關(guān)于免疫組化封閉液原理的討論

1、你可以理解為NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通過電轉(zhuǎn)，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，塞進(jìn)了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些洞洞并沒有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣，就會有很多非特異性的信號，但如果用富含蛋白的封閉液與膜作用，那所有的空洞都會被BSA或者酪蛋白填滿，這樣，抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結(jié)合封閉的原理 但個人認(rèn)為并不全面，如果封閉僅僅是填補(bǔ)空隙的話，那封閉僅僅是起到降低背景的作用。如果是這樣的話雜帶的問題怎么解釋呢？還有免疫組化的封閉是怎么個原理呢？ 個人覺得從抗原決定簇的角度

2、來說可能會更好一點(diǎn)?？贵w是識別抗原決定簇，然后與之結(jié)合，奶粉和BSA起封閉作用主要是通過蛋白起作用的，就是能夠非特異性地將表面的抗原決定簇結(jié)合，這樣特異性的抗體就不會跟這些非特異性的抗原決定簇結(jié)合，這樣背景就會降低。 可能有人會問，那目的蛋白為什么不能被封閉掉？ 因?yàn)榭贵w跟目的蛋白的結(jié)合是非常特異的，結(jié)合能力很強(qiáng)，封閉之后依然能夠結(jié)合。當(dāng)然如果封閉是太長，也能影響抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)致最后顯影信號變?nèi)酰@就是有時候封閉時間長了信號變?nèi)醯脑?。同樣，通過延長封閉時間來去除非特性條帶以及免疫組化中延長封閉時間降低背景都是這么個原理。skykiller認(rèn)為，封閉時的封閉蛋白不僅是吸附到膜上的空白位置

3、（此點(diǎn)與zzz198506相同），而且還會和膜上已有的蛋白（目標(biāo)蛋白和雜蛋白）產(chǎn)生競爭性的洗脫作用，而不是和膜上的蛋白產(chǎn)生結(jié)合作用。即不是用封閉液封閉雜蛋白的非特異性的抗原決定簇（用抗原決定簇這個詞不是很妥當(dāng)，但好理解一些），而是將雜蛋白從膜上部分洗脫下來，從而減輕了非特異性的條帶信號。這種洗脫也會對目標(biāo)蛋白產(chǎn)生作用，同樣減輕其條帶信號。zzz198506的這句話：“當(dāng)然如果封閉是太長，也能影響抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)致最后顯影信號變?nèi)酰@就是有時候封閉時間長了信號變?nèi)醯脑颉辈荒苡媒Y(jié)合來解釋，但用洗脫就比較好理解?？贵w與目標(biāo)抗原的親和結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這個zzz198506戰(zhàn)友假說的非特異性結(jié)合，

4、即使封閉液中的蛋白可能有與目標(biāo)蛋白的非特異性結(jié)合，在抗體孵育過程中也會完全被替代，而不會影響到最后的顯影信號。用吸附-洗脫假說來看封閉的操作，就能明白為什么封閉液的組成、濃度、時間等等要素的對WB的影響。封閉液中要有可以和膜產(chǎn)生非特異性吸附的分子量適中的蛋白，太大了可能對鄰近的目標(biāo)蛋白產(chǎn)生位置阻礙，太小了容易從膜上的孔洞里脫落。封閉液的pH，鹽，表面活性劑等一方面影響封閉液中的蛋白與膜的結(jié)合吸附，另一方面還會對膜上的已有的蛋白產(chǎn)生不同洗脫作用，這也是WB中選用不同封閉液的原因，即為了盡可能多的洗脫雜蛋白，盡量減少對目標(biāo)蛋白的洗脫作用。封閉液的濃度越高，封閉時間越長，對膜上孔洞的覆蓋越好，由于競

