腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南

1、腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）、八 、-刖言腫瘤的個體化治療基因檢測已在臨床廣泛應(yīng)用，實現(xiàn)腫瘤個體化用藥基因檢 測標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，是一項意義重大的緊迫任務(wù)。本指南從診斷項目的科學(xué)性、 醫(yī)學(xué)實驗室檢測方法的準(zhǔn)入、樣本采集至檢測報告發(fā)出的檢測流程、實驗室質(zhì)量 保證體系四個方面展開了相關(guān)論述，使臨床醫(yī)生能夠了解所開展檢測項目的臨床 目的、理解檢測結(jié)果的臨床意義及對治療的作用； 醫(yī)學(xué)實驗室為患者或臨床醫(yī)護(hù) 人員提供及時、準(zhǔn)確的檢驗報告，并為其提供與報告相關(guān)的咨詢服務(wù)。 檢測技術(shù) 的標(biāo)準(zhǔn)化和實驗室準(zhǔn)入及質(zhì)量保證對臨床和醫(yī)學(xué)實驗室提出了具體的要求，以最大程度的保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本指南是參考現(xiàn)行相關(guān)

2、的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法 規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及腫瘤個體化治療靶點(diǎn)基因的不斷發(fā)現(xiàn)， 本技術(shù)規(guī)范相 關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時調(diào)整。本指南起草單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實驗室、蘇州生物醫(yī)藥創(chuàng)新中心，經(jīng)國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會、中國抗癌協(xié)會相關(guān)專業(yè)委員會、中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會的 專家修訂。本指南起草人：詹啟敏、曾益新、王玨、姬云、錢海利、李曉燕、孫石磊目錄1. 本指南使用范圍 12. 簡介 13. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語和基因突變命名 13.1 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語 13.2 基因突變命名 23.3 參考序列 33.4 各類變異 34. 分析前質(zhì)量

3、保證 64.1 樣本類型及獲取 64.2 采樣質(zhì)量的評價 84.3 樣本采集中的防污染 84.4 樣本運(yùn)送和保存 85. 分析中質(zhì)量保證 95.1 實驗室設(shè)計要求 95.2 檢測方法 95.3 DNA 提取方法與質(zhì)量控制 185.4 RNA 提取方法與質(zhì)量控制 195.5 試劑的選擇、儲存及使用注意事項 195.6 核酸擴(kuò)增質(zhì)量控制 205.7 設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn) 205.8 人員培訓(xùn) 215.9 方法的性能驗證 216. 分析后質(zhì)量保證 236.1 檢測結(jié)果的記錄 236.2 失控結(jié)果的記錄與分析 236.3 報告及解釋 236.4 記錄保留 246.5 檢測后基因咨詢 246.6 樣本（及核酸

4、）保留與處理 256.7 檢測與臨床數(shù)據(jù)收集與分析 257. 腫瘤個體化醫(yī)學(xué)檢測的質(zhì)量保證 257.1 標(biāo)準(zhǔn)操作程序 257.2 質(zhì)控品 267.3 室內(nèi)質(zhì)量控制 277.4 室間質(zhì)量評價 287.5 PCR 污染控制 28附錄 A ：常見的檢測項目 29A.1 基因突變檢測項目 29A.2 基因表達(dá)檢測項目 40A.3 融合基因檢測項目 44A.4 基因甲基化檢測項目 46參考文獻(xiàn)： 491. 本指南使用范圍本指南由國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會制定，是國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測指南的重要內(nèi)容，旨在為臨床分子檢測實驗室進(jìn)行腫瘤個 體化用藥基因的檢測提供指導(dǎo)。本指南的主要適用對象

5、為開展個體化醫(yī)學(xué)分子檢 測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床分子檢測實驗室。2. 簡介腫瘤個體化治療以疾病靶點(diǎn)基因診斷信息為基礎(chǔ)，以循證醫(yī)學(xué)研究結(jié)果為依 據(jù)，為患者提供接受正確治療方案的依據(jù)，已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢。臨床研究證實，通過檢測腫瘤患者生物樣本中生物標(biāo)志物的基因突變、基因SNP分型、基因及其蛋白表達(dá)狀態(tài)來預(yù)測藥物療效和評價預(yù)后，指導(dǎo)臨床個體化治療， 能夠提高療效，減輕不良反應(yīng)，促進(jìn)醫(yī)療資源的合理利用。3. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語和基因突變命名3.1標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語1) 基因(Gene):是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，是指具有一定生物學(xué)意義的一段 DNA。2) 突變(Mutation )：是細(xì)胞中DNA核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定的改

6、變。3) 融合基因(Fusion gene ):是指兩個基因的全部或一部分的序列相互融合為 一個新的基因的過程。融合基因的表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白。4) 基因表達(dá)(Gene Expression ):是基因中的DNA序列生產(chǎn)出蛋白質(zhì)的過程。 步驟從DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA開始，一直到對于蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾為止。5）基因擴(kuò)增（gene amplification ）：為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇 性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。6）DNA甲基化（DNA Methylation ）：為DNA化學(xué)修飾的一種形式，將甲基 添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶環(huán)的5'碳上。DNA甲基化能在不

7、改變DNA 序列的前提下，將DNA甲基化狀態(tài)遺傳至下一代細(xì)胞或個體。7）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）:是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。利用DNA在 體外攝氏高溫時變性會變成單鏈，低溫時引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'） 的方向合成互補(bǔ)鏈。8）質(zhì)控品：是含量或成分已知的處于與實際樣本相同的基質(zhì)中的特性明確的物 質(zhì)，這種物質(zhì)通常與其他雜質(zhì)混在一起，專門用于質(zhì)量控制目的的樣本或溶液。3.2基因突變命名人類基因組突變學(xué)會（HGVS）已建立系統(tǒng)的基因突變命名方法。具體基因突變命名方法可 查閱 網(wǎng)站 nomen/

8、in dex.html。HGVS基因突變命名指南根據(jù)需求不斷更新。本文以 2011年8月更新版本為準(zhǔn)。當(dāng)描述某一序列改變時，其前綴表明其參考序列類型。例如“g. ”表示基因組序列，“ c.”表示cDNA序列，“m. ”表示線粒體DNA序列，“ r.”表示RNA 序列，“p. ”表示蛋白序列。在數(shù)據(jù)庫中的收錄號以及版本號應(yīng)當(dāng)在實驗記錄報 告中列出，當(dāng)兩種突變在反式（in trans ）中檢測到，則用方括號表示。例如， CF突變?yōu)殡s合性突變（508號苯丙氨酸缺失和1303號天冬酰胺被賴氨酸替代）， 則在DNA水平規(guī)范描述方式為c.1521_1523delCTT+3909C>G。3.3 參考序

