ProteinA、ProteinG與抗體的結(jié)合說課講解

1、Pr ot ei n A、Pr ot ei n G與抗體的結(jié)合Protein A 、Protein G 與抗體的結(jié)合1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose親和層析介質(zhì)與抗體的結(jié)合目前,約70-80%的抗體純化使用 Protein A、Protein G 親和層析.蛋白 A (Protein A)來源于金黃色葡萄 球菌的一個株系,它含有 5個可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合的Z構(gòu)域.蛋白 A作為親和配基被 偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上,可以特異性的和樣品中的抗體分子結(jié)合,而使其他雜蛋白流穿,具有極高的選擇性,一步親和層析就可到達(dá)超過95%的純度.1個蛋

2、白A分子至少可以結(jié)合 2個IgG.蛋白A也可以結(jié)合另一些免疫球蛋白,如用于某些種屬的 IgA、IgM的純化.天然(Native Protein A)和重組的蛋白 A (rProtein A)對于IgG的Fc段有著相似的特異結(jié)合.重組的蛋白A經(jīng)改造后含有一個 C末端半胱氨酸,可以單一位點偶聯(lián)于瓊脂糖上,降低了空間位阻,增加了與IgG的結(jié)合水平.蛋白 A與IgG的結(jié)合強(qiáng)度很大成度上依賴于該抗體的種屬和亞型,而其動態(tài)結(jié)合水平那么決 定于結(jié)合強(qiáng)度(解離常數(shù))及傳質(zhì)阻力等多種因素(例如上樣時樣品在柱內(nèi)的停留時間).2 Protein G Sepharose親和層析介質(zhì)與抗體的結(jié)合蛋白G是一種源自鏈球菌

3、G族的細(xì)胞外表蛋白,為三型 Fc受體.其通過類似于蛋白A的非免疫機(jī)制與抗體的Fc段結(jié)合.像蛋白 A 一樣,蛋白G可以與IgG的Fc區(qū)域特異性結(jié)合,不同的是, Protein G Sepharose可以廣泛、更強(qiáng)地結(jié)合更多類型的IgG,多克隆IgG及人IgG ,同時血清蛋白結(jié)合水平更低,純度更高,配基脫落也相對更低.此外,蛋白 G還可以和某些抗體的 Fab和F (ab ')殿結(jié)合.Protein G 是從G類Streptococci細(xì)菌中別離出來的胞壁蛋白,與多數(shù)哺乳動物的IgG Fc段結(jié)合(包括：人、山羊、綿羊、兔、豚鼠、馬、豬、猴、小鼠等 ),分子量：25kDa.Protein G

4、可用于純化不能與Protein A 很好結(jié)合的哺乳動物單抗和多抗IgG的純化.相對 于Protein A , Protein G 對于大多數(shù)哺乳動物的IgG有著更高的親和力,尤其是對于IgG 的亞基,如人IgG3 ,小鼠IgG1和鼠IgG2a.與Protein A 不同,Protein G 不與狗IgG結(jié) 合、不結(jié)合人IgM, IgD,或IgA.重組蛋白G(Recomb Protein G)已經(jīng)除去了與白蛋白及細(xì)胞外表結(jié)合位點,減少了交叉反響 和非特異性結(jié)合.因此,它比天然蛋白 G和蛋白A有更大的親和力.可以代替二抗,廣泛 應(yīng)用于免疫化學(xué)等領(lǐng)域.在親和力、穩(wěn)定性等方面好.本產(chǎn)品將我公司自主設(shè)計

5、和生產(chǎn)的新型重組蛋白G偶聯(lián)到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠6B上,成為用于抗體別離純化的親和層析介質(zhì)本產(chǎn)品穩(wěn)定性好,基團(tuán)脫落少,使用壽命長,使用方便,可從腹水或培養(yǎng)液中直接別離純化 抗體.由于采用了環(huán)氧活化的方法,與澳化鼠活化方法相比,可獲得長短更適合的結(jié)合臂,使抗體 純化獲得更好的效果.并且這種方法活化的瓊脂糖凝膠沒有離子交換的作用,因而其死吸附親和介質(zhì)特性：特點基團(tuán)脫落少,結(jié)合特異性強(qiáng)基質(zhì)6%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠配基重組蛋白G配基密度*6mg重組蛋白 G/ml吸附載量3-7mg 鼠 IgG2a/ml親和介質(zhì)的顆粒大小50- 160最大流速200cm/hpH范圍3-10 ,在位清洗時pH范圍可到2-11使