5、爭性的作用，對雜蛋白的洗脫也越好，但對目標(biāo)蛋白的洗脫也越強(qiáng)。也就是說在相同曝光條件下背景更干凈，雜帶更淡，但目標(biāo)條帶也更淡。樓上說的都很精彩，借你們的文字和理論，我也自己總結(jié)一下，對錯與否，懇請賜教。1、轉(zhuǎn)膜后蛋白以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附的方式結(jié)合于膜上，這種結(jié)合是很牢固的。2、封閉液中的蛋白可以與膜上的空白位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛小疤钛a(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異結(jié)合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上。3、同時，封閉液中的蛋白與膜上的蛋白（抗原決定簇）進(jìn)行非特異性結(jié)合，說明與目的蛋白也是有

6、結(jié)合的。但這種結(jié)合強(qiáng)度不強(qiáng)，起碼比1或2的結(jié)合方式要弱得多。4、不排除“封閉液中的蛋白與膜上的蛋白存在一種競爭性洗脫作用，無選擇性”。但應(yīng)該說這種競爭是很微弱的，因?yàn)樵瓉碓谀ど系牡鞍缀湍そY(jié)合得很牢固，這種洗脫作用不至于對膜上蛋白的數(shù)量造成實(shí)質(zhì)性影響。5、一抗和目的蛋白的結(jié)合是特異性結(jié)合，這種結(jié)合力比較強(qiáng)。6、結(jié)合能力比較：12537、理由：a、抗體洗脫液可以洗脫抗體，卻不能洗脫膜上的蛋白，故25。（另外，洗滌劑如免疫組化的PBS或wetern的TBST無法洗脫2和5、3這三種結(jié)合，只是洗去未結(jié)合一抗。因?yàn)樵诩佣骨坝邢礈?，如果能洗脫的話，二抗就會取代被洗掉的蛋白而與膜或其他蛋白產(chǎn)生非特異結(jié)合。

7、所以，在封閉后也可洗滌也可不洗滌，但不洗會保險一點(diǎn)，因?yàn)樵诙挤忾]的情況下，一抗終究會取代封閉液中的蛋白。）b、1和2有著相同的結(jié)合方式，但1的機(jī)械填補(bǔ)是在電場的作用下完成的，綜合起來認(rèn)為12。c、一抗和目的蛋白的結(jié)合是特異性的，這種結(jié)合在封閉后進(jìn)行就存在這一抗和封閉液中蛋白對目的蛋白的競爭，但這種競爭很不平衡，因?yàn)樘禺愋越Y(jié)合比非特異性結(jié)合牢固得多（53），也就是說一抗最終肯定取代封閉液中的蛋白結(jié)合在目的蛋白上；但畢竟是存在著競爭，所以一抗的取代不是完全絕對的，還受封閉液的濃度等因素的影響，因此，封閉液的不同會影響一抗和目的蛋白的結(jié)合率，也就解釋了封閉時間長短，濃度會影響目的條帶的現(xiàn)象。雖然這種

8、影響很微弱。8、最后，結(jié)合的強(qiáng)弱都是相對的，非特異條帶的出現(xiàn)首要考慮一抗的特異性，其他只是輔助因素，只有衡量利弊，才能有合適的實(shí)驗(yàn)方案。展開引用leeo2636 wrote:supermaltose說的形象，讓人一目了然。但個人認(rèn)為并不全面，如果封閉僅僅是填補(bǔ)空隙的話，那封閉僅僅是起到降低背景的作用。如果是這樣的話雜帶的問題怎么解釋呢？還有免疫組化的封閉是怎么個原理呢？個人覺得從抗原決定簇的角度來說可能會更好一點(diǎn)?？贵w是識別抗原決定簇，然后與之結(jié)合，奶粉和BSA起封閉作用主要是通過蛋白起作用的，就是能夠非特異性地將表面的抗原決定簇結(jié)合，這樣特異性的抗體就不會跟這些非特異性的抗原決定簇結(jié)合，這樣

