2018年5藥典生物樣品定量分析報告方法驗證指導(dǎo)原則

1、實用標(biāo)準(zhǔn)文案生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則一、范圍準(zhǔn)確測定生物基質(zhì)（如全血、血清、血漿、尿）中的藥物 濃度，對于藥物 和制劑研發(fā)非常重要。這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒 動學(xué)、藥動學(xué)和生物等效性試驗的結(jié)果做出關(guān)鍵性決定。 因此，必須完整地驗證 和記錄應(yīng)用的生物分析方法，以獲得可靠的結(jié)果。本指導(dǎo)原則提供生物分析方法驗證的要求，也涉及非臨床或臨床試驗樣品實 際分析的基本要求，以及何時可以使用部分驗證或交叉驗證，來替代完整驗證。 本指導(dǎo)原則二和三主要針對色譜分析方法，四針對配體結(jié)合分析方法。生物樣品定量分析方法驗證和試驗樣品分析應(yīng)符合本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求。 應(yīng)該在相應(yīng)的生物樣品

2、分析中遵守 GLP原則或GCP原則。二、生物分析方法驗證（一）分析方法的完整驗證分析方法驗證的主要目的是，證明特定方法對于測定在某種生物基質(zhì)中分析 物濃度的可靠性。止匕外，方法驗證應(yīng)采用與試驗樣品相同的抗凝劑。一般應(yīng)對每 個新分析方法和新分析物進(jìn)行完整驗證。當(dāng)難于獲得相同的基質(zhì)時，可以采用適 當(dāng)基質(zhì)替代，但要說明理由。一個生物分析方法的主要特征包括：選擇性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范 圍（標(biāo)準(zhǔn)曲線性能）、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物在生物基質(zhì)以及溶液 中儲存和處理全過程中的穩(wěn)定性。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案有時可能需要測定多個分析物。這可能涉及兩種不同的藥物，也可能涉及一 個母體藥物及其代謝物，

3、或一個藥物的對映體或異構(gòu)體。 在這些情況下，驗證和 分析的原則適用于所有涉及的分析物。對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在方法驗證中，含有分析物對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶液將被加入到空白生物基質(zhì) 中。止匕外，色譜方法通常使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)。應(yīng)該從可追溯的來源獲得對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 應(yīng)該科學(xué)論證對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的適用 性。分析證書應(yīng)該確認(rèn)對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度， 并提供儲存條件、失效日期和批號。 對于內(nèi)標(biāo)，只要能證明其適用性即可，例如顯示該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì) 不產(chǎn)生干擾。當(dāng)在生物分析方法中使用質(zhì)譜檢測時，推薦盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi) 標(biāo)。它們必須具有足夠高的同位素純度， 并且不發(fā)生同位素交換反應(yīng)，以避免結(jié) 果的偏差。1 .選擇性該

4、分析方法應(yīng)該能夠區(qū)分目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)與基質(zhì)的內(nèi)源性組分或樣品中其他組分。應(yīng)該使用至少6個受試者的適宜的空白基質(zhì)來證明選擇性 （動物空白 基質(zhì)可以不同批次混合），它們被分別分析并評價干擾。當(dāng)干擾組分的響應(yīng)低于 分析物定量下限響應(yīng)的20%,并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%時，通常即可以接受。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案應(yīng)該考察藥物代謝物、經(jīng)樣品預(yù)處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引 起干擾的程度。在適當(dāng)情況下，也應(yīng)該評價代謝物在分析過程中回復(fù)轉(zhuǎn)化為母體 分析物的可能性。2 .殘留應(yīng)該在方法建立中考察殘留并使之最小。殘留可能不影響準(zhǔn)確度和精密度。應(yīng)通過在注射高濃度樣品或校正標(biāo)樣后， 注射空白樣品來估計殘留。高濃度樣品

