微生物限度檢查方法畢業(yè)論文

1、畢 業(yè) 論 文題目： 感冒清膠囊微生物限度檢查方法驗證 學(xué) 生： 蔡青佑 學(xué) 號：院 （系）： 繼續(xù)教育學(xué)院 專 業(yè)： 應(yīng)用生物及技術(shù) 指導(dǎo)教師： 余展旺 2015年 5 月 24日目 錄第一章 前 言1 1.1微生物限度標(biāo)準(zhǔn)在我國的發(fā)展2 1.2微生物限度檢查的主要內(nèi)容3 1.2.1定量檢查3 1.2.2控制菌的檢查3 1.3微生物限度檢查的方法5 1.4微生物限度檢查方法驗證的內(nèi)容6 第二章 感冒清膠囊微生物限度檢查方法驗證9 2.1儀器與試藥9 2.2方法與結(jié)果10 2.3方法驗證10 2.4結(jié) 論12第三章 結(jié) 論13 3.1建 議13參考文獻(xiàn)15致 謝：16

2、摘 要微生物限度檢查是藥物安全性研究的重要組成部分，由于中藥劑型成分復(fù)雜，其中任何藥材成分的抑菌作用都可能影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，因此通過驗證試驗來確定采用的微生物檢查方法的準(zhǔn)確性是十分有必要的。本課題以感冒清膠囊中成藥品種為研究對象，結(jié)合藥品處方和工藝的特點，闡述中成藥微生物限度檢查的四種方法(常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法和薄膜過濾法)中常規(guī)法的特點和操作步驟，同時對其適用性以及影響因素進(jìn)行考察。關(guān)鍵詞：微生物限度檢查；中成藥；常規(guī)法。15陜西科技大學(xué)畢業(yè)論文第一章 前 言藥品是一種關(guān)乎人類身體健康的特殊商品，一生中從不使用藥品的人是鳳毛麟角的。普羅大眾從生命孕育到牛命終結(jié)，都少不了

3、和藥品打交道，而且?guī)缀醵际怯糜谥尾∩踔潦蔷让?。因此，藥品質(zhì)量的重要性不言而喻。在藥品質(zhì)量控制的范疇里，除了確保其有效性以外，安全性的控制更應(yīng)具有特殊意義。否則，治病的藥品就會變成致病，甚至是致命的“毒藥”。藥品的安全性除了應(yīng)從處方和原料的篩選方面嚴(yán)格把關(guān)以外，防止污染的問題也是至關(guān)重要的，這其中也包括了微生物污染的問題，藥品染菌對使用者具有潛在的、不可預(yù)測的危害。事實上，由于藥品染菌引起使用者感染以至造成嚴(yán)重后果的事件屢有報道。20世紀(jì)60年代，瑞典從匈牙利、丹麥進(jìn)口了一批甲狀腺粉，由于污染了沙門菌，結(jié)果先后引起237人罹患沙門菌病。這方面還有更多的例證，例如由于滴眼劑污染銅綠假單胞菌，導(dǎo)致

4、病人發(fā)生角膜潰瘍的事例、因使用污染破傷風(fēng)梭菌的婦科用藥引發(fā)破傷風(fēng)癥而死亡的事例、2006年導(dǎo)致11人死亡的“欣氟”事件、2008年導(dǎo)致云南省6名患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，其中死亡3例的“刺五加注射液”事件等等，都是由于微生物污染藥品引起的。另外，藥品染菌還可引起產(chǎn)品的霉變、酸敗等理化性質(zhì)的改變，從而造成藥品失效、變質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重危害藥品使用者的健康1。因此，藥品的染菌程度檢查和安全性評價應(yīng)當(dāng)?shù)玫饺藗兊闹匾?，而藥品微生物檢驗就是藥品染菌程度和安全性評價的重要技術(shù)手段之一。中藥是我國人民廣泛使用的醫(yī)藥產(chǎn)品，并且已經(jīng)走出了國門。中藥在中醫(yī)臨床理論和實踐經(jīng)驗的指導(dǎo)下，在我國應(yīng)用了幾千年，對促進(jìn)中華

