中不是直接保管相中不是直接保管相應基因，而是應基因，而是保存受體菌保存受體菌，菌，菌中含基因中含基因1111利用利用PCRPCR提取目的基因提取目的基因PCRPCR：是一項在生物：是一項在生物體外體外復制特定復制

3、特定DNADNA片段片段的核酸合成技術。的核酸合成技術。原理：原理：DNADNA雙鏈復制雙鏈復制原料：模板原料：模板DNADNA；DNADNA引物；四種脫氧核苷引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定酸；熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；離子酶）；離子1212n模板DNA （已知堿基序列）n 特異性引物（DNA）n耐熱DNA聚合酶（Taq酶）n dNTPs （4種脫氧核苷酸）nMg+(促進dNTP與核酸骨架作用)PCR體系基本組成成分1313PCR的基本反應步驟變性90-95C延伸70-75C退火55-60C第三步：將反應體系升溫第三步：將反應體系升溫至至7075 ，在耐高溫的，在耐高溫

4、的DNA聚合酶催化作用下，聚合酶催化作用下，將與模板互補的單個核苷將與模板互補的單個核苷酸加到引物所提供的酸加到引物所提供的3-OH上，使上，使DNA鏈延伸合成鏈延伸合成，產(chǎn)生一條與模板鏈互補的產(chǎn)生一條與模板鏈互補的DNA鏈。鏈。第一步：將反應體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應所需的離子等）加熱至9095 ，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為互補鏈聚合反應的模板。第二步：將反應體系降溫第二步：將反應體系降溫至至5560 ，使，使兩種引兩種引物分別與模板物分別與模板DNA鏈配對鏈配對結合結合，這個過程稱為復性。，這個過程稱為復性

5、。141453355335變性變性1515533555ABAB退火退火1616533555Taq酶酶延伸延伸11717533555延伸延伸21818()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2019192020模板DNA952121PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50引物1引物2DNA引物2222PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶2323PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第1輪結束第2輪開始2424PCRPCR的基本

6、原理的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點955072TaqTaqTaqTaq2525PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第2輪結束2626PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 27272828292930303131QPCR是針對特定是針對特定DNA片斷片斷的快速體外復制增殖技術的快速體外復制增殖技術Q每循環(huán)

7、一輪，目的基因的每循環(huán)一輪，目的基因的量可增加一倍量可增加一倍Q增殖速率為增殖速率為2n,（n為循環(huán)為循環(huán)次數(shù)）次數(shù)） 每完成一個循環(huán)需每完成一個循環(huán)需2-42-4分鐘，分鐘，2-32-3小時就小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 3232PCRPCR技術擴增過程技術擴增過程a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下， 斷裂，形成斷裂，形成 。 b b、復性（復性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部 。

8、c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端延伸，合成與模板互補端延伸，合成與模板互補 的的 。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈3333 從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取 利用利用PCRPCR技術擴增技術擴增 利用化學方法人工合成利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法3434質粒質粒DNADNA分子分子切口黏性末端切口獲得目的基因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）同一種 限制酶3535構建表達載體構建表達載體組成組成 目的基因目的基因 啟動子啟動

9、子 終止子終止子 標記基因標記基因目的：目的：使目的基因在受使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在；可體細胞中穩(wěn)定存在；可以遺傳給下一代；使目以遺傳給下一代；使目的基因能夠表達和發(fā)揮的基因能夠表達和發(fā)揮作用。作用。復制原點復制原點插入基因插入基因終止子終止子抗生素抗性基因抗生素抗性基因表達載體表達載體啟動子啟動子3636將目的基因導入植物細胞將目的基因導入植物細胞 農桿菌轉化法農桿菌轉化法 基因槍法基因槍法 花粉管通道法花粉管通道法3737將目的基因導入動物細胞將目的基因導入動物細胞 顯微注射法顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）儀注射到受精卵中）383

10、8將目的基因導入微生物細胞將目的基因導入微生物細胞Ca2處理處理受體細胞受體細胞成為感受成為感受態(tài)細胞，態(tài)細胞，再進行混再進行混合。合。3939目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定 檢測檢測: : 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否轉錄是否轉錄 是否翻譯是否翻譯 鑒定鑒定: : 功能活性鑒定功能活性鑒定 抗性鑒定抗性鑒定4040DNA分子雜交技術DNA-RNA分子雜交技術抗原抗體雜交技術檢驗受體細胞染色體的檢驗受體細胞染色體的DNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢驗目的基因是否轉檢驗目的基因是否轉錄出了錄出了mRNA檢驗目的基因是否表檢驗目的基因是否表達出了蛋白質達出了蛋白質