5、 之后在空白樣品中的殘留應(yīng)不超過定量下限的 20%,并且不超過內(nèi)標(biāo)的5%。如 果殘留不可避免，應(yīng)考慮特殊措施，在方法驗證時檢驗并在試驗樣品分析時應(yīng)用這些措施，以確保不影響準(zhǔn)確度和精密度。這可能包括在高濃度樣品后注射空 白樣品，然后分析下一個試驗樣品。3 .定量下限定量下限是能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度，具有可接受的準(zhǔn)確 度和精密度。定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點，應(yīng)適用于預(yù)期的濃度和試驗?zāi)康摹? .標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該在指定的濃度范圍內(nèi)評價儀器對分析物的響應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過加入已知濃度的分析物（和內(nèi)標(biāo)）到空白基質(zhì)中，制備各濃度的校正標(biāo)樣，具基質(zhì) 應(yīng)該與目標(biāo)試驗樣品基質(zhì)相同。方法驗證中研究的每

6、種分析物和每一分析批，都應(yīng)該有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案在進(jìn)行分析方法驗證之前，最好應(yīng)該了解預(yù)期的濃度范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍應(yīng) 該盡量覆蓋預(yù)期濃度范圍，由定量下限和定量上限（校正標(biāo)樣的最高濃度）來決 定。該范圍應(yīng)該足夠描述分析物的藥動學(xué)。應(yīng)該使用至少6個校正濃度水平，不包括空白樣品（不含分析物和內(nèi)標(biāo)的處 理過的基質(zhì)樣品）和零濃度樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理過的基質(zhì)）。每個校正標(biāo)樣可以 被多次處理和分析。應(yīng)該使用簡單且足夠描述儀器對分析物濃度響應(yīng)的關(guān)系式?？瞻缀土銤舛葮?品結(jié)果不應(yīng)參與計算標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)。應(yīng)該提交標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)，測定校正標(biāo)樣后回算得出的濃度應(yīng)一并提交。 在方 法驗證中，至少應(yīng)該評價3條標(biāo)準(zhǔn)

7、曲線。校正標(biāo)樣回算的濃度一般應(yīng)該在標(biāo)示值的± 15%以內(nèi)，定量下限處應(yīng)該在土 20%內(nèi)。至少75%校正標(biāo)樣，含最少6個有效濃度，應(yīng)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。如果某 個校正標(biāo)樣結(jié)果不符合這些標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該拒絕這一標(biāo)樣，不含這一標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線 應(yīng)被重新評價，包括回歸分析。最好使用新鮮配制的樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， 但如果有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)支持，也可以 使用預(yù)先配制并儲存的校正標(biāo)樣。5 .準(zhǔn)確度分析方法的準(zhǔn)確度描述該方法測得值與分析物標(biāo)示濃度的接近程度，表示 為：（測得值/真實值）xl00%。應(yīng)采用加入已知量分析物的樣品來評估準(zhǔn)確度， 即質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品的配制應(yīng)該與校正標(biāo)樣分開進(jìn)行，使用另行配制的儲備液。精彩文檔實

8、用標(biāo)準(zhǔn)文案應(yīng)該根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將獲得的濃度與標(biāo)示濃度對比。準(zhǔn)確度應(yīng) 報告為標(biāo)示值的百分比。應(yīng)通過單一分析批（批內(nèi)準(zhǔn)確度）和不同分析批（批問 準(zhǔn)確度）獲得質(zhì)控樣品值來評價準(zhǔn)確度。為評價一個分析批中不同時間的任何趨勢，推薦以質(zhì)控樣品分析批來證明準(zhǔn) 確度，其樣品數(shù)不少于一個分析批預(yù)期的樣品數(shù)。批內(nèi)準(zhǔn)確度為了驗證批內(nèi)準(zhǔn)確度，應(yīng)取一個分析批的定量下限及低、 中、高濃度質(zhì)控樣 品，每個濃度至少用5個樣品。濃度水平覆蓋標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：定量下限，在不高 于定量下限濃度3倍的低濃度質(zhì)控樣品，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣 品，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍上限約 75%處的高濃度質(zhì)控樣品。準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在 質(zhì)控