5、民族的繁衍和保證人民的健康作出了巨大貢獻(xiàn)。近年來隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，中藥確切的臨床療效和較低廉的價格越來越得到認(rèn)可，使用的人群越來越多，但伴隨而來中藥的安全性比以往則更需要引起重視。中藥安全性問題究其來源是多方面的，主要與中藥本身特性、應(yīng)用環(huán)境、辨證論治、種植和炮制的管理、患者體質(zhì)和藥品受污染程度等相關(guān)2。由于中藥在藥材種植、采集、炮制的過程中都有可能受到微生物的污染，因此在其質(zhì)量檢驗中山大學(xué)碩士學(xué)位論文中成藥中微生物限度檢查的方法學(xué)研究中，進(jìn)行有關(guān)微生物檢驗是保證其安全性的必要環(huán)節(jié)。微生物檢驗分為強制性的無菌檢查(要求不能檢出)和非強制性的限度標(biāo)準(zhǔn)檢查(允許有一定數(shù)量的菌，微生物限度)。

6、實踐中，在中成藥的使用上要求無菌的相對較少(即必須進(jìn)行無菌檢查的制劑所占比例不大)，大部分中成藥需要進(jìn)行的是微生物限度檢查。1.1微生物限度標(biāo)準(zhǔn)在我國的發(fā)展我國開展藥品微生物檢驗始于1972年，至今已有三十多年的歷史。微生物限度標(biāo)準(zhǔn)也已頒布實施了三十年。1978年國家衛(wèi)生部、化工部、商業(yè)部聯(lián)合頒發(fā)了我國第一個藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)13，該標(biāo)準(zhǔn)主要為中藥和化學(xué)藥，并按丸劑、片劑、散劑、沖劑及糖漿、合劑、水劑等劑型規(guī)定了微生物限度，包括細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)的不同規(guī)定。其中：口服藥品lg或lml不得檢出大腸埃希菌、沙門菌；外用藥品lg或lml不得檢出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌；口服藥品不得檢出活螨。上世紀(jì)70

7、年代中后期，國內(nèi)先后在武漢、宜昌等地因使用中藥散劑治療宮頸糜爛發(fā)生了多起事故，經(jīng)查證為藥物污染破傷風(fēng)梭菌所致。在調(diào)查研究并積累大量數(shù)據(jù)后，1980年版的藥品衛(wèi)生檢驗方法增補了破傷風(fēng)梭菌檢查法，并對用于深部組織、創(chuàng)傷、潰瘍及陰道的用藥開始檢查破傷風(fēng)梭菌。1986年衛(wèi)生部頒發(fā)了經(jīng)修改的藥品衛(wèi)牛標(biāo)準(zhǔn)，1989年又下達(dá)了藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)補充規(guī)定和說明。這兩個文件載有與國際上基本一致的微生物限度檢查法和20個化學(xué)藥品種的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，并收載于中國藥典1990年版4第二增補本。之后的中國藥典1995年版5收載了微生物限度檢查法，并對少數(shù)劑型收載了微生物限度，但大多數(shù)劑型仍未有微生物限度的規(guī)定。在中國藥典20

8、00年版6中重新對丸劑、片劑、散劑、膠囊劑以及以含發(fā)酵類藥材為原料的制劑修訂了微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。未列入標(biāo)準(zhǔn)的劑型，則根據(jù)用藥途徑，參照同類劑型的微生物限度作了補充，如滴耳劑、滴鼻劑等。2005年版的中國藥典7根據(jù)用藥途徑又修訂了藥品微生物修訂標(biāo)準(zhǔn)，同時新增訂了方法驗證以及含藥材原粉、豆豉和神曲等發(fā)酵成分制劑的限度標(biāo)準(zhǔn)，不僅要控制細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)，而且要控制大腸菌群數(shù)，使我國藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)與國際標(biāo)準(zhǔn)實現(xiàn)接軌。 由此可見，藥品的微生物檢查是隨著人們對藥品污染問題認(rèn)識的提高，在吸取了事故甚至是生命的教訓(xùn)后建立起來，并不斷補充完善的藥品質(zhì)量控制科目，而且必將繼續(xù)得到發(fā)展。1.2微生物限度檢查的主