9、列美國國立生物技術(shù)信息中心 （NCBI ）收錄的參考序列編碼具有權(quán)威性及唯一 性。其中前綴“ NM_ ”表示為 mRNA 序列，“ NP_ ”表示多肽序列，“ NG_ ” 表示基因組序列?；蚪M參考序列應(yīng)列出完整基因序列，包括 5'以及3' 非編碼區(qū)（UTR）。當(dāng)使用某段編碼DNA參考序列描述突變時，應(yīng)選擇合適的轉(zhuǎn)錄體， 且轉(zhuǎn)錄體的起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)應(yīng)當(dāng)明確， 例如選擇最常見的轉(zhuǎn)錄體， 或者是已知的最大 轉(zhuǎn)錄體，或者具有組織特異性的編輯轉(zhuǎn)錄體。 當(dāng)某一參考序列具有多種轉(zhuǎn)錄方式 時，選擇NCBI數(shù)據(jù)庫里注釋最全面的版本。3.4 各類變異3.4.1 DNA 序列變異術(shù)語規(guī)范DNA核苷酸用大

10、寫字母A （腺嘌呤）、C （胞嘧啶）、G （鳥嘌呤）以及T （胸 腺嘧啶）來表示。用正鏈來表示 DNA 序列。當(dāng) DNA 序列改變時，以相應(yīng)核苷 酸所在位置及相應(yīng)字母來描述。 “> ”符號表示“從某一變化至另一” 。在描述突 變方式時，數(shù)字、字母、箭頭、上標(biāo)以及下標(biāo)之間不應(yīng)出現(xiàn)空格。3.4.2 RNA 序列變異術(shù)語規(guī)范RNA序列以小寫字母a （腺嘌呤）、c （胞嘧啶）、g （鳥嘌呤）、u （尿嘧啶） 進(jìn)行描述。 RNA 序列改變描述方式與 DNA 相類似。具體術(shù)語可參閱 HGVS 網(wǎng) 站（ ）。3.4.3 蛋白質(zhì)序列變異術(shù)語規(guī)范 蛋白質(zhì)序列改變通常以單個字母或三個字母（第一個字母大寫）來

11、描述。盡管單個字母描述氨基酸明確無誤， 但是由于三聯(lián)密碼子相對于其編碼的氨基酸存 在冗余性，具體給出發(fā)生突變的三聯(lián)體密碼子可以更清楚地描述氨基酸改變方 式。例如，用來描述氨基酸的 A （丙氨酸）、C （半胱氨酸）、G （甘氨酸）以及 T （蘇氨酸）可能會與核苷酸字母 A （腺嘌呤）、C （胞嘧啶）、G （鳥嘌呤）以及 T （胸腺嘧啶）相混淆。3.4.4 錯義突變及無義變異術(shù)語規(guī)范由于三聯(lián)體密碼子的簡并性， 多個位點(diǎn)核苷酸的改變可能不影響最終氨基酸 序列。因此，應(yīng)該分別從 DNA 水平和氨基酸水平描述突變。從 DNA 水平對某 一突變位點(diǎn)的描述方式包括堿基位點(diǎn)，正常堿基， “> ”符號，突

12、變堿基。例如， 某一蛋白第551號氨基酸殘基由G （甘氨酸）突變?yōu)镈 （天冬氨酸），從DNA 水平描述即 c.1652G>A 。在氨基酸水平， 由于錯義突變的產(chǎn)物以氨基酸殘基位點(diǎn)以及表示氨基酸的單 字母或三聯(lián)體密碼子來描述。表示方法是野生型的氨基酸、位點(diǎn)、突變氨基酸， 三者之間不要有空格。例如，p.Gly551Asp表示該蛋白中551號甘氨酸殘基（G） 被天冬氨酸殘基（D ）所代替。無義突變表示方法與之相類似。需要指出的是“X” 符號代表終止密碼子。例如， p.Gly542X 表示 542 位點(diǎn)的甘氨酸殘基被終止密 碼子所代替。3.4.5 缺失和插入術(shù)語規(guī)范缺失和插入突變分別用前綴“ d

13、el ”和“ins”來表示，并注明突變位點(diǎn)以及 堿基。例如，c.441delA 表示在該DNA序列中441號位點(diǎn)發(fā)生A堿基缺失。 c.241_243delATC 表示在該DNA序列中從241號到243號缺失ATC三個堿基。在蛋白水平，上述突變描述方式為 p.Ile24del ，表示該蛋白質(zhì)中第 24 號的 異亮氨酸殘基發(fā)生缺失。 “ indels ”則表示該段序列缺失的同時有片段插入。例 如， 234_239delAATTCGinsTA （或者 234_239delinsTA ）表示該 DNA 序列 234 至 239 號位點(diǎn)缺失 AATTCG 六個堿基，同時該段位點(diǎn)被新插入的 TA 堿基 所

14、替代。3.4.6 移碼突變術(shù)語規(guī)范移碼突變用“ fs”符號來表示?！癴s*# ”則用于進(jìn)一步描述突變類型。例如，.His62Profs*21 表示該蛋白發(fā)生移碼突變，第 62 號氨基酸由組氨酸突變?yōu)楦?氨酸并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第 62 號密碼子下游 21 號密碼子處。該突變 也可簡要描述為 p.His62fs ，即該蛋白從第 62 號密碼子發(fā)生移碼突變。3.4.7 堿基重復(fù)序列HGVS 推薦，核苷酸重復(fù)序列基因多態(tài)性描述時通常以一個重復(fù)序列為單 元，后面加上“ 重復(fù)的次數(shù) ”，如 CGG55 。當(dāng)重復(fù)序列的次數(shù)在一個范圍之 內(nèi)時，需要在小括號“()”中標(biāo)注出可能的最少的和最高的重復(fù)次數(shù)，

