實驗三細(xì)菌鑒定中的幾種生化試驗

1、實驗三實驗三 細(xì)菌鑒定中常用的幾種生化試驗細(xì)菌鑒定中常用的幾種生化試驗 用生化的方法來檢測細(xì)菌用生化的方法來檢測細(xì)菌對各種基質(zhì)對各種基質(zhì)的代謝作用及代謝產(chǎn)物的代謝作用及代謝產(chǎn)物，借以鑒別細(xì)菌，借以鑒別細(xì)菌種類，這種生化試驗稱為細(xì)菌的生化反種類，這種生化試驗稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗；是應(yīng)試驗；是鑒別細(xì)菌鑒別細(xì)菌的重要依據(jù)的重要依據(jù) 。 碳水化合物碳水化合物代謝試驗代謝試驗碳源和氮源碳源和氮源利用試驗利用試驗蛋白質(zhì)和氨基蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗酸代謝試驗各種酶類試驗各種酶類試驗糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗甲基紅試驗（甲基紅試驗（MRMR）V-PV-P試驗試驗檸檬酸鹽檸檬酸鹽利用試驗利用試驗吲哚試驗吲哚試驗硫化

2、氫試驗硫化氫試驗硝酸還原酶試驗硝酸還原酶試驗，淀粉水解試驗淀粉水解試驗一、糖發(fā)酵試驗一、糖發(fā)酵試驗2 2、V-P試驗試驗1 1、吲哚試驗、吲哚試驗三、淀粉水解試驗三、淀粉水解試驗二、二、IMViC試驗試驗3 3、MR試驗試驗現(xiàn)代快速生化檢測現(xiàn)代快速生化檢測簡化試劑配制簡化試劑配制 簡化操作過程簡化操作過程 底物，指示劑、抑制劑的改良底物，指示劑、抑制劑的改良 操作、檢測的高度自動化操作、檢測的高度自動化4 4、自動化微生物鑒定系統(tǒng)、自動化微生物鑒定系統(tǒng) 現(xiàn)代快速生化檢測現(xiàn)代快速生化檢測1 1、顯色培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基3 3、快速檢測試紙、快速檢測試紙2 2、生化鑒定管、生化鑒定管環(huán)凱環(huán)凱沙門氏菌

3、顯色沙門氏菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)基生化鑒定管生化鑒定管檸檬酸鹽生化鑒定管檸檬酸鹽生化鑒定管木糖生化鑒定管木糖生化鑒定管大盒生化鑒定管大盒生化鑒定管快速檢測試紙快速檢測試紙 使用使用生化鑒定試劑盒生化鑒定試劑盒對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌進(jìn)行細(xì)菌鑒定。性菌進(jìn)行細(xì)菌鑒定。全自動微生物鑒定系統(tǒng)全自動微生物鑒定系統(tǒng)VITEKVITEK全自動全自動化微生物鑒定化微生物鑒定系統(tǒng)系統(tǒng)l1 1、掌握細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒、掌握細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)的測定方法；定中常用的生理生化反應(yīng)的測定方法；l2. 2. 通過不同細(xì)菌對不同含碳、

4、含氮化合物的通過不同細(xì)菌對不同含碳、含氮化合物的分解利用情況，了解細(xì)菌代謝類型的多樣性；分解利用情況，了解細(xì)菌代謝類型的多樣性；l3 3、了解細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的不同生長現(xiàn)象、了解細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的不同生長現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義。及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義。 根據(jù)細(xì)菌根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異分解利用糖能力的差異表現(xiàn)表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。各種糖各種糖細(xì)菌細(xì)菌有機酸有機酸（乳酸、醋酸、丙酸等）（乳酸、醋酸、丙酸等）氣體氣體 （氫氣，二氧化碳等）（氫氣，二氧化碳等）產(chǎn)酸：產(chǎn)酸： 指示劑指示劑 （溴甲酚紫），（溴甲酚紫），由紫色由