9、要內(nèi)容微生物限度檢查主要包括染菌量的檢查和控制菌的檢查兩個方面：1.2.1定量檢查染菌量的檢查測定單位重量(g)、單位容積(m1)和單位面積(cm2)藥品中的細(xì)菌數(shù)及真菌數(shù)(霉菌和酵母菌數(shù))。1.2.1.1細(xì)菌數(shù)測定藥品細(xì)菌數(shù)測定是微生物的定量檢查，是用來判斷藥品被細(xì)菌污染程度和衛(wèi)生質(zhì)量評價的指標(biāo)，也是檢測中藥藥品質(zhì)量的指標(biāo)之一。細(xì)菌計數(shù)是指在一定條件下(如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH值、培養(yǎng)溫度和時間等)每lg、lml、10cm2供試品液經(jīng)培養(yǎng)后所生長的菌落數(shù)。按我國藥典規(guī)定，細(xì)菌計數(shù)是在需氧的條件下，溫度3035，一般培養(yǎng)48小時，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長的細(xì)菌菌落數(shù)。藥品細(xì)菌數(shù)測定是活菌計

10、數(shù)，最常用也是我國藥典收載的使用的方法是平板法。細(xì)菌計數(shù)以菌落數(shù)為單位，即cfu(colony forming units)。1.2.1.2霉菌和酵母菌數(shù)測定霉菌和酵母菌均屬于真菌。受到真菌污染的藥品不僅可能導(dǎo)致變質(zhì)，還可能因其產(chǎn)生的代謝物以及各種真菌毒素，使服用該藥品的患者產(chǎn)生急性或慢性的中毒病癥，有的真菌毒素甚至可導(dǎo)致或誘發(fā)癌癥8。霉菌及酵母菌測定的方法很多，最常用的是平板菌落計數(shù)法。我國藥典采用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行各種制劑的霉菌和酵母菌計數(shù)測定，當(dāng)制劑中含有蜂蜜和王漿時，需采用酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌計數(shù)測定。1.2.2控制菌的檢查測定單位重量(g)、單位容積(

11、m1)和單位面積(cm2)藥品中糞便污染的指示菌，如：大腸埃希菌、大腸菌群、沙門氏菌，以及某些特定菌(包括：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、活螨等)，在樣品中不得檢出或不超過某限度。中國藥典的控制菌包括以下幾種：1.2.2.1大腸埃希菌口服制劑、眼部給藥制劑、鼻及呼吸道給藥制劑以及直腸給藥制劑都需要控制大腸埃希菌，每lg或lml或10cm2均不得檢出。該菌常作為糞便污染的指示菌，它是腸桿科系各族細(xì)菌中從各種溫血動物的腸道檢出率最高的菌種。大腸埃希菌隨糞便排出體外，在土壤和水中如未被裂解可存活數(shù)天，在沃土表層則可存活更長時間，有可能污染水、食品、藥品等。因而檢查藥品、食品、飲水、環(huán)境水中有無

12、大腸埃希菌及數(shù)量多少，則可判斷樣品是否被糞便污染及受污染的程度。中國藥典采用MUGIndole法910進(jìn)行大腸埃希菌的檢查。1.2.2.2大腸菌群大腸菌群是指在37生長時能發(fā)酵乳糖，24小時內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性、氧化酶陰性、需氧或厭氧的無芽孢桿菌。它不僅包括埃希菌屬中的某些細(xì)菌，還包括腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬及克雷伯菌屬中的某些細(xì)菌11。中國藥典規(guī)定口服制劑中含藥材原粉的以及含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的都需檢查大腸菌群。大腸菌群不僅可指示大腸埃希菌等受外界環(huán)境影響較大的近期污染細(xì)菌是否存在，而且能反映如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌等受外界影響較小的遠(yuǎn)期污染細(xì)菌是否存在。我國藥典采用MPN(Most Pro

13、bable Number)測定法檢查大腸菌群。1.2.2.3沙門氏菌沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌。沙門氏菌可以在環(huán)境中長期生存，有的可以存活數(shù)年，可通過人、畜、禽的糞便或與帶菌者接觸，直接或間接地污染藥品原料、輔料等藥品生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，所以來源于動物的藥品受污染的機率較高。因此，藥典規(guī)定，含動物組織(包括提取物)及動物類原材料(蜂蜜、王漿、動物角及阿膠除外)的口服制劑每10g或10ml不得檢出沙門氏菌。1.2.2.4金黃色葡萄球菌葡萄球菌是最常見的化膿性球菌，80的化膿性感染由它引起。廣泛分布于自然界，也存在于人和動物皮膚及與外相通的腔道中。葡萄球菌大部分是不致病的，但是人群中有20&quo