15、如某個人 HTT 基因中發(fā)現(xiàn)有 12 個和 15 個 CAG 重復(fù)，基因水平的表示如下：.52CAG12+15 ，蛋白水平則表示為： p.Gln1812+15。 HTT 基因的重復(fù)序列范圍則描述為： c.52CAG(27_35) 或 p.Gln18(27_35) 。3.4.8 遺傳藥理學(xué)基因型術(shù)語規(guī)范最廣泛使用的命名法描述遺傳藥理學(xué)基因型不同于其他遺傳學(xué)基因檢測， 例 如代謝相關(guān)基因細(xì)胞色素p450家族，人類細(xì)胞色素P450 (CYP)等位基因命 名委員會( )推薦用“ *”命名，見圖 1。在該系統(tǒng) 中，最常見的等位基因被指定為“ * 1”。CYlxhr”" P450 2 D 6 4

16、SuperfamilyFamily Subfamily Isoenzyme Allele variant圖1.細(xì)胞色素P4502D6等位基因命名規(guī)范349其他對于更復(fù)雜的突變，可參考 HGVS ()建議的命名規(guī)則，解決其他復(fù)雜的變異的命名。4.分析前質(zhì)量保證4.1樣本類型及獲取新鮮組織(包括手術(shù)和活檢組織)腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質(zhì)的 DNA、RNA。在手術(shù)現(xiàn)場取樣的情況也比較多，但需要在顯微鏡下確認(rèn)腫瘤細(xì)胞含量。周圍炎癥嚴(yán)重的腫瘤、黏液產(chǎn)生過高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細(xì)胞不能采集，以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作組織標(biāo)本，然后進(jìn)行確認(rèn)。手術(shù)切除的組織樣

17、本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80 C冰箱，這一過程應(yīng)在手術(shù)樣本離體后30分鐘內(nèi)完成。由于組織樣本通常需先進(jìn)行病理學(xué)分析，在分析完成后應(yīng)盡早將組織樣本置于穩(wěn)定劑中，避免核 酸降解。4.1.2 石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded， FFPE)10%中性福爾馬林固定手術(shù)切除樣本，按病理學(xué)操作規(guī)范進(jìn)行取材。制作石蠟切片時，切取5片連續(xù)切片，其中1片進(jìn)行HE染色，確認(rèn)腫瘤細(xì) 胞的含量。在高靈敏度檢測方法中，可考慮使用活檢標(biāo)本。DNA容易受固定的影響，長時間（1周以上）浸泡在福爾馬林中的樣本的 DNA會被片段化，不能檢出突變。活檢材料的

18、固定時間一般是24小時，對于穿刺等活檢樣本，固定時間控制在 624小時為佳。胸腹水等細(xì)胞學(xué)樣本用胸腹水中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測時， 必須確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，穿刺獲得胸腹 水樣本提交給細(xì)胞病理檢查之后，剩余液體冷藏/冷凍保存，也可在含有細(xì)胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質(zhì)變性劑的緩沖液（ AL緩沖液，Qiagen公司） 等室溫保存。由于細(xì)胞學(xué)樣本的腫瘤細(xì)胞含量較低， 因此必須使用高靈敏度檢測 方法。血漿樣本循環(huán)DNA（circulating free DNA，cfDNA）是存在于血漿中的游離 DNA，腫瘤來源的 DNA占血漿游離 DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊（0.0193%），從而限制了外周血

19、在腫瘤分子檢測時的應(yīng)用。目前已有多篇文獻(xiàn)證實可利用從血漿游離DNA檢出突變，但需要使用ARMS法等靈敏度非常 高的檢測方法。采集外周血提取血漿游離 DNA進(jìn)行檢測，取樣時應(yīng)使用一次性密閉 EDTA 抗凝真空采血管，采集610ml全血，冷藏運(yùn)輸，6小時內(nèi)分離血漿，提取游離 DNA，保存到-80 C冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需長時間運(yùn)輸，建議用 商品化的游離DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存74.2 采樣質(zhì)量的評價 腫瘤細(xì)胞是否存在， 是開展腫瘤個體化治療基因檢測的重要前提。 如果要確 認(rèn)腫瘤細(xì)胞存在，與病理診斷醫(yī)生密切合作是非常必要的。采樣評價內(nèi)容包括： 細(xì)胞組成

20、、 腫瘤細(xì)胞的數(shù)量， 是否按照要求進(jìn)行處理與 運(yùn)輸。評價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和濃度分析等。腫瘤組織切片等應(yīng)經(jīng)病理醫(yī)師審閱，取一張切片 HE 染色后顯微鏡下觀察， 確保腫瘤細(xì)胞存在，并記錄腫瘤組織含量，標(biāo)注腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域。4.3 樣本采集中的防污染 樣本采集最好采用一次性材料，不用處理便可直接使用； 制備不同患者病理切片樣本時， 需更換新刀片， 并清除操作器皿上先前樣本 的殘留；采集中要特別注意防止污染，防止混入操作者的毛發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的 DNase 失活； 如提取 RNA 樣品，必須采用 RNase 抑制劑措施和無 RNase

21、材料。4.4 樣本運(yùn)送和保存 原則上按照個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南要求進(jìn)行。實驗室應(yīng)建立詳細(xì)的樣本運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）,對臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊，要求物流人員填寫相關(guān)運(yùn)送記錄表， 確保運(yùn)送過程中樣本的安全性和 過程的可控性。需要轉(zhuǎn)送的樣本：用于 RNA 檢測的樣本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速 凍后，放在干冰中運(yùn)送。經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的樣本可在常溫下運(yùn)送，如用于 DNA 擴(kuò)增檢測的 EDTA 抗凝全血樣本及用于 RNA 擴(kuò)增檢測的經(jīng)穩(wěn)定化處理的樣本。 5.分析中質(zhì)量保證5.1 實驗室設(shè)計要求 原則上按照個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南要求進(jìn)行。在符合國家衛(wèi)生 計生委要求的個體化醫(yī)學(xué)檢測實驗室

22、和通過審核驗收的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗 室完成。5.2 檢測方法5.2.1 Sanger 測序法5.2.1.1 技術(shù)原理Sanger 測序法即雙脫氧鏈終止法( Chain Termination Method )，利用一 種 DNA 聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。 直到摻入一種鏈終止核苷 酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成， 每個反應(yīng)含有所有四種脫 氧核苷酸三磷酸 (dNTP) ，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸 (ddNTP) 。 由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在 G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。