9、樣品標(biāo)示值的士 15%之內(nèi)，定量下限準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的土 20%范圍內(nèi)。批問準(zhǔn)確度通過至少3個分析批，且至少兩天進(jìn)行，每批用定量下 限以及低、中、高 濃度質(zhì)控樣品，每個濃度至少5個測定值來評價。準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品 標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)，對于定量下限，應(yīng)在標(biāo)示值的± 20%范圍內(nèi)。報告的準(zhǔn)確度和精密度的驗證數(shù)據(jù)應(yīng)該包括所有獲得的測定結(jié)果，但是已經(jīng)記錄明顯失誤的情況除外。6 .精密度精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案分析方法的精密度描述分析物重復(fù)測定的接近程度，定義為測量值的相對標(biāo) 準(zhǔn)差（變異系數(shù)）。應(yīng)使用與證明準(zhǔn)確度 相同分析批樣品的結(jié)果，獲得在同一 批內(nèi)和不同批問定量下限以及低

10、、中、高濃度質(zhì)控樣品的精密度。對于驗證批內(nèi)精密度，至少需要一個分析批的4個濃度，即定量下限以及低、 中、高濃度，每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品，批內(nèi)變異系數(shù)一般不得超 過15% ,定量下限的變異系數(shù)不得超過 20%。對于驗證批問精密度，至少需要 3個分析批（至少2天）的定量下限以及 低、中、高濃度，每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品，批間變異系數(shù)一般不 得超過15% ,定量下限的變異系數(shù)不得超過 20%。7 .稀釋可靠性樣品稀釋不應(yīng)影響準(zhǔn)確度和精密度。應(yīng)該通過向基質(zhì)中加入分析物至高于定 量上限濃度，并用空白基質(zhì)稀釋該樣品（每個稀釋因子至少5個測定值），來證明稀釋的可靠性。準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)在

11、± 15%之內(nèi)，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試驗 樣品所用的稀釋倍數(shù)?？梢酝ㄟ^部分方法驗證來評價稀釋可靠性。 如果能夠證明其他基質(zhì)不影響精 密度和準(zhǔn)確度，也可以接受其使用。8 .基質(zhì)效應(yīng)當(dāng)采用質(zhì)譜方法時，應(yīng)該考察基質(zhì)效應(yīng)。使用至少6批來自不同供體的空白 基質(zhì)，不應(yīng)使用合并的基質(zhì)。如果基質(zhì)難以獲得，則使用少于 6批基質(zhì)，但應(yīng)該 說明理由。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案對于每批基質(zhì)，應(yīng)該通過計算基質(zhì)存在下的峰面積（由空白基質(zhì)提取后加入 分析物和內(nèi)標(biāo)測得），與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積（分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤海┍戎? 計算每一分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基 質(zhì)因子，計算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的

12、基質(zhì)因子。從6批基質(zhì)計算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因 子的變異系數(shù)不得大于15% o該測定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進(jìn)行。如果不能適用上述方式，例如采用在線樣品預(yù)處理的情況，則應(yīng)該通過分析 至少6批基質(zhì)，分別加入高濃度和低濃度（定量下限濃度 3倍以內(nèi)以及接近定 量上限），來獲得批問響應(yīng)的變異。其驗證報告應(yīng)包括分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積， 以及每一樣品的計算濃度。這些濃度計算值的總體變異系數(shù)不得大于15% o除正?；|(zhì)外，還應(yīng)關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應(yīng)，例如溶血的或高血脂的血漿 樣品等。9 .穩(wěn)定性必須在分析方法的每一步驟確保穩(wěn)定性， 用于檢查穩(wěn)定性的條件，例如樣品 基質(zhì)、抗凝劑、容器材料、儲存和分析條件，都應(yīng)該與

13、實際試驗樣品的條件相似。 用文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的。采用低和高濃度質(zhì)控樣品（空白基質(zhì)加入分析物至定量下限濃度 3倍以內(nèi)以 及接近定量上限），在預(yù)處理后以及在所評價的條件儲存后立即分析。 由新鮮制 備的校正標(biāo)樣獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將測得濃度與標(biāo)示濃 度相比較，每一濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差應(yīng)在土 15%范圍內(nèi)。應(yīng)通過適當(dāng)稀釋，考慮到檢測器的線性和測定范圍，檢驗儲備液和工作溶液 的穩(wěn)定性。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案穩(wěn)定性檢查應(yīng)考察不同儲存條件，時間尺度應(yīng)不小于試驗樣品儲存的時間。通常應(yīng)該進(jìn)行下列穩(wěn)定性考察： 分析物和內(nèi)標(biāo)的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性； 從冰箱儲存條件到室溫或樣

