NGS實(shí)驗(yàn)室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)與要求｜喜格

1、NGS 實(shí)驗(yàn)室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)與要求一、高通量測(cè)序( NGS)實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介1.1 NGS實(shí)驗(yàn)室又叫高通量測(cè)序檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。 NGS是下一代測(cè)序技術(shù) (NEXTGENERATION SEQUENCING)即高通量測(cè)序技術(shù)的簡(jiǎn)稱(chēng)。 高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì) 傳統(tǒng) SANGER測(cè)序(稱(chēng)為一代測(cè)序技術(shù)) 革命性的改變 , 可同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn) 到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定， 同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的 轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能 , 也稱(chēng)為深度測(cè)序 (DEEP SEQUENCING)。1.2 由于 NGS 技術(shù)對(duì)所檢測(cè)的核酸模板進(jìn)行大量擴(kuò)增， 容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染 導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性下降；另外 NGS 技術(shù)

2、要求高、影響因素多，實(shí)驗(yàn) 過(guò)程處理不當(dāng)易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性下降或檢測(cè)失敗。 因此臨床基因擴(kuò) 增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收和規(guī)化管理是 NGS 技術(shù)本身需要，也是在臨床 上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。二、NGS 實(shí)驗(yàn)室臨床應(yīng)用的基本條件2.1 必須擁有符合臨檢中心相關(guān)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn) NGS 實(shí)驗(yàn)室。2.2 檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn) NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求： 高通量測(cè)序儀及配套服務(wù) 器；高通量測(cè)序檢測(cè)試劑盒；通用電腦；自動(dòng)分析軟件，實(shí)驗(yàn)室樣本信 息管理系統(tǒng)等。2.3 檢測(cè)人員必須通過(guò)專(zhuān)門(mén)的技能培訓(xùn)，并獲得省級(jí)以上衛(wèi)生計(jì)生行政部門(mén) 頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)上崗證書(shū)。 NGS 實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí) 頁(yè)腳驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)

3、準(zhǔn)化操作程序（ SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合衛(wèi)生部的要求，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、確保 實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。2.4 NGS 臨床應(yīng)用必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作。三、NGS 實(shí)驗(yàn)室建設(shè)基本要求3.1 主體結(jié)構(gòu)主體為彩鋼板、鋁合金型材。室所有陰角、陽(yáng)角均采用鋁合金50 圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡(jiǎn)明，美觀大 方，密封性好。3.2 標(biāo)準(zhǔn)的各區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)將檢測(cè)過(guò)程分成試劑準(zhǔn)備、樣本制備、 PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序四個(gè)獨(dú)立的實(shí) 驗(yàn)區(qū)。整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)， 同 時(shí)各區(qū)通過(guò)氣壓調(diào)節(jié)， 使整個(gè)

4、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染 并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_(kāi)緩沖區(qū)和 PCR 擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇 門(mén)上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室換氣。3.3 消毒 在每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)和緩沖區(qū)頂部以及傳送窗部安裝有紫外燈，供消毒用。在各區(qū)還設(shè)置移動(dòng)紫外線燈，對(duì)實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒3.4 機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗 試劑和標(biāo)本通過(guò)機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞， 保證試劑和標(biāo)本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。3.5 地面地面建議使用 PVC 卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐 腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面， 或大塊的瓷

5、磚（至少 800MM ×800MM ） 接縫需要小于 2MM 。3.6 照明燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。3.7 平面布局NGS 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的檢驗(yàn)項(xiàng)目、 所采用的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)和工作量來(lái)決定 分區(qū)的多少及各區(qū)域的空間大小，至少具體需要多少個(gè)區(qū)，同樣是“個(gè)體化” 的，以“工作有序、互不干擾、防止污染、報(bào)告及時(shí)”作為基本原則。四、各項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測(cè)序技術(shù)）1. 實(shí)驗(yàn)室平面圖頁(yè)腳頁(yè)腳2. 技術(shù)流程圖圖 1 ：產(chǎn)前篩查與診斷實(shí)驗(yàn)室平面圖圖 2 ：產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)流程圖3. 技術(shù)參數(shù)分區(qū)壓力溫度相對(duì)濕度照明專(zhuān)用走廊0Pa20-25