11、個體生物學檢驗個體生物學檢驗個體生物學性狀觀察4141DNA附著在膜上附著在膜上硝化纖維素硝化纖維素加探針加探針報告基因（含熒光素分子）報告基因（含熒光素分子）變性變性DNA雜交雜交（如檢測（如檢測SARS病毒等）病毒等）abcd4242檢測是否插入檢測是否插入目的基因目的基因，利用，利用DNADNA分子雜交技術分子雜交技術，目的基因，目的基因DNADNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的DNADNA雜交，看是否有雜交，看是否有雜交帶。雜交帶。檢測是否轉錄出了檢測是否轉錄出了mRNAmRNA，利用，利用DNADNA分子雜交技術，分子雜交技術，目的基因目的基因D

12、NADNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的mRNAmRNA雜交，看是否有雜交，看是否有雜交帶。雜交帶。檢測目的基因是否翻譯成檢測目的基因是否翻譯成蛋白質蛋白質。抗體與蛋白質進行。抗體與蛋白質進行抗原抗原抗體抗體雜交，看是否有雜交帶。雜交，看是否有雜交帶。還可以進行還可以進行個體水平個體水平的鑒定，根據(jù)其的鑒定，根據(jù)其性狀性狀。提示：提示：DNADNA分子雜交技術分子雜交技術首先提取受體細胞中的首先提取受體細胞中的DNADNA，然后高溫解成，然后高溫解成單鏈，再與同位素標記的單鏈，再與同位素標記的DNADNA探針雜交；探針雜交；抗原抗體雜交抗原抗體雜交所用到的

13、抗體是用表達出的蛋白質注射動物所用到的抗體是用表達出的蛋白質注射動物進行免疫，產(chǎn)生相應的抗體，并提取出而來的。進行免疫，產(chǎn)生相應的抗體，并提取出而來的。4343大量的受體細胞接受不多的目的基因。處理的受大量的受體細胞接受不多的目的基因。處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。檢測出來。 將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、

14、研究。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物4444 基因工程的基本操作程序1.獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRu化學方法人工合成化學方法人工合成2.構建基因表達載體構建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標記基因目的基因、啟動子、終止子、標記基因3.將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞u農桿菌轉化法、顯微注射法農桿菌轉化法、顯微注射法4.目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉錄、翻譯檢測：是否插入、轉錄、翻譯45451.下表關于基因工程中有關基因操作的名詞及對應的內容，正確的組合是2、下

15、列屬于獲取目的基因的方法的是利用mRNA反轉錄形成 從基因組文庫中提取從受體細胞中提取 利用PCR技術 利用DNA轉錄 人工合成A. B. C. D.46463.細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對目的基因是否導入進行檢測C增加質粒分子的分子量D便于與外源基因連接4. 有關基因工程的敘述正確的是A限制酶只在獲得目的基因時才用B重組質粒的形成是在細胞內完成的C質粒都可作為運載體 D蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料47474848例、采用基因工程技術將人凝血因子基因導入山羊受精卵，培育出了轉基因羊。但是，人凝血

16、因子只存在于該轉基因羊的乳汁中。以下有關敘述，正確的是A.人體細胞中凝血因子基因編碼區(qū)的堿基對數(shù)目，等 于凝血因子氨基酸數(shù)目的3倍B.可用顯微注射技術將含有人凝血因子基因的重組 DNA分子導入羊的受精卵C.在該轉基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺細 胞，而不存在于其他細胞中D.人凝血因子基因開始轉錄后，DNA連接酶以DNA分 子的一條鏈為模板合成mRNA4949 嘗試設計嘗試設計 50501.答：答：不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基

17、因等。必須構建上述元件的主要理由是：因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2） 通過通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；序列導入受體生物中無法轉錄；（3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，

18、如增強子等；他調控元件，如增強子等；（5） 有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。（P15）51512.解析：解析：農桿菌可分為根瘤農桿菌和發(fā)根農桿菌，在植物基因農桿菌可分為根瘤農桿菌和發(fā)根農桿菌，在植物基因工程中以根瘤農桿菌的工程中以根瘤農桿菌的Ti質粒介導的遺傳轉化最多。根瘤農桿質粒介導的遺傳轉化最多。根瘤農桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。據(jù)不