14、t;-'50的人可攜帶致病性葡萄球菌。12如金黃色葡萄球菌，可引起多種嚴(yán)重感染，通常作為革蘭氏陽性菌的代表。葡萄球菌屬是無芽孢細(xì)菌中抵抗力最強的細(xì)菌，耐干燥，對多種消毒劑不敏感。中國藥典規(guī)定局部給藥制劑，包括表皮或黏膜給藥，耳、鼻及呼吸道吸入給藥，陰道、尿道給藥制劑都需檢查金黃色葡萄球菌。1.2.2.5銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌為假單胞菌屬的模式菌，習(xí)慣稱為綠膿桿菌。本菌廣泛分布于自然界中，對人和動物植物均可造成危害。12目前，因為其污染藥品引起藥源性疾病和醫(yī)療事故的例子時有發(fā)生，所以加強對該菌的控制是必要的。與金黃色葡萄球菌相似，中國藥典規(guī)定局部給藥制劑都需控制該菌。本菌除在硝酸鹽培養(yǎng)

15、基以外都是專性好氧。1.2.2.6梭菌梭菌屬是在自然界分布廣泛的一類微生物，主要存在于土壤、海水和淡水的沉積物中。人和家畜及昆蟲的腸道內(nèi)亦存在該類微生物，可隨糞便排泄，污染土壤和水源。本菌多數(shù)為腐物寄生菌，對環(huán)境的抵抗力極強13。其芽孢體可耐高溫及干燥，有些菌的芽孢體可在土壤中存活數(shù)十年。本菌為革蘭氏染色陽性菌，大多數(shù)為專性厭氧。所以，培養(yǎng)時應(yīng)注意嚴(yán)格控制環(huán)境中的含氧量。中國藥典對用于陰道和尿道的制劑進(jìn)行梭菌檢查時，采用生孢梭菌作為陽性對照菌。1.3微生物限度檢查的方法微生物限度檢查方法按其研究內(nèi)容的不同，方法也不盡相同。細(xì)菌數(shù)的檢查方法有多種，如平皿法、薄膜過濾法、涂抹法、MPN法。由于藥品

16、細(xì)菌數(shù)測定是活菌計數(shù)，所以最常用的是平皿法。霉菌和酵母菌計數(shù)也采取相同的檢查方法?？刂凭鷦t根據(jù)所需檢查菌種的不同而采取不同的檢查方法。然而無論具體的操作步驟有什么不同，對于含抑菌成分的原料或制劑，最先需要處理的是消除其抑菌作用。這是由于藥品本身可能含有抑菌作用的組成及防腐劑等組分，一般認(rèn)為，這些組分在一定濃度下對微生物具有抑制或殺滅的作用，被抑制的微生物將因受到不同程度的損傷而可能影響檢查的準(zhǔn)確性14。但在適合的pH、營養(yǎng)充足等合適的條件下，微生物可能復(fù)蘇，從而危害人體健康。微生物檢測時，首先要進(jìn)行供試品溶液的制備。不同特性的供試品溶液，應(yīng)采取不同的制備方法。如水溶性供試品可直接加入稀釋劑；不

17、溶于水的固體制劑采用勻漿或加混懸劑制成均勻的混懸液；非水溶性油劑或軟膏劑加入乳化劑使之成為均勻分散的乳濁液；有抑菌成分的供試品加入消除抑菌成分的中和劑，以及采用離心沉淀和薄膜過濾等消除抑菌成分的方法等。中國藥典2010年版規(guī)定，細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)除另有規(guī)定外均采用平板菌落計數(shù)法(平皿法)。該方法測定結(jié)果只反映在規(guī)定的條件下所生長的細(xì)菌(嗜中溫、需氧和兼性厭氧)、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)，不包括對營養(yǎng)、氧氣、溫度、pH值和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。平板菌落計數(shù)法是活菌計數(shù)的方法之一，也是目前國內(nèi)外微生物限度檢查中最常用的方法。它是用一定培養(yǎng)基在規(guī)定條件下培養(yǎng)后在固體平板上呈現(xiàn)可見菌

18、落，按規(guī)定方法計數(shù)報告的方法。其原理主要為：將待測供試品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微牛物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液至平皿中，再加入一定量的培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原供試品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出供試品中的含菌數(shù)。但是，由于待測供試品往往不易全分散成單個細(xì)胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自供試品中的23或更多個細(xì)胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用茵落形成單位(cfu)，而不以絕對菌落數(shù)來表示供試品的活菌含量。由于供試品本身的性質(zhì)、所采用的輔料、