23、每一種 dNTPs和 ddNTPs 的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn) 物。它們具有共同的起始點(diǎn)， 但終止在不同的的核苷酸上， 可通過高分辨率變性 凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用 X- 光膠片放射自顯影或非同位 素標(biāo)記進(jìn)行檢測。5.2.1.2 技術(shù)特點(diǎn)該方法是 DNA 序列分析的經(jīng)典方法，最直接的、可檢測已知和未知突變的 一種方法。由于該方法可直接讀取 DNA 的序列，因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo) 準(zhǔn)。主要優(yōu)點(diǎn)： 測序長度較長， 可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)， 包括一些新的少見的突變 形式及突變的確切類型，如點(diǎn)突變、片段缺失。局限性：靈敏度不高，突變等位基因需要超過2

24、0% 才能檢出。對樣本中腫瘤細(xì)胞的含量和比例要求較高，一般要求腫瘤細(xì)胞含量不低于 50% ，如果腫瘤 細(xì)胞比例低于 50% ，則假陰性出現(xiàn)的概率會顯著增加；不適用于活檢或細(xì)胞學(xué) 樣本。5.2.2 焦磷酸測序法( Pyrosequencing )5.2.2.1 技術(shù)原理焦磷酸測序技術(shù)是由 4 種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 當(dāng)測序引物與模板 DNA 退火后，在 DNA 聚合酶、 ATP 硫酸化酶、熒光素酶和 三磷酸腺苷雙磷酸酶等 4 種不同酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個 dNTP 聚合 時釋放的焦磷酸基團(tuán)(PPi)與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的 釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實時

25、測定 DNA 序列和定量分析序列變化的目的。5.2.2.2 技術(shù)特點(diǎn)焦磷酸測序技術(shù)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，其重復(fù)性和精確性可與 Sanger 測序相媲美，而測序速度則大大提高，非常適合對已知的短序列進(jìn)行重 測序分析。主要優(yōu)點(diǎn)：檢測靈敏度為 10% ，相對 Sanger 測序法高，對體細(xì)胞突變和 甲基化等可實現(xiàn)定量檢測；分型準(zhǔn)確可靠，通量較高，實驗設(shè)計靈活，可發(fā)現(xiàn)新 的突變或遺傳變異。局限性：測序長度較短，不能對長片段進(jìn)行分析。檢測靈敏度中等，難以檢 出低于 10% 的突變。不適用于活檢或細(xì)胞學(xué)樣本。5.2.3 新一代測序 ( next generation sequencing，NGS

26、)5.2.3.1 技術(shù)原理NGS 又稱大規(guī)模平行測序 (MPS )，包含多種可以一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基 因序列的測序技術(shù)，是繼 Sanger 測序的革命性進(jìn)步，采用平行測序的理念，能 夠同時對上百萬甚至數(shù)十億個 DNA 分子進(jìn)行測序，實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序 的目標(biāo)。不同廠家的產(chǎn)品測序原理不同，主要分為邊合成邊測序(Sequencing by synthesis ，SBS)、基于 DNA 簇”和可逆性末端終結(jié)(Reversible Terminator ) 大規(guī)模平行測序、 4 色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)測序和半導(dǎo)體芯片測 序。5.2.3.2 技術(shù)特點(diǎn) 高通量測序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)?；?/p>

27、因組測序，還可用于基因表達(dá)分析、 非編碼小分子 RNA 的鑒定、轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選和 DNA 甲基化等相關(guān)研究。 主要優(yōu)點(diǎn)：高通量測序技術(shù)有三大優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng) Sanger 測序法所不具備的。第一，它利用芯片進(jìn)行測序，可以在數(shù)百萬個點(diǎn)上同時閱讀測序。第二，高通量 測序技術(shù)有定量功能，樣品中 DNA 被測序的次數(shù)反映了樣品中這種 DNA 的豐 度。第三、利用傳統(tǒng) Sanger 測序法完成的人類基因組計劃總計耗資 27 億美元， 而現(xiàn)在利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行人類基因組測序，測序成本只需 1 千美金。局限性：檢測靈敏度和測序深度相關(guān)，一般來說， NGS 在腫瘤體細(xì)胞突變檢 測時，檢測靈敏度為 10%

28、；已知的與腫瘤相關(guān)驅(qū)動基因數(shù)量有限，疾病表型和 基因型的關(guān)系還有賴于生物信息的解讀，目前 NGS 應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞突變檢測的 標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制尚未形成共識。5.2.4 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng) (ARMS ) -PCR 法5.2.4.1 技術(shù)原理擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)( amplification refractory mutation system, ARMS)是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱等位基因特性 PCR(allele-specific PCR,AS-PCR ) 等，用于對已知突變基因進(jìn)行檢測。該法通過設(shè)計兩個5'端引物，一個與正常DNA 互補(bǔ)，一個與突變 DNA 互補(bǔ)，對于純合性突變，分別加入

29、這兩種引物及 3'端引物進(jìn)行兩個平行 PCR，只有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的 3'端則導(dǎo)致PCR不能延伸。5.2.4.2 技術(shù)特點(diǎn)ARMS-PCR 是目前實驗室常用的基因突變檢測方法。主要優(yōu)點(diǎn)：ARMS-PCR法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細(xì)胞中突變比例為1% 甚至更低的突變基因。局限性：只能檢測已知的突變類型，不能發(fā)現(xiàn)一些新的、未知的突變；如果 檢測的突變位點(diǎn)或類型較多， 則隨著引物數(shù)目增加出現(xiàn)非特異性結(jié)合的概率也相 應(yīng)增加；當(dāng)檢測位點(diǎn)較多時，對 DNA 樣本量的需求增加。5.2.5 高分辨率熔解曲線( HRM )法5.2.5.1

30、技術(shù)原理高分辨率熔解曲線( high-resolution melting ，HRM )是一種基于 PCR 新型技術(shù)， 用于檢測基因變異包括未知的基因變異、 單核苷酸多態(tài)性以及基因甲 基化。 HRM 是基于在加熱過程中雙鏈變性為單鏈的原則。 DNA 雙鏈體的熔解 溫度差異反應(yīng)了基因的變異。雙鏈 DNA 片段在其特定的溫度熔解，熔解的溫度 由片段的 CG 含量、序列組成、長度以及一個和多個雜合堿基決定。用 DNA 嵌 合的染料可以看到任何雙鏈片段的熔解峰圖，在有熒光嵌合染料的情況下 PCR 擴(kuò)增片段， 擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過一個快速的可控的加熱處理開始熔解。 熒光水平在 升溫的過程中實時監(jiān)測，染料隨著