14、品處理溫度，基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn)定 性； 基質(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性；止匕外，如果適用，也應(yīng)該進(jìn)行下列考察： 處理過的樣品在室溫下或在試驗過程儲存條件下的穩(wěn)定性； 處理過的樣品在自動進(jìn)樣器溫度下的穩(wěn)定性。在多個分析物試驗中，特別是對于生物等效性試驗，應(yīng)該關(guān)注每個分析物在 含所有分析物基質(zhì)中的穩(wěn)定性。應(yīng)特別關(guān)注受試者采血時，以及在儲存前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性，以確保由分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時刻的分析物濃度?？赡苄枰鶕?jù)分析物的結(jié)構(gòu)，按具體情況證明其穩(wěn)定性。（二）部分驗證在對已被驗證的分析方法進(jìn)行小幅改變情況下，根據(jù)改變的實質(zhì)內(nèi)容，可能 需要部分方法驗證?？赡艿母淖儼?/p>

15、括：生物分析方法轉(zhuǎn)移到另一個實驗室， 改變 儀器、校正濃度范圍、樣品體積，其他基質(zhì)或物種，改變抗凝劑、樣品處理步驟、 儲存條件等。應(yīng)報告所有的改變，并對重新驗證或部分驗證的范圍說明理由。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案（三）交叉驗證應(yīng)用不同方法從一項或多項試驗獲得數(shù)據(jù)， 或者應(yīng)用同一方法從不同試驗地 點獲得數(shù)據(jù)時，需要互相比較這些數(shù)據(jù)時，需要進(jìn)行分析方法的交叉驗證。如果 可能，應(yīng)在試驗樣品被分析之前進(jìn)行交叉驗證，同一系列質(zhì)控樣品或試驗樣品應(yīng) 被兩種分析方法測定。對于質(zhì)控樣品，不同方法獲得的平均準(zhǔn)確度應(yīng)在土15%范圍內(nèi)，如果放寬，應(yīng)該說明理由。對于試驗樣品，至少 67%樣品測得的兩組數(shù) 值差異應(yīng)在兩者均值的

16、± 20%范圍內(nèi)。三、試驗樣品分析在分析方法驗證后，可以進(jìn)行試驗樣品或受試者樣品分析。 需要在試驗樣品 分析開始前證實生物分析方法的效能。應(yīng)根據(jù)已驗證的分析方法處理試驗樣品以及質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣，以保證分析批被接受。（一）分析批一個分析批包括空白樣品和零濃度樣品，包括至少 6個濃度水平的校正標(biāo) 樣，至少3個濃度水平質(zhì)控樣品（低、中、高濃度雙重樣品，或至少試驗樣品總 數(shù)的5%,兩者中取數(shù)目更多者），以及被分析的試驗樣品。所有樣品（校正標(biāo) 樣、質(zhì)控和試驗樣品）應(yīng)按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提 取。一個分析批包括的樣品在同一時間處理， 即沒有時間問隔，由同一分析者相 繼處

17、理，使用相同的試劑，保持一致的條件。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個批中，以 此保證整個分析批的準(zhǔn)確度和精密度。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案對于生物等效性試驗，建議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以減少結(jié)果的變異。（二）分析批的接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在分析試驗計劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中，規(guī)定接受或拒絕一個分析批的標(biāo)準(zhǔn)。 在整個分析批包含多個部分批次的情況， 應(yīng)該針對整個分析批，也應(yīng)該針對分析 批中每一部分批次樣品定義接受標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)該使用下列接受標(biāo)準(zhǔn)：校正標(biāo)樣測定回算濃度一般應(yīng)在標(biāo)示值的± 15%范圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在± 20%范圍內(nèi)。不少于6個校正標(biāo)樣，至少75%標(biāo)樣應(yīng)符合這些標(biāo)準(zhǔn)。如果校正 標(biāo)樣中有一個

