幾種超分辨率顯微術原理及對比

1、各廠家超分辨技術1、萊卡公司采用的超分辨技術STED2000年，德國科學家 StefanHell開發(fā)了另一種超高分辨率顯微技術， 其基本原理是通過物理過程來減少激發(fā)光的光斑大小，從而直接減少點擴散函數的半高寬來提高分辨率.當特定的熒光分子被比激發(fā)波長長的激光照射時，可以被強行猝滅回到基準態(tài).利用這個特性，Hell等開發(fā)出了受激發(fā)射損耗顯微技術(stimulatedemissiondepletion,STED).其基本的實現過程如圖2 所示，就是用一束激發(fā)光使熒光物質(既可以是化學合成的染料也可以是熒 光蛋白)發(fā)光的同時，用另外的高能量脈沖激光器發(fā)射一束緊挨著的、 環(huán)型的、波長較長的激光將第一束

2、光斑中大部分的熒光物質通過受激 發(fā)射損耗過程猝滅，從而減少熒光光點的衍射面積，顯著地提高了顯微鏡的分辨率，原理見下圖。漱發(fā)光光斑受澈岌射隕耗泄光光斑STED成像技術的最大優(yōu)點是可以快速地觀察活細胞內實時變化的過 程，因此在生命科學中應用更加廣泛2、蔡司公司采用的超分辨技術PLAM2002年，Patterson禾口 Lippincott Schwartz首次利用一種綠色熒光蛋白 (GFP的變種(PAGFP來觀察特定蛋白質在細胞內的運動軌跡.這種熒 光蛋白PAGFP在未激活之前不發(fā)光，用405nm的激光激活一段時間后才可以觀察到488nm激光激發(fā)出來的綠色熒光.德國科學家EricBetzig敏銳地

3、認識到，應用單分子熒光成像的定位精度，結合這 種熒光蛋白的發(fā)光特性，可以來突破光學分辨率的極限.2006年9月，Betzig和Lippincott Schwartz等首次在 Scienee上提出了光激活定 位顯微技術(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念.其基 本原理是用 PA GFP來標記蛋白質，通過調節(jié)405nm激光器的能量，低能量照射細胞表面， 一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子， 然后用488nm激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分 子.在確定這些分子的位置后，再長時間使用488nm激光照射來漂白這些已經定位正確的熒光

4、分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來.之后，分別用 405nm和488nm激光來激活和漂白其他的熒 光分子，進入下一次循環(huán).這個循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細胞 內所有熒光分子的精確定位.將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了一種比傳統(tǒng)光學顯微鏡至少高10倍以上分辨率的顯微技術，原理如下：PLAM通過定位細微結構乃至單分子，實現 20 nm的橫向分辨率和50 nm軸向分辨率。大鼠少突膠質細胞線粒體3、尼康公司采用的超分辨技術STROM和SIMSTROM:2006年底，美國霍華德休斯研究所的華裔科學家莊曉薇實驗組開發(fā) 出來一種類似于 PALM的方法，可以用來研究細胞內源蛋白的超分辨 率

5、定位.他們發(fā)現，不同的波長可以控制化學熒光分子Cy5在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色561 nm的激光可以激活 Cy5發(fā)射熒光，同時長時間照射可以將 Cy5分子轉換成暗態(tài)不發(fā)光.之后，用綠 色的488nm激光照射Cy5分子時，可以將其從暗態(tài)轉換成熒光態(tài)， 而此過程的長短依賴于第二個熒光分子Cy3與Cy5之間的距離.因此，當Cy3和Cy5交聯成分子對時，具備了特定的激發(fā)光轉換熒光分子發(fā) 射波長的特性.將Cy3和Cy5分子對膠聯到特異的蛋白質抗體上，就可以用抗體來標記細胞的內源蛋白.應用特定波長的激光來激活探針，然后應用另一個波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過程循環(huán)上百次后就可以得

6、到最后的內源蛋白的高分辨率影像，被他們命名為隨機光學重構顯微技術(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM) . 2007 年，他們進一步改進STORM技術，發(fā)展了不同顏色的變色熒光分子對，可以同時記錄兩種甚至多種蛋白質的空間相對定位，從而闡明籠形蛋白clathrin形成的內吞小泡與細胞骨架蛋白之間的精確空間位置關系,兩種顏色的分辨率都可以達到2030nm,原理如下圖：5RP1 IrctivatK allSTEP 2 AlexaM?已 randomby irradiating CyZ lointensrty tightSTEP 3 Exci

7、te Alexa&47 with strong light and capture imjgM of localizabpnRepeatSTORM通過一對染料對通過隨機發(fā)光空間定位，實現了XY20nm分辨率SIM:改變光學的點擴散函數來突破光學極限的另一個方法是利用飽和結構照明顯微技術(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM).早在1963年，Lukosz和Marchand就提出了特定模式側向入射的光線可以 用來增強顯微鏡分辨率的理論2005年，加州大學舊金山分校的Gustafsson博士首先將非線性結構性光學照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微

8、 鏡上，得到了分辨率達到 50nm的圖像.SSIM技術的原理是將多重相 互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分 辨率的信息如圖所示F壇-3 L$a.ng mdarof light diffrftaon 粉th電 bptkaJ用3通過衍射的聲阿干涉效陋燉傍提藝井濟聿當一嚇未揶結構的物協(xié)何磧一牛結糊W則的聘射櫃式舊的光斷孵嗣川 合產生云紋來紋訶血陰©一云址棗紋規(guī)生在來徉物除的空間 頻皐與粥財光絨的空間呉韋肓差異的地方.顯而爲見在顯誡備下旨捋艱聽，敕可収暑到它啟大了原先不配場井蒂固來的祥車紙枸.通過 計韋機避一步分折斯芮殺奴中包含的僮寶可吐匾組出樣京的育分鏘至因慘心SIM通過結構照明莫爾紋原理實現了任何熒光染料都可以達到XY100nm .EMCCD拍攝SIM拍攝4、奧林巴斯公司采用的 OSR技術圖像超分辨率重構(super resolution,SR)是指利用計算機將一幅低分辨率圖像(low resolutionLR)或圖像序列進行處理，恢復出高 分辨率圖像(high resolution ，HR)的一種圖像處理技術。奧林巴斯 超分辨技術通過高倍 60X或者100X油鏡通過縮小共聚焦上的針 孔用強激光將樣品掃描 2050次后通過軟件進行運算重構，此技 術存在一定的局