5、紫色（pH6.8以上以上)變?yōu)辄S色變?yōu)辄S色（pH5.4以下以下)產(chǎn)氣產(chǎn)氣 倒置的德漢氏小管倒置的德漢氏小管l 是一組試驗；是一組試驗；IMViCIMViC是靛基質(zhì)試驗或稱是靛基質(zhì)試驗或稱吲哚試驗吲哚試驗（I I）、）、甲基紅試驗甲基紅試驗（M M）、）、V-PV-P試驗試驗（V V）和）和檸檬檸檬酸鹽利用試驗酸鹽利用試驗（C C）的縮寫，）的縮寫，i i是為了發(fā)是為了發(fā)音的需要加上的；音的需要加上的；l常用于革蘭氏陰性的腸道細(xì)菌檢測中，常用于革蘭氏陰性的腸道細(xì)菌檢測中，可用于區(qū)分產(chǎn)氣桿菌屬和大腸桿菌屬?？捎糜趨^(qū)分產(chǎn)氣桿菌屬和大腸桿菌屬。 色氨酸色氨酸幾乎存在所有蛋白質(zhì)中，某些幾乎存在所有蛋白質(zhì)

6、中，某些細(xì)菌如大腸桿菌等具有細(xì)菌如大腸桿菌等具有色氨酸酶色氨酸酶。蛋白胨中的蛋白胨中的色氨酸色氨酸色氨酸酶色氨酸酶靛基質(zhì)靛基質(zhì)（無色無色吲哚）吲哚） 吲哚試劑吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛對二甲基氨基苯甲醛） 玫瑰吲哚玫瑰吲哚（陽性反應(yīng)）（陽性反應(yīng)） 葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸縮合縮合乙酰乳酸乙酰乳酸脫羧脫羧乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇堿性條件堿性條件二乙酰二乙酰與培養(yǎng)基中精氨酸與培養(yǎng)基中精氨酸的胍基結(jié)合的胍基結(jié)合紅色紅色化合物（陽性反應(yīng)）化合物（陽性反應(yīng)）葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH值降至值降至4.5以下以下培養(yǎng)基培養(yǎng)基變紅變紅( (陽性反應(yīng)陽性反應(yīng)) )甲基紅指示劑甲基紅指示劑

7、非酸性末端產(chǎn)物非酸性末端產(chǎn)物(醇、醛等）醇、醛等）pH值值6 6.2甲基紅指示劑甲基紅指示劑培養(yǎng)基培養(yǎng)基橘黃色橘黃色( (陰性反應(yīng)陰性反應(yīng)) )檢測細(xì)菌是否可以產(chǎn)生分泌到胞外的檢測細(xì)菌是否可以產(chǎn)生分泌到胞外的淀粉酶淀粉酶。 淀粉酶淀粉酶糊精，雙糖和單糖等糊精，雙糖和單糖等碘液碘液不出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，不出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，菌落周圍呈現(xiàn)透菌落周圍呈現(xiàn)透明圈明圈藍(lán)色藍(lán)色 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基， 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，蛋白胨水培養(yǎng)葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，蛋白胨水培養(yǎng) 基，固體淀粉培養(yǎng)基?；?，固體淀粉培養(yǎng)基。菌種菌種：大腸桿菌，枯草桿菌，普通變形菌，產(chǎn)氣

8、：大腸桿菌，枯草桿菌，普通變形菌，產(chǎn)氣 腸桿菌腸桿菌試劑試劑：盧戈氏碘液，甲基紅指示劑，：盧戈氏碘液，甲基紅指示劑，40%KOH40%KOH， 5%-5%-萘酚，吲哚試劑，萘酚，吲哚試劑，1.6%1.6%溴甲酚紫溴甲酚紫儀器：儀器：略略1 1、 試管（平板）標(biāo)記試管（平板）標(biāo)記 葡萄糖發(fā)酵管葡萄糖發(fā)酵管乳糖發(fā)酵管乳糖發(fā)酵管吲哚試驗管吲哚試驗管V-P試驗管試驗管淀粉水解試驗平板：淀粉水解試驗平板：4個個各各 9支支用記號筆或者標(biāo)簽紙用記號筆或者標(biāo)簽紙在平板底部劃成或者在平板底部劃成或者區(qū)分為區(qū)分為 2 2 部分部分 2 2、接種培養(yǎng)、接種培養(yǎng) 試管接種試管接種：以：以無菌操作無菌操作分別接種少量