18、不符合標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)該拒絕這個標(biāo)樣，重新計算不含該標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲 線，并進(jìn)行回歸分析。質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的士 15%范圍內(nèi)。至少67%質(zhì)控樣品， 且每一濃度水平至少50%樣品應(yīng)符合這一標(biāo)準(zhǔn)。在不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的情況下， 應(yīng)該拒絕該分析批，相應(yīng)的試驗樣品應(yīng)該重新提取和分析。在同時測定幾個分析物的情況下，對每個分析物都要有 一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。如 果一個分析批對于一個分析物可以接受， 而對于另一個分析物不能接受，則接 受的分析物數(shù)據(jù)可以被使用，但應(yīng)該重新提取和分析樣品，測定被拒絕的分析物。如果使用多重校正標(biāo)樣，其中僅一個定量下限或定量上限標(biāo)樣不合格，則校 正范圍不變。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案所有接受的分

19、析批，每個濃度質(zhì)控樣品的平均準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)該列表，并在分析報告中給出。如果總平均準(zhǔn)確度和精密度超過15%,則需要進(jìn)行額外的考察，說明該偏差的理由。在生物等效性試驗情況下，這可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)被拒絕。（三）校正范圍如果在試驗樣品分析開始前，已知或預(yù)期試驗樣品中的分析物濃度范圍窄， 則推薦縮窄標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，調(diào)整質(zhì)控樣品濃度，或者適當(dāng)加入質(zhì)控樣品新的濃度， 以充分反映試驗樣品的濃度。如果看起來很多試驗樣品的分析物濃度高于定量上限，在可能的情況下，應(yīng)該延伸標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變其濃度。至少2個質(zhì)控樣品濃度應(yīng)該落在試驗樣品的濃度范圍內(nèi)。 如果標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 被改變，則生物分析方法應(yīng)被重新

20、驗證（部分驗證），以確認(rèn)響應(yīng)函數(shù)并保證準(zhǔn) 確度和精密度。（四）試驗樣品的重新分析和報告值選擇應(yīng)該在試驗計劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中預(yù)先確定重新分析試驗樣品的理由以及 選擇報告值的標(biāo)準(zhǔn)。在試驗報告中應(yīng)該提供重新分析的樣品數(shù)目以及占樣品總數(shù) 的比例。重新分析試驗樣品可能基于下列理由： 由于校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度或精密度不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致一個分 析批被拒絕；,內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著；精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案 進(jìn)樣不當(dāng)或儀器功能異常； 測得的濃度高于定量上限，或低于該分析批的定量下限，且該批的最低濃 度標(biāo)樣從標(biāo)準(zhǔn)曲線中被拒絕，導(dǎo)致比其他分析批的定量下限高； 在給藥前樣品或安慰劑樣品

21、中測得可定量的分析物； 色譜不佳。對于生物等效性試驗，通常不能接受由于藥動學(xué)理由重新分析試驗樣品。在由于給藥前樣品陽性結(jié)果或者由于藥動學(xué)原因進(jìn)行重新分析的情況下，應(yīng)該提供重新分析樣品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析獲得值、最終 接受值以及接受理由。在儀器故障的情況下，如果已經(jīng)在方法驗證時證明了重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性和進(jìn) 樣器內(nèi)穩(wěn)定性，則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進(jìn)樣。 但對于拒絕的分析批，則需 要重新處理樣品。（五）色譜積分應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中描述色譜的積分以及重新積分。 任何對該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 的偏離都應(yīng)在分析報告中討論。實驗室應(yīng)該記錄色譜積分參數(shù)，在重新積分的情 況下，記錄原始和最終的積分?jǐn)?shù)據(jù)

22、，并在要求時提交。（六）用于評價方法重現(xiàn)性的試驗樣品再分析在方法驗證中使用校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品可能無法模擬實際試驗樣品。例如， 蛋白結(jié)合、已知和未知代謝物的回復(fù)轉(zhuǎn)化、樣品均一性或同服藥物引起的差異， 可能影響這些樣品在處理和儲存過程中分析物的準(zhǔn)確度和精密度。因此，推薦通精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案過在不同天后，在另外一個分析批中重新分析試驗樣品， 來評價實際樣品測定的 準(zhǔn)確度。檢驗的范圍由分析物和試驗樣品決定， 并應(yīng)該基于對分析方法和分析物 的深人理解。建議獲得Cmax附近和消除相樣品的結(jié)果，一般應(yīng)該重新分析 10% 樣品，如果樣品總數(shù)超過1000 ,則超出部分重新分析5%樣品。對于至少67%的重復(fù)測試