31、雙鏈 DNA 的熔解，熒光信號逐漸減少。5.2.5.2 技術(shù)特點(diǎn)由于 HRM 分析不受堿基突變位點(diǎn)和種類的限制， 可用于突變掃描、 基因分 型、序列匹配、 DNA 甲基化等方面的研究。主要優(yōu)點(diǎn)：檢測靈敏度 1% ，特異性高，重復(fù)性好；封閉體系，減少污染的 可能性；擴(kuò)增和檢測同時進(jìn)行，無需 PCR 后進(jìn)行處理。局限性：通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體， 下游分析中檢測 需要有測序等補(bǔ)充。5.2.6 數(shù)字 PCR(Digital PCR )5.2.6.1 技術(shù)原理數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于 qPCR，數(shù)字PCR能夠直 接數(shù)出 DNA 分子的個數(shù)，對起始樣品絕對定量。通過

32、將一個樣本分成幾萬到幾 百萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子 ( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后 對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)字PCR技術(shù)不斷發(fā)展，Bio-Rad、LIFE Technologies、Fluidigm 及RainDanee 等廠家相繼推出技術(shù)較為成熟的 數(shù)字PCR產(chǎn)品。526.2技術(shù)特點(diǎn)數(shù)字PCR目前的應(yīng)用包括：稀有等位基因檢測、基因表達(dá)絕對定量、核酸 標(biāo)準(zhǔn)品絕對定量、二代測序文庫絕對定量等。主要優(yōu)點(diǎn)：靈敏度可達(dá)0.0010.0001% ，高特異性，可檢測復(fù)雜背景下的 靶標(biāo)序列；可高度耐

33、受 PCR反應(yīng)抑制劑；不必依賴對照品或標(biāo)準(zhǔn)品，可對目標(biāo) 拷貝數(shù)直接進(jìn)行精確的鑒定，分析微小的濃度差異；實驗數(shù)據(jù)分析便捷，每個微 滴的檢測結(jié)果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動化；可統(tǒng)計突變率，通過統(tǒng)計分 析可得出靶點(diǎn)的突變率。局限性：數(shù)字PCR儀通量較低，目前通常能檢測的信號為 FAM和HEX。 一般單個反應(yīng)2重反應(yīng)效果最佳；數(shù)字 PCR優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，但是對于 DNA 濃度大的樣本處理就沒有優(yōu)勢，而且核酸濃度高時，每個微滴里面包含的拷貝數(shù) 不符合泊松分布；數(shù)字PCR雖然不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是每次反應(yīng)之間存在差異， 短期內(nèi)不能代替qPCR，也不能代替其他金標(biāo)準(zhǔn)而作為首選方法。QX200等數(shù) 字PCR

34、儀目前僅用于科研用途，數(shù)字 PCR走向臨床檢驗還需要一段時間。熒光原位雜交(FISH)技術(shù)原理熒光原位雜交(fluorescenee in situ hybridization, FISH)是通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果 的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性， 即可形成靶 DNA 與核酸探針的雜交體。 將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告 分子如生物素、 地高辛，可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免 疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系

35、在鏡下對待測 DNA 進(jìn)行定性、定量或相對定位分 析。5.2.7.2 技術(shù)特點(diǎn)FISH 主要可對基因缺失、基因融合、基因擴(kuò)增進(jìn)行檢測。主要優(yōu)點(diǎn)：可多種熒光標(biāo)記， 顯示 DNA 片段及基因之間的相對位置與方向， 空間定位精確；靈敏、特異性好，可同時分析分裂期和間期的多個細(xì)胞，并進(jìn)行 定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復(fù)雜核型。局限性： FISH 檢測對操作和判讀技術(shù)要求較高，診斷醫(yī)師必須經(jīng)過嚴(yán)格的FISH操作和結(jié)果判讀培訓(xùn)，只有經(jīng)FISH操作經(jīng)驗豐富的醫(yī)師判定的結(jié)果才具有 可靠性；目前 FISH 檢測的成本昂貴、通量低。5.2.8 免疫組化( IHC )5.2.8.1 技術(shù)原理免疫組化( I

36、mmunohistochemistry ， I H C )分析利用抗體和抗原之間的結(jié) 合的高度特異性，借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位和強(qiáng)度顯示出 來，以其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的研究。5.2.8.2 技術(shù)特點(diǎn)IHC作為篩查工具優(yōu)于FISH，具有經(jīng)濟(jì)快捷的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于大量樣本 的檢測分析。影響 IHC 結(jié)果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定， 觀察者解釋方面的差別等。529 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR(Q-RT-PCR)529.1技術(shù)原理逆轉(zhuǎn)錄 PCR ( reverse transcriptionPCR)或者稱 反轉(zhuǎn)錄 PCR(reversetran

37、scription-PCR, RT-PCR),是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA 聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依 賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的 PCR。原先的RNA 模板被RNA酶H降解，留下互補(bǔ)DNA。529.2技術(shù)特點(diǎn)熒光定量PCR是檢測拷貝數(shù)變化的一種快速且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)方法，該方法技術(shù)可用于RNA表達(dá)水平檢測該技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)是檢測快速、通量高、靈敏度好， 主要不足是對腫瘤組織提取RNA的質(zhì)量要求較高，在檢測基因表達(dá)量時判讀標(biāo) 準(zhǔn)尚未統(tǒng)一

38、。FISH、IHC和Q-RT-PCR三種方法在檢測ALK基因重排時的優(yōu)缺 點(diǎn)分析見表1。表1 : FISH、IHC和Q-RT-PCR檢測ALK基因重排的優(yōu)缺點(diǎn)比較IHCFISHQ-RT-PCR檢測對象蛋白DNARNA特異性+發(fā)現(xiàn)的融合類型已知、未知已知、未知已知通量+費(fèi)用+523檢測方法選擇策略實驗室應(yīng)優(yōu)選國際和國內(nèi)“金標(biāo)準(zhǔn)”的檢測方法，同類方法中優(yōu)先選擇結(jié)果 穩(wěn)定性、重復(fù)性好、特異性高的技術(shù)，同時也應(yīng)考慮樣本量，檢測項目的多少等， 綜合選擇合適的方法。由于腫瘤組織的異質(zhì)性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提 取的DNA質(zhì)量和數(shù)量有限，就檢測靈敏度而言，目前ARMS-PCR焦磷酸測序

