標記物的制備與鑒定

1、標記物制備與鑒定125125I I- -125125I I或或125125I I+ +125125I-I-標記物標記物（混合物）（混合物）Ch-TCh-T、LPOLPO氧化氧化取代反應取代反應直接標記法化學或酶促反應，將化學或酶促反應，將放射性負電碘離子氧放射性負電碘離子氧化成碘原子或正電碘化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應離子，通過取代反應置換被標記物分子中置換被標記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原及組胺殘基上的氫原子。子。 n 使用無還原劑的高使用無還原劑的高比放射性碘源比放射性碘源n 被標記物用量要少被標記物用量要少n ch-Tch-T用量要低用量要低n

2、控制總反應體積控制總反應體積200l200ln 反應時間反應時間1-21-2分鐘分鐘n 弱堿性反應條件弱堿性反應條件 bolton-Hunter間接標記法 聯接標記聯接標記( ( bolton-Hunter ) )預先將預先將125125I I 用用ch-T法標記琥珀酰法標記琥珀酰 胺酯，制成的胺酯，制成的125125I I 化化 脂功能基團可與蛋白脂功能基團可與蛋白 分子上的氨基酸殘基分子上的氨基酸殘基 反應，從而使待標記反應，從而使待標記 物被碘化。物被碘化。 聚合、聚合、損傷物損傷物 標記蛋白標記蛋白游離游離125125I I125碘-標記物的制備純化 凝膠過濾法 離子交換層析法 聚丙烯

3、酰胺 凝膠電泳 高效液相色譜法125碘-標記物的制備鑒定放射化學純度l 單位標記物中結合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率l 應大于95%免疫活性l 標記物與抗體結合的能力l 標記物與過量抗體反應百分比l 該值越大, 標記物免疫活性好 結果準，結果準，測定復雜測定復雜比放射活性l單位化學量標記物中含單位化學量標記物中含的放射性強度的放射性強度l單位：單位：Ci/g Ci/g mCi/mgCi/mmol mCi/mgCi/mmol l比放射性過高，將影響比放射性過高，將影響標記物免疫活性標記物免疫活性 計算法：依據標記反應中放射性核素的利用率（標記率）來計算標記物的比放射性. 自身置換法 ：

4、比較標記抗原與標準抗原的免疫活性來測定標記物的比放射性 結果結果欠欠準，準，計算計算簡便簡便比放射性計算法 自身置換曲線自身置換曲線 l反應系統：限量Ab和遞增劑量(cpm)的標記抗原l標記抗原的結合率(B/T%)隨標記抗原總量的增加而減少 l兩條曲線平行,若標記抗原與標準品抗原具有相同的免疫活性標準曲線 l反應系統:抗體（限量）、標記抗原（定量）和劑量遞增的標準抗原組成 l標記抗原與抗體的結合率(B/T%)隨標準抗原的增加而競爭抑制性減少 比放射性=自身置換法比放射性自身置換法標準曲線與自身置換曲線平行 表明在相同的放射性結合水平上，二實驗中抗體上結合的抗原物質總量相同 計算置換曲線平行段某結合率的放射性強度(cpm/ml換算為nCi/ml) 計算標準曲線平行段相應結