19、賦形劑以及劑型的不同，所使用的微生物限度檢查法也不盡相同。例如：某些藥品供試品本身具有抑菌活性的成分、酊劑中有所含乙醇、合劑中所含的防腐劑山梨醇甲脂等，若使用簡單的常規(guī)法，很可能會出現(xiàn)假陰性的情況，這對于藥物安全性的控制是不利的。針對本論文藥品采用常規(guī)法，現(xiàn)對常規(guī)法介紹如下：常規(guī)法是微生物限度檢查中最重要也是最基本的方法。它主要的特征是將制各好的供試品溶液lml加入培養(yǎng)皿后，直接加入相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。1.4微生物限度檢查方法驗證的內(nèi)容微生物的生長受許多因素的影響，特別是藥品污染中的微生物尤為如此。所以，藥品中微生物檢驗時，只有在各檢測條件均適宜，即在該檢驗條件下的樣品濃度不足以抑制污染微生物

20、的生長，使供試品中污染的微生物狀況得以真實的反映，從而才能保證檢驗結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。而為了保證檢驗結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，微牛物限度檢查法需要經(jīng)過驗證。藥品中微生物的檢驗主要有三大類型：包括無菌試驗、菌落計數(shù)和控制菌的檢查。其中，菌落計數(shù)和控制菌檢查屬于微生物限度檢查的內(nèi)容。菌落計數(shù)方法的驗證通過驗證個菌株的回收率來確認(rèn)，而控制菌的檢查則通過陽性對照和陰性對照的生長情況來確定。在菌落計數(shù)方法學(xué)驗證中，選取大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC(B)441 02、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003、枯草芽孢桿菌(Bacillus

21、 subtilis)CMCC(B)63 501、白色念珠菌(Candida albicans，CMCC(F)98001、黑曲霉(Aspergillus niger，CMCC(F)98 003五種菌作為驗證菌株。其中金黃色葡萄球菌代表革蘭氏陽性菌，大腸埃希菌代表革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌代表芽孢菌，白色念珠菌代表酵母菌，黑曲霉代表霉菌。1.4.1大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC(B)44 1 02前面控制菌檢查中已經(jīng)提及，所以不再贅述。大腸埃希菌通常作為革蘭氏陰性菌的代表。1.4.2金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003前面控制

22、菌檢查中亦已經(jīng)提及，所以也不再贅述。金黃色葡萄球菌通常作為革蘭氏陽性菌的代表。1.4.3枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63 50 1枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，因易在枯草浸汁中繁殖而得名。該菌在孢子狀態(tài)下穩(wěn)定性好，能耐氧化、耐擠壓、耐高溫(能長期耐600C高溫，在1200C溫度下能存活20分鐘)和耐酸堿，在酸性胃環(huán)境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，在適當(dāng)?shù)臈l件下能快速繁殖?？莶菅挎邨U菌通常作為芽孢菌的代表.1.4.4黑曲霉(Aspergillus niger，CMCC(F)98 003黑曲霉屬半知菌亞門真菌。菌落初白色

23、，后變黑。分生孢子頭褐黑色呈放射狀；分生孢子梗長短不一，頂囊球形，雙層小梗；分生孢子褐色球形。生長適溫37，最低相對濕度為88，能引致水分較高的糧食霉變。1.4.5白色念珠菌(Candida albicans，CMCC(F)98 00 1白色念珠菌通常存在于正常人的口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機體中數(shù)量較少，不容易引起疾病。當(dāng)機體免疫功能或一般防御力下降，正常菌群相互制約作用失調(diào)時，則本菌大量繁殖并改變生長形式(芽生菌絲相)，可侵入細(xì)胞引起疾病。本菌細(xì)胞呈卵圓形，很象酵母菌，比葡萄球菌大56倍，革蘭氏染色陽性，但著色不均勻。第二章中感冒清膠囊微生物限度檢查方法驗證常規(guī)法最主要的特征是

24、將制備好的供試品溶液lml加入培養(yǎng)皿后，直接加入相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。該法操作簡單，是藥品檢驗的常用方法之一。常規(guī)法適用于不含抑菌成分的藥材及制劑。常規(guī)法不需要特殊的儀器，是微牛物限度檢查最簡單便捷的方法。182.1儀器與試藥2.1.1培養(yǎng)基與試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：3103443）、瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：3101627）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：3102516）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：3101005）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號：3101022）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號：201309171）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號：3104061）、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(批號：201307071）、70氯化鈉