6、 40%60%主實(shí)驗(yàn)室 300LX，其緩沖區(qū)+5Pa余房間 200 300LX試劑準(zhǔn)備室+15Pa標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)+10Pa文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)-5Pa測(cè)序區(qū)-10Pa4. 分區(qū)功能4.1 試劑準(zhǔn)備室主要功能：在 NGS 過(guò)程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。4.2 標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)主要功能：血液處理、血漿制備、 DNA 提取、 DNA 片段化、 DNA 樣品的純 化、 DNA 濃度檢測(cè)、末端修復(fù)、接頭連接、構(gòu)建樣本的測(cè)序文庫(kù)。4.3 文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)主要功能：文庫(kù)構(gòu)建后的 PCR擴(kuò)增與純化、文庫(kù)濃度檢測(cè)、 文庫(kù)的混合及混 合后的質(zhì)檢分析。4.4 測(cè)序區(qū)主要功能：測(cè)序模板制備（乳液 PCR與磁珠富

7、集回收）、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、報(bào)告審核及發(fā)放5. 儀器配置5.1 試劑準(zhǔn)備室主要儀器設(shè)備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、 移液器、可移動(dòng)紫外燈和超凈工作臺(tái)等。5.2 標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū) 主要儀器設(shè)備：冷凍離心機(jī)、微量臺(tái)式離心機(jī)、掌上三管離心機(jī)、渦旋震蕩 器、垂直混合儀、移液器、可移動(dòng)紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤(pán)天平、 Qubit 2.0 核酸定量?jī)x、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)） 、條形碼打印機(jī)、普通打印機(jī)、 掃描槍、磁力架等。5.3 文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)主要儀器設(shè)備： PCR儀、QPCR儀、 Qubit2.0 核酸定量?jī)x、可移動(dòng)紫外燈、 超凈工作臺(tái)、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、

8、 UPS、冰箱、移液器、 磁力架等。5.4 測(cè)序區(qū)主要儀器設(shè)備：高通量測(cè)序儀、 PC 電腦、打印機(jī)、 UPS、恒溫金屬浴、純水 儀、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺(tái)、可移動(dòng)紫 外燈、磁力架、 PCR儀等。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（全基因組低拷貝測(cè)序）1.實(shí)驗(yàn)室平面圖圖 3：PGD 實(shí)驗(yàn)室平面圖2. 技術(shù)流程圖圖 4：PGD 技術(shù)流程圖3. 技術(shù)參數(shù)分區(qū)壓力溫度相對(duì)濕度照明專(zhuān)用走廊0Pa20-25 40%60%主實(shí)驗(yàn)室 300LX，其余房間 200300LX緩沖區(qū)+5Pa試劑準(zhǔn)備室+15PaWGA 制備室+10pa擴(kuò)增一區(qū)-5pa標(biāo)本檢測(cè)區(qū)-10Pa測(cè)序區(qū)-15Pa電泳區(qū)0Pa4

9、. 分區(qū)功能4.1 試劑準(zhǔn)備室主要功能：在 NGS 過(guò)程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。4.2 WGA 制備區(qū)主要功能：基因組 DNA 釋放、全基因組 DNA 擴(kuò)增。4.3 電泳區(qū)主要功能： DNA 電泳檢測(cè)及結(jié)果反饋、 DNA 打斷等4.4 擴(kuò)增一區(qū)主要功能： DNA 片段的末端修復(fù)與純化、接頭連接與純化、文庫(kù)混合、缺口平移4.5 文庫(kù)檢測(cè)區(qū)主要功能：文庫(kù)濃度質(zhì)檢分析。4.6 測(cè)序區(qū)主要功能：測(cè)序模板制備（乳液 PCR與磁珠富集回收）、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分 析、報(bào)告審核及發(fā)放。5. 儀器配置5.1 試劑準(zhǔn)備區(qū)主要儀器設(shè)備：冰箱、分析天平、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、 可移動(dòng)紫外燈和超凈