23、，原始分析測得的濃度和重新分析測得的濃度之 間的差異應(yīng)在兩者均值的士 20%范圍內(nèi)。試驗樣品再分析顯示偏差結(jié)果的情況下，應(yīng)該進(jìn)行考察，采取足夠的步驟優(yōu) 化分析方法。至少在下列情形下，應(yīng)該進(jìn)行試驗樣品的再分析： 毒動學(xué)試驗，每個物種一次 所有關(guān)鍵性的生物等效性試驗 首次用于人體的藥物試驗 首次用于患者的藥物試驗 首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗對于動物試驗，可能僅需要在早期關(guān)鍵性試驗中進(jìn)行實際樣品的再分析，例如涉及給藥劑量和測得濃度關(guān)系的試驗。四、配體結(jié)合分析配體結(jié)合分析主要用于大分子藥物。前述的驗證原則以及對試驗樣品分析的 考慮一般也適用。但是由于大分子固有的特點和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使其難以被提

24、取，精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案所以常常在無預(yù)先分離的情況下測定分析物。止匕外，方法的檢測終點并不直接來 自分析物的響應(yīng)，而來自與其他結(jié)合試劑產(chǎn)生的間接信號。 配體結(jié)合分析中，每 個校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品以及待測樣品一般都采用復(fù)孔分析。如無特殊說明，本節(jié) 以雙孔分析為原則。(-)方法驗證前的考量1 .標(biāo)準(zhǔn)品選擇生物大分子具有不均一性，其中成分的效價與免疫反應(yīng)可能存在差異。因此 應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行充分表征。應(yīng)盡量使用純度最高的標(biāo)準(zhǔn)品。用于配制校正標(biāo)樣和 質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量與臨床和非臨床試驗使用的受試品批號相同。 標(biāo)準(zhǔn)品批 號變更時，應(yīng)盡量對其進(jìn)行表征和生物分析評價，以確保方法性能不變。2 .基質(zhì)選擇一般不推

25、薦使用經(jīng)碳吸附、免疫吸附等方法提取過的基質(zhì)，或透析血清、蛋 白緩沖液等替代實際樣品基質(zhì)建立分析方法。 但在某些情況下，復(fù)雜生物基質(zhì)中 可能存在高濃度與分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)， 具高度干擾導(dǎo)致根本無法測定 分析物。在無其他可選定量策略的前提下，可允許使用替代基質(zhì)建立分析方法。但應(yīng)對使用替代基質(zhì)建立方法的必要性加以證明?？刹捎锰娲|(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，但質(zhì)控樣品必須用實際樣品基質(zhì)配制， 應(yīng)通 過計算準(zhǔn)確度來證明基質(zhì)效應(yīng)的消除。3 .最低需求稀釋度的確定精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案分析方法建立與驗證過程中，可能需要對基質(zhì)進(jìn)行必要的稀釋，以降低 其產(chǎn)生的高背景信號。在此情況下，應(yīng)考察最低需求稀釋度。它是指分析

26、方法中 為提高信噪比、減少基質(zhì)干擾、優(yōu)化準(zhǔn)確度與精密度而必須使用緩沖液對生物樣 品 進(jìn)行稀釋的最小倍數(shù)。應(yīng)使用與試驗樣品相同的基質(zhì)來配制加藥樣品來確定 最低需求稀釋度。4 .試劑方法的關(guān)鍵試劑，如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體、酶等，對分析結(jié) 果會產(chǎn)生直接影響，因此須確保質(zhì)量。如果在方法驗證或樣品分析過程中， 關(guān)鍵 試劑批次發(fā)生改變，須確認(rèn)方法性能不因此改變，從而確保不同批次結(jié)果的一致 性。無論是關(guān)鍵試劑，還是緩沖液、稀釋液、酸化劑等非關(guān)鍵試劑，都應(yīng)對維持 其穩(wěn)定性的保障條件進(jìn)行記錄，以確保方法性能長期不變。(二)方法驗證1 .完整驗證(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線反映了分析物濃度與儀器響