25、蛋白胨緩沖液(批號：3101597）、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（批號：3102141）、4甲基傘形酮葡糖甘酸培養(yǎng)基（批號：3101426）以上品種均購自廣州微生物環(huán)凱科技公司。9氯化鈉(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號:20130302）溶液，2.1.2菌種金黃色葡萄球菌CmCC(B)26003、大腸埃希菌CMCC(B)44102、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094、白色念珠菌CMCC(F)10123；均購自中國藥品生物制品檢定所；黑曲霉(ATCCl6404)購自于廣東省微生物研究所。2.1.3儀器電動勻漿儀(浙江省椒江五星儀器有限公司，YJA型)

26、，霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，BPWJ250F），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DNG9246A），電熱恒溫水槽（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SSW6002S），振蕩培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司，ZDP-250），高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫(yī)療器械日本制造，MLS3781LPC），精密電子天平（美國雙杰兄弟集團(tuán)有限公司常熟雙杰儀器廠，JJ600Y）2.1.4供試品感冒清膠囊（江西南昌制藥有限公司，規(guī)格：每粒0.5g（含對乙酰氨基酚24mg）,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：國家藥品標(biāo)準(zhǔn)批件2002ZFB0245，有效期：36個月，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z36020287，批號：121230、131202、1411

27、27）2.2方法與結(jié)果2.2.1菌懸液的制備取第2代菌株，用09無菌氯化鈉溶液稀釋成50100Cfu/ml的菌懸液。2.2.2供試品溶液的制備感冒清膠囊：稱取供試品10g，加無菌pH70氯化鈉蛋白胨緩沖溶液至100ml，45水浴溫?zé)嶂寥咳芙?，制成l：lO均勻的供試液。2.3方法驗證2.3.1細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)法回收率的測定試驗組 取供試品溶液lml和菌懸液lml注入1個滅菌平皿中，迅速倒入1520 ml 45左右的相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰酪大豆胨瓊脂，霉菌及酵母菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基)，每個菌株平行做2個平皿，待凝。在相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)(細(xì)菌在3035培養(yǎng)48小時，霉菌在2328培養(yǎng)72小

28、時)，點計菌落數(shù)，取均值。5個菌株分別操作分別計數(shù)。菌液組 測定加入的試驗菌數(shù)供試品對照組 按試驗組的方法，不加菌液，測定供試品菌數(shù)(本底菌)?；厥章?)=(試驗組菌數(shù)供試品對照組菌數(shù))菌液組菌數(shù)×100大于70結(jié)果果見表2-1表21 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)回收率()品名批號金黃色葡萄球菌大腸埃希氏菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉感冒清膠囊12123085.293.182.297.290.613120287.794.681.197.896.614112784.095.584.499.392.72.3.2控制菌檢查的方法驗證本次驗證的均為口服制劑，需進(jìn)行大腸埃希菌的檢查。另外，感冒清膠囊

29、因其含原藥材投料，所以還需進(jìn)行大腸菌群的檢查。方法驗證如下：試驗組試 取供試品溶液lOml(大腸菌群取lml)及l(fā)ml大腸埃希菌菌懸液lml，加入相應(yīng)規(guī)定量的增菌培養(yǎng)基(檢查大腸埃希菌用膽鹽乳糖培養(yǎng)基，大腸菌群用膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中)，按藥典方法檢查。陽性對照 取大腸埃希菌菌懸液lml，加入相應(yīng)規(guī)定量的增菌培養(yǎng)基(檢查大腸埃希菌用膽鹽乳糖培養(yǎng)基，大腸菌群用膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中)，按藥典方法檢查。陰性對照 取生理鹽水10ml，加入相應(yīng)規(guī)定量的增菌培養(yǎng)基(檢查大腸埃希菌用膽鹽乳糖培養(yǎng)基，大腸菌群用膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中)，按藥典方法檢查。果見表2-2表2-2大腸埃希菌驗證結(jié)果品種批號膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)