10、工作臺(tái)等。5.2 電泳區(qū)主要儀器設(shè)備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振 蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈等。5.3 WGA 制備區(qū)主要儀器設(shè)備： PCR儀、超凈工作臺(tái)、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移 液器、可移動(dòng)紫外燈等。5.4 擴(kuò)增一區(qū)主要儀器設(shè)備：PCR儀、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作臺(tái)、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、 UPS、移液器、磁力架等。5.5 文庫(kù)檢測(cè)區(qū)主要儀器設(shè)備： QPCR儀、Qubit2.0 核酸定量?jī)x、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作 臺(tái)、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、冰箱、移液器等。5.6 測(cè)序區(qū)主要儀器設(shè)備：高通量測(cè)序儀、 PC 電腦、打印機(jī)、 UPS、恒溫金

11、屬浴、純水 儀、冰箱、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺(tái)、可移動(dòng)紫 外燈、磁力架、 PCR儀等。遺傳病診斷 + 腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測(cè)序技術(shù) +SANGER測(cè)序驗(yàn)證）1. 實(shí)驗(yàn)室平面圖圖 5 ：腫瘤診斷實(shí)驗(yàn)室平面圖2. 技術(shù)流程圖圖 6 ：腫瘤診斷技術(shù)流程圖頁(yè)腳圖 7 ：一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程圖3. 技術(shù)參數(shù)分區(qū)壓力溫度相對(duì)濕度照明潔凈走廊0Pa20-25 40%60%主實(shí)驗(yàn)室 300LX，其余房 間 200 300LX緩沖區(qū)+5Pa試劑準(zhǔn)備室+15Pa標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)+10PaDNA 打斷區(qū)+10Pa雜交捕獲區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）-5Pa文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（擴(kuò)增二區(qū)）-10Pa文庫(kù)檢測(cè)區(qū)-10Pa

12、測(cè)序區(qū)-15Pa電泳區(qū)0 Pa4. 分區(qū)功能4.1 試劑準(zhǔn)備區(qū)主要功能：在 NGS 過(guò)程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。4.2 標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)主要功能：樣本接收、樣本前處理、全基因組 DNA 提取以及各種樣本 DNA 或者 RNA的提取、 DNA 片段化、 DNA 純化、 DNA 濃度測(cè)定、 DNA 片段的 末端修復(fù)與純化、接頭連接與純化。4.3 DNA 打斷區(qū)主要功能： DNA 打斷（片段化）。4.4 電泳區(qū)主要功能： 片段化 DNA 電泳檢測(cè)及結(jié)果反饋。4.5 雜交捕獲區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）主要功能：目的 DNA 片段的雜交捕獲與純化， Sanger 測(cè)序目的片段擴(kuò)增與 純化、 Sanger

13、測(cè)序 PCR前準(zhǔn)備。4.6 文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（擴(kuò)增二區(qū)）主要功能：雜交捕獲后擴(kuò)增與純化、文庫(kù)濃度質(zhì)檢分析、及 Sanger 測(cè)序的PCR擴(kuò)增反應(yīng)與純化。4.7 測(cè)序區(qū)主要功能：測(cè)序模板制備（乳液 PCR與磁珠富集回收） 、上機(jī)測(cè)序、及 Sanger 測(cè)序。5. 儀器配置5.1 試劑準(zhǔn)備區(qū)主要儀器設(shè)備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺(tái)式離心機(jī)、渦旋振蕩器、 移液器、可移動(dòng)紫外燈和超凈工作臺(tái)等。5.2 標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)主要儀器設(shè)備：微量臺(tái)式離心機(jī)、掌上三管離心機(jī)、恒溫金屬浴、移液器、 可移動(dòng)紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤(pán)天平、 Qubit 2.0 核酸定量?jī)x、 PCR 儀、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)）、條形碼打印機(jī)、普通打印機(jī)、掃描槍等。5.3 DNA 打斷區(qū)主要儀器設(shè)備： Covaris S220 超聲波打斷儀、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振蕩 器、移液器、可移動(dòng)紫外燈等。5.4 電泳區(qū)主要儀器設(shè)備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機(jī)、渦旋振 蕩器、移液器、可移動(dòng)紫外燈等。5.5 雜交捕獲區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）主要儀器設(shè)備：PCR儀、可移動(dòng)紫外燈、超凈工作臺(tái)、冰箱、