27、應(yīng)值之間的關(guān)系。在配體結(jié)合分析方法 中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的響應(yīng)函數(shù)是間接測得的，一般呈非線性，常為S型曲線。應(yīng)使用至少6個有效校正標(biāo)樣濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。校正標(biāo)樣應(yīng)在預(yù)期定量范 圍對數(shù)坐標(biāo)上近似等距離分布。除校正標(biāo)樣外，可使用錨定點輔助曲線擬合。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案驗證過程中，須至少對6個獨立的分析批進(jìn)行測定，結(jié)果以列表形式報告， 以確定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸模型整體的穩(wěn)健性。 擬合時，一條標(biāo)曲允許排除由于明確或 不明原因產(chǎn)生失誤的濃度點。排除后應(yīng)至少有 75%的校正標(biāo)樣回算濃度在標(biāo)示 值的±20% (定量下限與定量上限在土 25%)范圍內(nèi)。定量下限與定量上限之間 的濃度范圍為標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍。錨定點

28、校正樣品是處于定量范圍之外的標(biāo)樣 點，用于輔助擬合配體結(jié)合分析的非線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，因其在定量范圍之外， 可不遵循上述接受標(biāo)準(zhǔn)。(2)特異性特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確、專一地測定分析物的能力。結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)或預(yù)期合用藥物應(yīng)不影響方法對分析物的測 定。如在方法建立與驗證階段無法獲取結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)，特異性評價可在最初方法 驗證完成后補充進(jìn)行。應(yīng)采用未曾暴露于分析物的基質(zhì)配制高濃度與低濃度質(zhì)控 樣品，加入遞增濃度的相關(guān)干擾物質(zhì)或預(yù)期合用藥物進(jìn)行特異性考察。未加入分析物的基質(zhì)也應(yīng)同時被測量。要求至少 80%以上的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度在土 20%范 圍內(nèi)(如果在定量下限水平，則在

29、土 25%范圍內(nèi))，且未加入分析物的基質(zhì)的測 量值應(yīng)低于定量下限。(3)選擇性方法的選擇性是指基質(zhì)中存在非相關(guān)物質(zhì)的情況下，準(zhǔn)確測定分析物的能力。由于生物大分子樣品一般不經(jīng)提取，基質(zhì)中存在的非相關(guān)物質(zhì)可能會干擾分 析物的測定。應(yīng)通過向至少10個不同來源的基質(zhì)加入定量下限和定量上限水平 的分析物來考察選擇性，也應(yīng)同時測量未加入分析物的基質(zhì)。 選擇性考察要求至精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案少80%以上的樣品準(zhǔn)確度在± 20%范 圍內(nèi)（如果在定量下限水平，則在土 25% 范圍內(nèi)），且未加入分析物的基質(zhì)的測量值應(yīng)低于定量下限。 如果干擾具有濃度 依賴性，則須測定發(fā)生干擾的最低濃度。 在此情況下，可能需

30、要在方法驗證之前調(diào)整定量下限。根據(jù)項目需要，可能需要針對病人群體基質(zhì)或特殊基質(zhì) （如溶血 基質(zhì)或高血脂基質(zhì)）考察選擇性。（4）精密度與準(zhǔn)確度應(yīng)選擇至少5個濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度以及方法總誤差考察。包括定量下限濃度、低濃度質(zhì)控（定量下限濃度的 3倍以內(nèi)）、中濃度質(zhì)控（標(biāo) 準(zhǔn)曲線中段）、高濃 度質(zhì)控（定量上限濃度75%以上）以及定量上限濃度質(zhì)控。低、中、高濃度質(zhì)控標(biāo)示值不得與校正標(biāo)樣濃度標(biāo)示值相同， 質(zhì)控樣品應(yīng)經(jīng)過冷 凍，并與試驗樣品采用相同的方法進(jìn)行處理。 不建議采用新鮮配制的質(zhì)控樣品進(jìn) 行精密度與準(zhǔn)確度考察。批問考察應(yīng)在數(shù)日內(nèi)進(jìn)行至少 6個獨立的分析批測定。每批內(nèi)應(yīng)包含至少3套質(zhì)控樣