39、Sanger測序。在檢測腫瘤基因突變時，不能一味追求檢測方法的靈敏度，靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質(zhì)控要求更為嚴(yán)格，需防止因污染而產(chǎn)生假陽性。在腫瘤靶基因表達(dá)檢測時，由于腫瘤樣本的不可再生性，需謹(jǐn)慎選擇使用的 方法，如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達(dá)1舊以上，如果腫瘤組織過小， 提取的RNA量可能達(dá)不到檢測要求，此時應(yīng)考慮選用對樣本量要求低的檢測方 法。檢測項目本指南根據(jù)檢測靶分子（DNA或RNA ）類型及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制類型的不 同，將腫瘤個體化治療檢測項目分為基因突變、基因表達(dá)、融合基因、基因甲基 化檢測四個類型。所述檢測項目均為目前在腫瘤臨床診療中， 經(jīng)過嚴(yán)格的循證醫(yī) 學(xué)

40、實驗，且具有明確的臨床應(yīng)用價值，詳見附錄 1。實驗室在開展腫瘤個體化檢 測項目時，應(yīng)評估所開展的檢測項目的科學(xué)性，并遵循實驗室的質(zhì)量管理相關(guān)規(guī)5.3 DNA 提取方法與質(zhì)量控制DNA 提取之前的病理質(zhì)量控制非常重要， 它決定了最終檢測結(jié)果的可靠性。 樣本進(jìn)行檢測前均先行常規(guī)病理檢查和診斷 （HE 染色），必須經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī) 師確定腫瘤細(xì)胞的百分比 （腫瘤細(xì)胞整張切片所有細(xì)胞，必要時應(yīng)采取富集腫 瘤細(xì)胞的方法， 如手工刮取或顯微切割法。 選取以腫瘤細(xì)胞為主的、 沒有明顯的 壞死、黏液和炎性改變的組織進(jìn)行檢測。腫瘤細(xì)胞比例尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，理想情況下，石蠟樣本中腫瘤細(xì)胞的比例不應(yīng)低于50% ,新鮮樣

41、本不低于25% ,對于ARMS等敏感性較高的方法，腫瘤細(xì)胞 的含量和比例可以低一些。 具體視所采用的 DNA 提取方法和突變檢測方法的敏 感度等而定。對于新鮮和凍存的手術(shù)組織樣本，可采用常規(guī)的商品化 DNA 提取試劑盒。 對于活檢樣本，推薦使用能提取石蠟包埋組織微量 DNA 的試劑盒。對于商品化 核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前， 必須對其核酸提取純度和效率進(jìn)行評價。 純化的靶核酸的完整性可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與核酸標(biāo)準(zhǔn)品比較 測定。核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測定，DNA可溶于TE溶液中，建議濃度控制 在50100ng/ul ，總量2040 或以上。核酸純度：可通過提取物A2

42、60/A280比率判定，DNA的比值為1.8，RNA的比 值為2.0。若DNA比值高于1.8，說明制劑中RNA尚未除盡。RNA、DNA溶 液中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。5.4 RNA提取方法與質(zhì)量控制RNA提取常比較困難，尤其是保存年限較長的腫瘤組織，RNA降解非常嚴(yán)重。造成RNA降解的原因有兩個方面：RNA核糖殘基的2 '和3 '位置帶有羥基， 易被水解；生物體內(nèi)和外部環(huán)境中存在大量RNA酶，并且RNA酶不易失活，高溫后仍然能夠正確折疊恢復(fù)活性。因此從樣本的儲存、RNA的提取及保存，都需要格外小心，防范 RNase對RNA的降解作用。RNA提取的經(jīng)典方法是胍鹽提取結(jié)合酚-

43、氯仿抽提，石蠟樣本或活檢樣本可 使用商品化RNA提取試劑盒純化。細(xì)胞或組織的徹底勻漿是 RNA提取過程中 關(guān)鍵的步驟，它能夠防止 RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的 類型來選擇。核酸提取的產(chǎn)率：RNA可溶于無RNase的純水中，建議濃度控制在 100ng/ul以上，總量達(dá) 30 pg以上。純化后的 RNA 應(yīng)測定 OD260/OD280 比值，RNA : 1.7 v OD260/OD280V2.0（V 1.7時表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0時表明可能有異硫氰酸殘存）， 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察有無 DNA污染和RNA的完整程度。5.5試劑的選擇、儲存及使用注意事項臨床檢測試劑必須為C

44、FDA批準(zhǔn)的試劑，或具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 的自配試劑（LDT ）。所采用的測定方法特異性好，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度符合國家衛(wèi)生計生委 臨床檢驗中心、IFCC、WHO等推薦的方法性能。所用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)參考物符合 國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心推薦的標(biāo)準(zhǔn)和要求。5.6 核酸擴(kuò)增質(zhì)量控制臨床 PCR 檢測方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù) 性、準(zhǔn)確性，盡量降低假陽性、假陰性和非特異性擴(kuò)增。臨床樣本擴(kuò)增時，經(jīng)常 出現(xiàn)假陽性和假陰性，導(dǎo)致檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論，有時可造成嚴(yán)重后果。在核酸提取中，應(yīng)至少帶有 1 份已知弱陽性質(zhì)控樣本。其最后的檢測結(jié)果， 應(yīng)是核酸提取和擴(kuò)增檢測有效性的

45、綜合反映。 同時，還應(yīng)至少帶一份已知陰性質(zhì) 控樣本，擴(kuò)增測定的結(jié)果可以判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染。如靶核酸為 DNA ，為判斷 DNA 擴(kuò)增的有效性，可使用 1 份已制備好的弱 陽性靶 DNA 樣本，直接與靶核酸同時擴(kuò)增檢測。如靶核酸為 RNA ，則除了可 用上述弱陽性 cDNA 判斷 DNA 擴(kuò)增有效性外，還可用已制備好的弱陽性 RNA 質(zhì)控來判斷反轉(zhuǎn)錄的有效性。 另外， 須設(shè)立陰性對照樣品。 陰性對照樣品檢測為 陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到核酸污染。 在陰性對照樣品和陽性對 照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判定。5.7 設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)實驗室儀器的保養(yǎng)與維