6、用溫度常溫保存溫度+48C保存液體20%乙醇三、適用范圍Protein A和Protein G的相對結(jié)合強(qiáng)度物種物種亞類亞類protein A 結(jié)合protein G 結(jié)合人lgARJ受-lgD-lgD-lgG1+lgG2+lgG3-+lgG4+lgMRJ受-雞蛋黃lgY-牛+狗+山羊-+豚鼠lgG1+lgG2+倉鼠+馬+考拉-+駱駝-+猴恒河+小鼠lgG1+lgG2a+lgG2b+lgG3+lgMRJ受-豬+兔+大鼠lgG1-+lgG2a-+lgG2b-+lgG3-+綿羊+/-+ =強(qiáng)結(jié)合,+ =中等結(jié)合,-=弱或不結(jié)四、緩沖液配制建議采用磷酸緩沖液,洗脫后不影響下游的標(biāo)記.A 緩沖液 1m

7、ol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14) 358.14g1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 87.7g溶于1升水,濾膜過濾B 緩沖液 1mol/L NaH2P04 (MW156.01) 156.01g1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 87.7g溶于1升水,濾膜過濾C吸附和洗滌緩沖液根據(jù)所需PH值,按下表3配制.根據(jù)所列比例量取后混合,然后 再加9倍體積的水,稀 釋成應(yīng)用溶液.如果洗脫下的抗體有些雜帶,可加吐溫-20至終濃度0.05%D中和緩沖液:A液77.4ml、B液22.6ml;兩液混合成PH7.4的中和緩沖液E 洗脫液 0.1m

8、ol/L NaH2P04 (MW156.01) 15.601g150 mM NaCl l(MW6 8.08g/mol) 8.77g溶于1升水,濾膜過濾,HCl調(diào)整PH至3.0五、應(yīng)用舉例A實驗名稱：從小鼠腹水中別離純化IgG2a1、重組蛋白G瓊脂糖凝膠裝柱,柱床體積為1ml,流盡20%乙醇溶液；2、以緩沖液C平衡5-10個床體積,流速為1ml/min；(緩沖液C配制方法：取A液35.2ml、B 液 64.8ml,再加 900ml 水,混合后 PH6.5).3、將0.2ml小鼠腹水用緩沖液C稀釋到2ml, 0.45仙m§膜過濾,上樣.流速為1ml/min；4、用緩沖液C再洗5-10個床

9、體積,流速為1ml/min；5、用洗脫液E,洗脫3體積.6、在洗脫液參加0.2體積中和緩沖液,以PH試紙確認(rèn)溶液為中性.溶液太酸,會損傷抗體 活性(中和緩沖液配制方法：A液77.4ml、B液22.6ml;兩液混合成PH7.4的中和緩沖液 7、將別離純化的IgG2a與對照品同時進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析.8、用純水流洗10個柱床體積,再用20%的乙醇流洗10個柱床體積,流速為2ml/min, 柱子置于+48 c環(huán)境中保存表三,25c下0.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制PHA液1mol/L Na zHPQml)B液1mol/L NaHzPG(ml)5.87.992.16.012.088.06.2

10、17.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8根據(jù)比例量取混合,然后在加 9倍體積的水,稀釋成應(yīng)用溶液.B 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):(1)蛋白樣品的準(zhǔn)備：1)對于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞,吸除細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS洗滌一次,然后參加500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞.3)對于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解.4)對于懸浮細(xì)胞,離心收集細(xì)胞后,PBS洗滌一次,然后參考貼壁細(xì)胞的裂解

11、方法進(jìn)行裂解.注：詳細(xì)的裂解方法參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法.對于不同的培養(yǎng)器材,參考 10厘米 培養(yǎng)皿的裂解液的用量進(jìn)行裂解.如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高,可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋,如果蛋白樣品濃度過低,在以后的裂解過程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量.(2) .去除非特異性結(jié)合(可選做)：1) .取200微升至1毫升蛋白樣品,蛋白量約為200微克至1毫克,參加約1微克和免疫沉 淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的Protein A+G Agarose, 4c緩慢搖 動30分鐘至2小時.2) . 2500rpm(約1000g)離心5分鐘,取上清用于后續(xù)的免疫沉淀.注：所謂種

12、屬相同的IgG是指,例如后續(xù)免疫沉淀時用的是小鼠IgG,那么在本步驟中可以加 入normal mouse IgG,如無normal IgG可以參加其它不影響后續(xù)檢測的其它 mouse IgG類型 的抗體.通過和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育,可以充分降低非特異性的結(jié)合, 降低背景.(3) .免疫沉淀：1) .參加0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4c緩慢搖動過夜.2) .再參加20微升充分重懸的Protein A+G Agarose, 4c緩慢搖動1-3個小時.(為方便后續(xù) 的洗滌操作可以把參加充分重懸的 Protein A+G Agarose的量調(diào)整為40微升.)3) . 2500rpm(約1000g)離心5分鐘,或瞬時高速離心,小心吸除上清,注意寧可留下少量上 清也不能吸掉Protein A+GAgarose.4) .用準(zhǔn)備蛋白樣品時的