9、背景就會降低?？赡苡腥藭枺悄康牡鞍诪槭裁床荒鼙环忾]掉？因?yàn)榭贵w跟目的蛋白的結(jié)合是非常特異的，結(jié)合能力很強(qiáng)，封閉之后依然能夠結(jié)合。當(dāng)然如果封閉是太長，也能影響抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)致最后顯影信號變?nèi)酰@就是有時候封閉時間長了信號變?nèi)醯脑?。同樣，通過延長封閉時間來去除非特性條帶以及免疫組化中延長封閉時間降低背景都是這么個原理。個人拙見，不知道說沒說清楚，不對之處歡迎指正我有個疑問，既然抗體的結(jié)合是特異性的，其與目的蛋白的結(jié)合是非常特異且結(jié)合能力很強(qiáng)，其辨識目的蛋白的能力應(yīng)該很強(qiáng)，那特異性的抗體怎么會與非特異性的抗原決定簇結(jié)合？.這里有2種情況1，IgG本身也是一種蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)就有疏水作用或

10、者親水基團(tuán)，這樣和別的物質(zhì)就會發(fā)生一定牢固程度的結(jié)合，當(dāng)然這種結(jié)合總是強(qiáng)不過特意性的“抗原-抗體”結(jié)合。2，相似表位的問題（半特異結(jié)合），一個表位一般是有4-6個氨基酸組成的，一個抗原或者說一個蛋白質(zhì)本身可以組合出很多種表位（包括線形和空間兩種表位）。當(dāng)你的抗體的特異性不是非常好（識別的表位屬于一些類似蛋白的同源性或者保守區(qū)），或者一些蛋白有3-4個氨基酸序列和你抗體所識別的表位序列相似時（轉(zhuǎn)膜的蛋白種類越多，發(fā)生這種撞衫情況的幾率也越高），抗體也是有一定的親和性。這個時候就是考驗(yàn)一個抗體表位特異性的時候了，高質(zhì)量的單抗，這方面應(yīng)該是盡量避免發(fā)生的，所以做QC的時候需要用全細(xì)胞裂解液作為轉(zhuǎn)膜的

11、蛋白，來測試細(xì)胞中是否有雜蛋白能“非特異”或者“半特異”結(jié)合。給大家講一個故事：有一面墻，墻上布滿膠水，膠水很黏。有一個人，開著一輛車，從垃圾回收站把一堆廢銅爛鐵拉到墻邊，并粘在上邊。有一群孩子很頑皮，把好多的破爛東西往墻上粘，有塑料、木頭，甚至少量鐵屑，最后都粘滿了。車主想看看自己撿到的東西里有多少鐵。他用水龍頭往下沖，結(jié)果只沖下少量泥土。他想了個好辦法，將一些彩色的磁石粉撒到了墻上，然后又用水沖他看到了那些彩色的東西在一個地方閃閃發(fā)光，很特異首先，nc膜靠疏水性結(jié)合蛋白，力量大；pvdf膜也靠疏水性但它還帶正電荷，所以和帶sds的蛋白正好結(jié)合，力量更大。大家所說的堵上窟窿雖然很形象，但是實(shí)

12、質(zhì)上不是靠窟窿，而是靠蛋白與膜的結(jié)合力，電轉(zhuǎn)只是將蛋白送過去，是一輛車，而不是把蛋白訂到膜上的錘子。所以無論是電轉(zhuǎn)上去的蛋白條帶，還是滴加上去的封閉液，作用力相差不大，封閉后的結(jié)果就是膜上布滿蛋白！而且結(jié)合力都很強(qiáng)！有少量的封閉劑會和我們的目的蛋白發(fā)生一些作用力，有可能堵住抗原決定簇，但這種力量很小，所以我們用低濃度tween20去洗，其實(shí)tween洗的就是他們！如果你用tween80去洗，結(jié)果幾乎就是一張新膜一抗也是蛋白，但來晚了，膜上沒有位子了，只有一些蛋白上有它的抗原決定簇可以結(jié)合，所以它就被特異了！一些不太合適的決定簇也可能被結(jié)合，但又可以用tween20了就這樣，一抗特異了 在不斷的思考過程當(dāng)中，覺得無論 封閉（膜與封閉蛋白或非蛋白）、 特異性的抗體結(jié)合（抗原抗體，一抗二抗）、 非特異性的蛋白相互作用（雜帶與封閉蛋白，雜帶與一抗二抗，封閉蛋白與一抗二抗）、