46、護(hù)是實驗室實驗技術(shù)員的重要組成部分， 儀器的保養(yǎng) 與維護(hù)關(guān)系到儀器的適用率、數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率。儀器設(shè)備安裝及技術(shù)性能驗收需由項目負(fù)責(zé)人、 儀器設(shè)備使用人、 實驗室技 術(shù)人員共同完成，驗收內(nèi)容按采購合同中技術(shù)需求部分以服務(wù)協(xié)議書的要求逐項 進(jìn)行，并且建立儀器設(shè)備檔案。儀器設(shè)備應(yīng)定期開展校準(zhǔn)計量，未經(jīng)計量檢定、計量檢定不合格或未驗收的 對測試有重要影響的儀器設(shè)備不得投入使用。實驗室日常工作中，應(yīng)重視儀器設(shè)備的清潔及維護(hù)，做到日維護(hù)、周維護(hù)、 月維護(hù)，并及時記錄。5.8人員培訓(xùn)檢測人員應(yīng)該有相關(guān)的教育背景、相應(yīng)的工作經(jīng)驗，接受過專業(yè)培訓(xùn)。培 訓(xùn)主要有內(nèi)部和外部培訓(xùn)，內(nèi)部培訓(xùn)包括所使用的試劑方法原理、 儀

47、器設(shè)備操作 維護(hù)及校準(zhǔn)、質(zhì)量控制等，外部培訓(xùn)包括國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心和國家衛(wèi) 生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測培訓(xùn)基地等機(jī)構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓(xùn)。5.9方法的性能驗證方法學(xué)引進(jìn)初期需對檢測系統(tǒng)測定項目各參數(shù)的實驗或評估性驗證，包括精 密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、臨床可報告范圍、特異性、檢測下限、抗干擾能力等。所有項目的方法驗證應(yīng)形成詳細(xì)的資料備存， 資料需詳細(xì)描述方法驗證的目 的、過程、檢測結(jié)果、分析判斷及驗證結(jié)論。驗證的結(jié)果及結(jié)論須經(jīng)實驗室負(fù)責(zé) 人簽字后才能用于臨床檢測。根據(jù)項目的特性，一些方法驗證指標(biāo)不需進(jìn)行或未 進(jìn)行時，需在報告中書面解釋原因。推薦用打印的文稿并在專用文件夾保存。具體的性能驗證

48、方法，如使用的是經(jīng) CFDA批準(zhǔn)的試劑，可參照試劑盒說 明書上相應(yīng)的性能指標(biāo)部分進(jìn)行驗證，看是否能在其實驗室內(nèi)復(fù)現(xiàn)說明書所顯示 的上述性能指標(biāo)。如為自制試劑或自建方法，則參考LDT技術(shù)指南進(jìn)行性能評價，建立上述性能指標(biāo)。以下方法可供參考?！緶?zhǔn)確度】1）參加國家衛(wèi)生計生委臨檢中心組織的室間質(zhì)評，從室間質(zhì)評統(tǒng)計結(jié)果評價實 驗室檢測結(jié)果的偏倚或符合情況，從而評價和驗證實驗室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。2) 方法比較實驗：當(dāng)引進(jìn)新方法與原有方法進(jìn)行比較時，最少樣本數(shù)為20 例，用兩種方法同時測定同樣的樣品。 如結(jié)果有不符合時， 應(yīng)采用第三種方法或試劑 進(jìn)行確認(rèn)。3) 檢測已知值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對于樣本來源存在問題的

49、檢測方法，可以對已知值 的樣本稀釋成不同濃度再檢測，以評估其準(zhǔn)確度?！眷`敏度】1) 分析靈敏度：就是確定檢測方法的檢測下限：將一份已知定值的標(biāo)準(zhǔn)品，用 野生型的基因組稀釋突變型基因組， 設(shè)定不同的突變含量， 一直稀釋到檢測下限 以下為止，平行檢測3管，3管全部檢出且其線性I r I勒98的最低稀釋濃度即 為該方法的檢測下限。 (可根據(jù)實際情況在最低稀釋濃度附近進(jìn)行 10 倍以下的 稀釋)2) 臨床靈敏度：主要是驗證方法的假陰性率。從三甲醫(yī)院或?qū)I(yè)權(quán)威檢測機(jī)構(gòu) 收集 2050 例樣本，進(jìn)行檢測分析，其靈敏度應(yīng)滿足臨床檢測要求，靈敏度 =TB/(TB+FN) X100 (TB=true posit

50、ive 、 FN=false negative )；有 CFDA 批 文的檢測試劑，收集20例陽性樣本進(jìn)行驗證；沒有CFDA批文的檢測試劑或自 己實驗室研發(fā)的LDT試劑，收集50例陽性樣本進(jìn)行驗證，并應(yīng)進(jìn)行室間比對。 【特異性】1 )特異性的驗證主要是確認(rèn)該方法的假陽性率，特異性=TN/(TN+FP) X100( TN=true negative 、 FN=false positive )。2)從三甲醫(yī)院或?qū)I(yè)權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)收集2050 例陰性樣本，進(jìn)行檢測分析，其特異性應(yīng)滿足臨床檢測要求。有 CFDA 批文的檢測試劑，收集 20 例陰性樣本 進(jìn)行驗證；沒有 CFDA 批文的檢測項目或自己研發(fā)的

51、項目，收集 50 例陰性樣本 進(jìn)行驗證。6. 分析后質(zhì)量保證6.1 檢測結(jié)果的記錄1）檢測結(jié)果的報告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、明確、客觀和及時，杜絕虛假報告。2）儀器原始數(shù)據(jù)要仔細(xì)分析，根據(jù)質(zhì)控品判斷PCR擴(kuò)增的有效性，只有當(dāng)質(zhì)控 品的擴(kuò)增結(jié)果符合項目 SOP 有關(guān)條件時，才可發(fā)出報告，否則應(yīng)重新測定。3）患者檔案及測定結(jié)果一并錄入 “檢驗管理系統(tǒng)”。報告內(nèi)容至少應(yīng)包括：實驗 室名稱、患者姓名、性別、年齡、測定項目、檢測方法、檢測結(jié)果、參考范圍、 用藥建議及樣本號、樣本類型、檢測日期、實驗操作者、審核者、報告日期、實 驗室聯(lián)系方式等。否則視為無效或虛假報告單。6.2 失控結(jié)果的記錄與分析如發(fā)現(xiàn)質(zhì)控數(shù)據(jù)違背