9、待測菌到以上分別接種少量待測菌到以上相應(yīng)試管中，每菌接相應(yīng)試管中，每菌接2 2支管支管, ,留留1 1管作空白對照不接種，管作空白對照不接種，置置3737恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)242448h48h。 葡萄糖和乳糖微量發(fā)酵管接種葡萄糖和乳糖微量發(fā)酵管接種: :采用接種針采用接種針平板接種：平板接種：以無菌操作分別接種少量待測菌到以上以無菌操作分別接種少量待測菌到以上相應(yīng)平板中相應(yīng)平板中,每平板接每平板接2種菌種菌,將平板倒置在將平板倒置在 3737溫箱溫箱中培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h.24h. 確定有無細(xì)菌生長確定有無細(xì)菌生長？確定各菌對糖的分解利用情況：確定各菌對糖的分解利用情況：不利用：用不利用：

10、用 “” 表示表示產(chǎn)酸：產(chǎn)酸： 用用 “+” 表示表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣：產(chǎn)酸產(chǎn)氣：用用 表示表示3 3、 觀察記錄（觀察記錄（直接觀察記錄或加入試劑反應(yīng)后直接觀察記錄或加入試劑反應(yīng)后再觀察記錄再觀察記錄） 直接觀察記錄直接觀察記錄 1、確定有無細(xì)菌生長？確定有無細(xì)菌生長？2、向蛋白胨水培養(yǎng)液內(nèi)加入向蛋白胨水培養(yǎng)液內(nèi)加入乙醚乙醚1-2mL，用力振，用力振蕩，靜置分層后，蕩，靜置分層后，沿管壁緩緩加入沿管壁緩緩加入5-10滴滴吲哚試劑，吲哚試劑，若上層乙醚層呈若上層乙醚層呈玫瑰紅玫瑰紅色者，為吲哚試驗反應(yīng)陽色者，為吲哚試驗反應(yīng)陽性。性。3 3、 “ “+”+”表示陽性反應(yīng)，表示陽性反應(yīng)， “ “-”-”表

11、示陰性反應(yīng)。表示陰性反應(yīng)。1 1、確定有無細(xì)菌生長？并用空試管將、確定有無細(xì)菌生長？并用空試管將葡萄糖蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液分為培養(yǎng)液分為2半；半；2 2、將其中、將其中1 1半葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液內(nèi)加入半葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液內(nèi)加入5-10滴滴 40%KOH，然后加入，然后加入等量的等量的 5%-萘酚溶液萘酚溶液，用力振，用力振蕩，再放入蕩，再放入 3737溫箱中保溫溫箱中保溫 15-30min15-30min。若培養(yǎng)物呈。若培養(yǎng)物呈紅色紅色者，為者，為VP VP 試驗反應(yīng)陽性試驗反應(yīng)陽性3 3、 “ “+”+”表示陽性反應(yīng)，表示陽性反應(yīng)， “ “-”-”表示陰性反應(yīng)。表示陰性反應(yīng)。 1

12、 1、將另一半葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液內(nèi)加入、將另一半葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液內(nèi)加入甲甲基紅試劑基紅試劑 2 2 滴滴，培養(yǎng)基變?yōu)?，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色紅色者為陽性，變黃者為陽性，變黃色者為陰性。色者為陰性。 2 2、 “ “+”+”表示陽性反應(yīng)，表示陽性反應(yīng)， “ “-”-”表示陰性反應(yīng)。表示陰性反應(yīng)。1 1、觀察各種細(xì)菌的生長情況；、觀察各種細(xì)菌的生長情況；2 2、將平板打開蓋子，、將平板打開蓋子，滴入少量碘液于平皿中滴入少量碘液于平皿中，輕輕，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉己被水解，為陽性。透明圈現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉己被水解，為陽性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱，的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱， 即產(chǎn)即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。生胞外淀粉酶活力的高低。3 3、 “ “+ +”表示產(chǎn)生淀粉酶，水解淀粉，無藍(lán)色反應(yīng)；表示產(chǎn)生淀粉酶，水解淀粉，無藍(lán)色反應(yīng)；“- -”表示陰性結(jié)果，即培養(yǎng)基變藍(lán)色。表示陰性結(jié)果，即培養(yǎng)基變藍(lán)色。 細(xì)菌生化實驗誤差細(xì)菌生化實驗誤差原因？原因？ 注意事項注意事項 1 1）純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物方可進(jìn)行生化試驗方可進(jìn)行生化試驗2 2）嚴(yán)格無菌操作嚴(yán)格無菌操作，防止污染情況的