30、基實驗組膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基陽性對照組膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基陰性對照組MUG試驗實驗組MUG試驗陽性對照MUG試驗陰性對照UV檢測靛基質(zhì)試驗UV檢測靛基質(zhì)試驗UV檢測靛基質(zhì)試驗感冒清膠囊121230+131202+141127+ (表中+，表示在培養(yǎng)基中呈附性反應(yīng)或在試劑中呈正反應(yīng)；“-表示不呈陽性反應(yīng)或在試劑中不呈正反應(yīng)；士表示在未能通過觀察判斷結(jié)果)表22表明，各控制菌陽性對照均能生長，陰性對照無菌生長，試驗組均能生長，可用常規(guī)法檢查大腸埃希菌。另外，在感冒清膠囊的大腸菌群檢查中，陽性對照管生長良好，陰性無干擾，試驗組均能生長。2.4結(jié)論感冒清膠囊細(xì)菌、霉菌及酵母菌、控制菌可采用常規(guī)法做微生物限

31、度檢查。第三章 結(jié) 論本試驗采用口服中成藥的常見劑型膠囊制劑感冒清膠囊做微生物限度檢查方法驗證，感冒清膠囊中穿心蓮15都具有抑制細(xì)菌生長的作用。但其含量相對于整個制劑(包括輔料)來說是比較低的。由感冒清膠囊中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌這些革蘭氏陽性菌的回收率中可以發(fā)現(xiàn)，回收率比其他幾個菌株都低，說明穿心蓮有一定抑菌效果。經(jīng)實驗證明其抑菌作用小，所以可采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。驗證菌株黑曲霉屬于半知菌亞門曲霉菌屬。由菌絲和孢子組成，許多菌絲交織在一起成為菌絲體。其中菌絲可吸收營養(yǎng)物質(zhì)，孢子為其主要繁殖器官。某些菌絲在生長發(fā)育到一定階段后產(chǎn)生孢子12。在制備驗證用黑曲霉菌懸液前，首先需要從固

32、體培養(yǎng)基上將菌苔洗下，制成儲備液，然后再稀釋。儲備液的制備，應(yīng)注意質(zhì)量較輕的菌絲的影響。并且，試驗應(yīng)在生物安全柜里完成，以防止試驗菌對人體造成傷害。3.1建議：3.1.1了解藥品的處方組成是微生物限度檢查的前提。在進(jìn)行微生物限度檢查驗證之前，了解處方組成及簡要的工藝流程是十分重要的。因為通過藥品的處方和工藝流程可以幫助我們了解制劑中是否含有抑菌作用的藥材或添加物，然后通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄈコ驕p少其抑菌影響，提高檢查的準(zhǔn)確度。據(jù)文獻(xiàn)報道。16雙香豆素類、醌類、葸醌類、黃酮類、揮發(fā)油、生物堿等物質(zhì)對細(xì)菌都有一定的抑制作用。三萜及其皂苷具有抗真菌活性。Manik等人17研究了49種五環(huán)三萜類化合物的抗真

33、菌活性，研究表明C27或28位有游離羧酸的齊敦果酸和長春藤皂苷元的皂苷具有較強的抗真菌活性。Favel H鰳對某些來源于植物的三萜皂苷進(jìn)行致病抗真菌、酵母和皮膚真菌活性進(jìn)行了研究，以兩性霉素B和酮康唑為對照，研究結(jié)果也顯示常春藤皂苷活性最強。具有上述這些結(jié)構(gòu)的中藥材很多，中成藥中含有的連翹、大黃、黃芩、冰片、天花粉、知母、丹參、甘草等。所以，當(dāng)制劑中含有這些成分時，就要考慮是否要采取相應(yīng)的措施進(jìn)行應(yīng)對。3.1.2預(yù)試驗時，可先驗證金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在具有抑菌作用的中成藥中，多數(shù)制劑對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌敏感，尤其是枯草芽孢桿菌。所以在做樣品預(yù)試驗的時候，可先選用這兩種菌進(jìn)行驗證。3.1.3細(xì)菌計數(shù)回收率試驗大腸埃希菌的驗證結(jié)果可為控制菌大腸埃希菌的檢查提供參考。細(xì)菌計數(shù)大腸埃希菌采用常規(guī)法回收率能達(dá)到要求的，控制菌都可以采用常規(guī)法檢查。3.1.4可根據(jù)劑型的特點選擇合適的檢查方法。對于口服制劑來說，大多數(shù)中成藥的抑菌作用是有限的，一般可采