52、了控制規(guī)則，操作員應(yīng)填寫失控記錄或失控報告單，上 交實驗室主管，由專業(yè)主管做出是否發(fā)出與失控質(zhì)控品同批患者樣本檢測報告的 決定。失控信號一旦出現(xiàn)就意味著與失控質(zhì)控品同批患者樣本報告可能作廢。 此 時，首先要盡量查明引起失控的原因， 如為假失控， 可由實驗室指定的資深人員 決定、簽字后發(fā)出報告。如為真失控，最好是糾正原因后，全部樣本重新檢測， 質(zhì)控品測定合格后再簽字發(fā)出。6.3 報告及解釋1）報告的編寫需要有嚴(yán)謹(jǐn)有效的流程，以確保檢驗信息的完整、有效、及時、 正確，并保護(hù)患者的隱私。 檢測結(jié)果以檢測報告單的形式發(fā)放， 需提供紙質(zhì)版檢 測報告，有條件的檢測實驗室可以電子版的形式發(fā)放報告， 并建立網(wǎng)

53、絡(luò)查詢系統(tǒng)， 送檢醫(yī)生通過登陸網(wǎng)站進(jìn)行檢測結(jié)果的查詢。2）檢驗報告單的應(yīng)具有患者基本信息、樣本情況（采集、送檢及檢測時間、樣 本性質(zhì)及狀態(tài)等）、檢測項目、檢測方法、結(jié)果、結(jié)果的意義、用藥建議、檢測可能的局限性、檢測單位聯(lián)系方式、檢測人員與報告審核人員簽字，審核者應(yīng)當(dāng) 是主管技師以上的工作人員、本專業(yè)實驗室負(fù)責(zé)人、中級及以上的病理醫(yī)師，審 核者對檢驗報告的質(zhì)量負(fù)責(zé)。3）結(jié)果解釋的責(zé)任屬于臨床實驗室，應(yīng)根據(jù)所檢測的人群解釋結(jié)果。臨床解釋的責(zé)任屬于臨床醫(yī)生，其應(yīng)根據(jù)檢測結(jié)果和臨床信息向患者解釋檢測結(jié)果。綜合臨床分子診斷的實驗數(shù)據(jù)和臨床信息，為醫(yī)師和患者描述此結(jié)果對疾病診斷的含義，為個體化用藥提出建議

54、。6.4記錄保留患者和樣本信息：接收樣本后，在“樣本接收記錄本”中記錄患者和樣本信息，對不符合檢測要求的樣本在“樣本拒收登記本”上記錄，并及時通知患者。樣本檢測申請單最后保存于擴(kuò)增區(qū)，至少1年以上；其它實驗記錄保存于各 自實驗操作區(qū)內(nèi)，至少保存1年以上。檢測過程實驗記錄保存于擴(kuò)增區(qū)的專 用文件柜內(nèi)，以備查找。擴(kuò)增過程中由熒光擴(kuò)增儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件必須保存在非 系統(tǒng)分區(qū)的專門文件夾中，定期做備份。6.5檢測后基因咨詢實驗室建立科學(xué)的、系統(tǒng)的檢驗結(jié)果解釋方案，提供結(jié)果的解釋意見。報告 單上提供咨詢服務(wù)的方式和途徑，如客戶服務(wù)專線，配置專業(yè)的咨詢服務(wù)人員； 方便臨床醫(yī)生和患者隨時反饋意見和提出咨詢。6

55、.6 樣本（及核酸）保留與處理腫瘤個體化治療基因檢測報告發(fā)出后的樣本應(yīng)盡可能較長期保存。 實驗室應(yīng) 制定樣本儲存制度對樣本進(jìn)行保存， 建立樣本儲存的規(guī)章制度， 做好樣本的標(biāo)識 并按規(guī)定存放，保存好樣本的原始標(biāo)碼，建立配套的樣本存放信息管理系統(tǒng)。樣本的處理和相關(guān)材料的處理要符合 醫(yī)療廢物管理條例 、醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu) 醫(yī)療廢物管理辦法及國家、地區(qū)的相關(guān)要求。6.7 檢測與臨床數(shù)據(jù)收集與分析 檢測結(jié)果收集、整理分析和數(shù)據(jù)的管理也是保障臨床基因檢測質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán) 節(jié)。臨床的檢測結(jié)果應(yīng)定期統(tǒng)計分析， 如基因突變的陽性率， 如果發(fā)現(xiàn)陽性率高 于資料報道值，應(yīng)引起重視，考慮是否存在假陽性情況，如果陽性率偏低，應(yīng)結(jié)

56、 合檢測方法的局限性考慮假陰性的可能，并進(jìn)行針對性的改進(jìn)。7. 腫瘤個體化治療檢測的質(zhì)量保證7.1 標(biāo)準(zhǔn)操作程序 原則上按照個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南的要求進(jìn)行。腫瘤個體化治 療的檢測SOP，應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備、樣本采集、樣本接收與預(yù)處理、核酸提取、 檢測方法、結(jié)果分析和報告、 儀器操作、實驗室安全措施等臨床檢驗的所有環(huán)節(jié)。 SOP 的編寫應(yīng)注意通俗易懂、注重細(xì)節(jié)、清晰明了、圖文并茂。實驗室工作人 員應(yīng)嚴(yán)格遵循 SOP 中的步驟要求進(jìn)行操作，應(yīng)每年定期根據(jù)實驗室的運(yùn)行狀況 進(jìn)行 SOP 審核修訂，對于文件的修訂、廢止、改版或更新，要按照規(guī)定的要求， 合理且規(guī)范進(jìn)行，并防止無效或作廢版本文件使用。7

57、.2 質(zhì)控品 檢測質(zhì)控品的建立是為了提高實驗室檢測結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性， 一般情 況下，針對發(fā)現(xiàn)罕見的基因突變、 實驗運(yùn)行異常、 新批次的試劑與上一批次試劑 的比對、儲存條件或反應(yīng)溫度發(fā)生改變后的樣本和試劑、 驗證整體測試可靠性的 樣本等，都應(yīng)合理設(shè)置質(zhì)控品。質(zhì)控品類型陽性對照：以含有目的片段的DNA（或質(zhì)粒）作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明PCR 試劑是否有效、 擴(kuò)增過程是否正確。 但陽性樣品擴(kuò)增效率高， 應(yīng)嚴(yán)格控制其濃度 和存放位置，避免其成為潛在的污染源。例如，檢測基因突變時，應(yīng)根據(jù)選用的 檢測方法，選擇該方法最低檢測限的陽性樣本。陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增， 用于證明擴(kuò)增 過程中無假陽性現(xiàn)象?？瞻讓φ眨阂约兯鳛槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。PCR 抑制物對照：在與陽性對照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測樣品DNA，如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在PCR抑制物。 空白提取對照：空白提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明 D