19、完全統(tǒng)計，約有菌廣泛存在于雙子葉植物中。據(jù)不完全統(tǒng)計，約有93屬屬643種種雙子葉植物對根瘤農桿菌敏感。裸子植物對該菌也敏感。當這雙子葉植物對根瘤農桿菌敏感。裸子植物對該菌也敏感。當這些植物被該菌侵染后會誘發(fā)腫瘤。近年來，也有報道該菌對單些植物被該菌侵染后會誘發(fā)腫瘤。近年來，也有報道該菌對單子葉植物也有侵染能力。子葉植物也有侵染能力。 根瘤農桿菌侵染植物是一個非常復雜的過程。根瘤農桿菌根瘤農桿菌侵染植物是一個非常復雜的過程。根瘤農桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產(chǎn)生一些糖類和酚類物質吸具有趨化性，即植物的受傷組織會產(chǎn)生一些糖類和酚類物質吸引根瘤農桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導物為

20、引根瘤農桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質主要在雙子葉植物細乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農桿菌侵染的原因。近年來還發(fā)現(xiàn)一些中性糖，如不易被根瘤農桿菌侵染的原因。近年來還發(fā)現(xiàn)一些中性糖，如L-阿拉伯糖、阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導作用。酚類物質和糖類物質既木糖等也有誘導作用。酚類物質和糖類物質既可以作為根瘤農桿菌的趨化物，又可以作為農桿菌中可以作為根瘤農桿菌的趨化物，又可以作為農桿菌中Ti質粒上質粒上Vir

21、區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導物，使區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導物，使Vir區(qū)基因活化，導致區(qū)基因活化，導致T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞。的加工和轉移，從而侵染植物細胞。5252 需要注意的是農桿菌中不同的菌株，侵染能力需要注意的是農桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加上桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加上述酚類物質的，同時單子葉植物種類不同，農桿菌述酚類物質的，同時單子葉植物種類不同，農桿菌侵染進行遺傳轉化的效果也有很大差異。侵染進行遺傳轉化的效果也有很大差異。 如果

22、想將一個抗病毒基因轉入小麥，也可以用如果想將一個抗病毒基因轉入小麥，也可以用農桿菌，但要注意兩點：要選擇合適的農桿菌菌農桿菌，但要注意兩點：要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香植物；要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的（趨化性）和激活農桿菌的Vir區(qū)（誘導）的基因，區(qū)（誘導）的基因，使使T-DNA轉移并插入到染色體轉移并插入到染色體DNA上。上。53533.解析：解析：有

23、些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，些糖鏈是在內質網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，內質網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸內質網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。54544.解析：解析：基本操作如下：基本操作如下：（1）從小鼠中克隆出）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。）。（2）將）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動前接上在大腸桿菌中可以

24、適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構建成一個表達載子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構建成一個表達載體。體。（3）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明菌落，則表明-珠蛋白基因已進入其中。珠蛋白基因已進入其中。（4）培養(yǎng)進入了）培養(yǎng)進入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集珠蛋白基因的大腸

25、桿菌，收集菌體，破碎后從中提取菌體，破碎后從中提取-珠蛋白。珠蛋白。5555基因文庫的分類按照外源按照外源DNADNA片段的來源：片段的來源：u從特定組織提取的染色體基因組從特定組織提取的染色體基因組DNADNA - -基因組基因組DNADNA文庫文庫（總）（總）umRNAmRNA反轉錄成的反轉錄成的cDNAcDNA拷貝拷貝-cDNAcDNA文庫文庫（部分）（部分）基因文庫的目的 為了在不知目的基因序列的情況為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。下，便于獲得所需的目的基因。5656基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫5757533555延伸延伸25858PCRPCR技

26、術擴增過程技術擴增過程a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下， 斷裂，形成斷裂，形成 。 b b、復性（復性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部 。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端延伸，合成與模板互補端延伸，合成與模板互補 的的 。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈5959目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定 檢測檢測: : 是否插入目的基因是否插入

27、目的基因 是否轉錄是否轉錄 是否翻譯是否翻譯 鑒定鑒定: : 功能活性鑒定功能活性鑒定 抗性鑒定抗性鑒定6060DNA附著在膜上附著在膜上硝化纖維素硝化纖維素加探針加探針報告基因（含熒光素分子）報告基因（含熒光素分子）變性變性DNA雜交雜交（如檢測（如檢測SARS病毒等）病毒等）abcd6161檢測是否插入檢測是否插入目的基因目的基因，利用，利用DNADNA分子雜交技術分子雜交技術，目的基因，目的基因DNADNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的DNADNA雜交，看是否有雜交，看是否有雜交帶。雜交帶。檢測是否轉錄出了檢測是否轉錄出了mRNAmRNA，利用，利用DNADNA分子雜交技術，分子雜交技術，目的基因目的基因DNADNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的mRNAmRNA雜交