31、品（每套含至少5個濃度的質(zhì)控樣品）。對于批內(nèi)和批問準(zhǔn)確度，各濃度質(zhì)控樣品的平均濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±20% （定量下限和定量上限為±25%）范圍內(nèi)。批內(nèi)和批問精密度均不應(yīng)超過 20% （定量下限和 定量上限為25%） o止匕外，方法總誤差（即相對偏差 絕對值與變異系數(shù)之 和）不應(yīng)超過30% （定量下限和定量上限為 40%）。（5）稀釋線性在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量范圍不能覆蓋預(yù)期樣品濃度的情況下，應(yīng)使用質(zhì)控樣品進(jìn)行方法的稀釋線性考察，即評價樣品濃度超過分析方法的定量上限時，用空白基質(zhì)精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案將樣品濃度稀釋至定量范圍內(nèi)后，方法能否準(zhǔn)確測定。進(jìn)行稀釋實驗的另一目的 是考察方法是否存

32、在“前帶”或“鉤狀”效應(yīng)，即高濃度分析物引起的信號抑制。稀釋線性考察中，稀釋至定量范圍內(nèi)的每個 QC樣品經(jīng)稀釋度校正后的回算 濃度應(yīng)在標(biāo)示值的土 20%范圍內(nèi)，且所有QC樣品回算終濃度的精密度不超過 20%。(6)平行性為發(fā)現(xiàn)可能存在的基質(zhì)效應(yīng)，或代謝物的親和性差異，在可獲得真實試驗樣 品的情況下，應(yīng)考慮對標(biāo)準(zhǔn)曲線和系列稀釋的試驗樣品之間進(jìn)行平行性考察。應(yīng)選取高濃度試驗樣品(最好采用超出定量上限的樣品)，用空白基質(zhì)將其稀釋到 至少3個不同濃度后進(jìn)行測定，系列稀釋樣品間的精密度不應(yīng)超過30%。如果存在樣品稀釋非線性的情況(即非平行性)，則應(yīng)按事先的規(guī)定予以報告。如果 在方法驗證期間無法獲取真實試

33、驗樣品，則應(yīng)在獲得真實試驗樣品后盡快進(jìn)行平 行性考察。(7)樣品穩(wěn)定性應(yīng)使用低、高濃度質(zhì)控樣品考察分析物的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察應(yīng)包括室溫或 樣品處理溫度下的短期穩(wěn)定性，以及凍一融穩(wěn)定性。止匕外，如果試驗樣品需要長 期凍存，則應(yīng)在可能凍存樣品的每個溫度下進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察。 每一濃度質(zhì)控 樣品應(yīng)有67%以上的樣品濃度在標(biāo)示值的± 20%范圍內(nèi)。(8)商品化試劑盒精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案商品化試劑盒可以用來進(jìn)行試驗樣品分析，但使用前必須按本指導(dǎo)原則的要 求對其進(jìn)行驗證。2 .部分驗證和交叉驗證在二、（二）和二、（三）中敘述的關(guān)于驗證的各項內(nèi)容都適用于配體結(jié)合 分析。（三）試驗樣品分析1 .分析批配體結(jié)合分析中最常使用微孔板，一個微孔板通常為一個分析批。每個微孔 板應(yīng)包含一套獨立的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品，以校準(zhǔn)板間差異。在使用某些平臺時， 單個樣品載體的通量可能有限，此時允許一個分析批包含多個載體。 可在該分析 批的首個與末個載體各設(shè)置一套標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時在每一載體上設(shè)置質(zhì)控樣品。所有樣品均應(yīng)復(fù)孔測定。2 .試驗樣品分析的接受標(biāo)準(zhǔn)對于每個分析批，除錨定點外，標(biāo)準(zhǔn)曲線須有75%以上的校正標(biāo)樣（至少6 個）回算濃度在標(biāo)示值的± 20% （定量下限和定量上限為土 25%）范圍內(nèi)。每塊板應(yīng)含有至少2套3水平（低