結(jié)核分枝桿菌快速診斷試劑盒

1、FASTPlaqueTBTM一結(jié)核分枝桿菌快速診斷試劑盒(噬菌體法)Manual of FASTPlaqueTB TMMycobacterium tuberculosis Diagnostic Kits上海金浩科技發(fā)展有限公司BIOTEC Laboratories Limited (UK)1、使用目的FASTPlaqueTB試劑盒為一種體外診斷試劑，用于檢測(cè)待檢標(biāo)本中是否存在活的結(jié) 核分枝桿菌。2、背景肺結(jié)核是一種因感染結(jié)核分枝桿菌(MTB),偶爾為牛分枝桿菌，非洲分枝桿菌而引發(fā)的傳染病，在低收入地區(qū)發(fā)病率相對(duì)較高。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約1/3的人口感染MTB ,每年新增患者900萬(wàn)，并有300

2、萬(wàn)人死于該病。目前對(duì)結(jié)核病診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷與臨床體癥相結(jié)合。實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括涂片法、培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和噬菌體法。痰涂片直接鏡檢是檢測(cè)抗酸桿菌 (AFB)最普遍的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，特異性較高，但靈敏性較低，涂片中分枝桿菌要達(dá)到 103104cfu/ml才可檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，且僅能檢出1/23/4的活動(dòng)性結(jié)核患者，漏檢率相當(dāng)高；羅氏(L?wenstein Jensen)培養(yǎng)法是目前檢測(cè) MTB的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其檢測(cè)周期長(zhǎng) (8周)，導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)確診結(jié)核患者，并無(wú)法及時(shí)治療；新近發(fā)展起來(lái)并廣泛使用的快培檢測(cè)技術(shù)無(wú)疑大大縮短了檢測(cè)周期，但確診仍需23周，依然無(wú)法實(shí)現(xiàn)結(jié)核病快速診療

3、；基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法快速，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，但靈敏度有限；而基于核酸擴(kuò)增 的檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確，但成本高昂、技術(shù)要求高，難以在發(fā)展中國(guó)家常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中廣泛 開(kāi)展。很顯然，臨床實(shí)驗(yàn)室急需一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，易推廣的檢測(cè)方法用于結(jié)核病的 檢測(cè)。3、測(cè)試原理FASTPlaqueTBTM試劑盒采用噬菌體擴(kuò)增方法檢測(cè)待檢標(biāo)本中是否存在活的結(jié)核分枝 桿菌。痰液標(biāo)本首先經(jīng)去污染處理，殺滅痰液中其它雜菌，隨后用特異性噬菌體迅速感染結(jié)核分枝桿菌，再添加殺毒劑殺滅未感染結(jié)核分枝桿菌的噬菌體。經(jīng)殺毒劑處理后，僅有 MTB胞內(nèi)的噬菌體存活并復(fù)制，直至 MTB細(xì)胞裂解，釋放噬菌體。隨后，復(fù)制的噬菌 體感染隨即添加的

4、敏感細(xì)胞中繼續(xù)快速擴(kuò)增。新復(fù)制的噬菌體依次經(jīng)歷感染、復(fù)制和裂解的循環(huán)過(guò)程，在敏感細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的噬菌斑。平皿中噬菌斑數(shù)目與標(biāo)本中 MTB數(shù)目成正相關(guān)，如標(biāo)本中不含 MTB ,則經(jīng)殺毒劑處理后，痰液中無(wú)噬菌體存活，故 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)敏感細(xì)胞菌苔上無(wú)噬菌斑出現(xiàn)。殺病毒 劑處理含有活的結(jié)核分枝桿菌分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制4 .試劑和儀器每個(gè)試劑盒含10個(gè)測(cè)試所需試劑，每個(gè)包裝內(nèi)含5個(gè)試劑盒，即50個(gè)測(cè)試所需試劑。4.1 試劑盒組分每個(gè)FASTPlaqueTB?試劑盒應(yīng)包含以下組份:試齊 J A (FPTB Medium)1 （袋）FPTB培養(yǎng)基試齊 JB (Growth Supplement)1 （

5、瓶）FPTB生長(zhǎng)補(bǔ)充劑試劑C* （ FPTB完全培養(yǎng)基 ）使用時(shí)，無(wú)菌條件下將試劑 B加入無(wú)菌 已冷卻的試劑 A溶液中，制得試劑C液.試齊JD (Actiphage)1 （瓶）凍干 Actiphage噬菌體試齊JE (Sensor Cells)1 （瓶）凍干敏感細(xì)胞試齊JF (Virusol)1 （瓶）殺病場(chǎng)劑試齊 J G (FPTB Agar)1 （袋）FPTB瓊脂培養(yǎng)基干粉反應(yīng)管10 （個(gè)）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1 （份,英義）4.2 其它試劑和儀器4.2.1 其它試劑NALC-NaOH （或 3%NaOH）消化液；pH6.8 的 PBS 溶液（相當(dāng)于 0.067mol/L ）。4.2.2 設(shè)備和儀器

6、生物安全柜、旋渦振蕩器、離心機(jī)（4000rpm, 50ml）、移液槍及配套槍頭（100ul,1000ul）、水浴設(shè)備（56C）、高壓蒸汽殺菌設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱（37 C）、90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿、三角瓶（300ml, 500ml）、移液管、生物安全罩衣、一次性手套、一次性容器等。4.3 試劑盒運(yùn)輸、貯藏條件及有效期4.3.1 運(yùn)輸條件試劑盒應(yīng)在28c條件下運(yùn)輸。4.3.2 貯藏條件及保質(zhì)期復(fù)溶前：所有試劑應(yīng)按相應(yīng)要求貯藏。復(fù)溶后：FPTB基本培養(yǎng)基（試劑 A）、瓊脂培養(yǎng)基（試劑 G）貯藏于25c下，有效期4周；FPTB完全培養(yǎng)基（試劑 C）貯藏于28C,有效期4周；噬菌體（試劑D）溶液，敏感細(xì)胞（試

7、劑 E）溶液，殺病毒劑（試劑 F）溶液均貯藏于2 8 C,有效期7天。5 .試劑盒中試劑復(fù)溶及其它試劑配制試驗(yàn)前，按如下要求復(fù)溶試劑盒中所含試劑，并按要求貯存。5.1 試劑盒中試劑配制5.1.1 FPTB 培養(yǎng)基 （試齊IA）將袋裝試劑A加入270 ml蒸儲(chǔ)水中，充分混勻，溶解，121c滅菌10min,冷卻至室 溫后使用。無(wú)菌試劑 A溶液置于25c下貯存，有效期 4周。如試劑A溶液污染（渾濁）， 則棄用。5.1.2 FPTB生長(zhǎng)補(bǔ)充劑（試劑 B）5.1.3 FPTB完全培養(yǎng)基（試劑 C）無(wú)菌條件下，將試劑 B （一瓶）加至無(wú)菌已冷卻的試劑A溶液中，制得試劑 C溶液。試劑C溶液貯存于28C,有效

8、期4周。如試劑C溶液污染（渾濁），則棄用。5.1.4 Actiphage 噬菌體（試劑 D）加1.1 ml無(wú)菌試劑C溶液于試劑D瓶中，溶解，制得試劑D溶液。試劑D溶液貯存 于28C,有效期7天。5.1.5 敏感細(xì)胞（試劑 E）加11ml無(wú)菌試劑C溶液于試劑E瓶中，溶解，制得試劑E溶液。試劑E溶液貯存于28C,有效期7天。5.1.6 殺病毒劑（試劑 F）加5 ml無(wú)菌蒸儲(chǔ)水于試劑 F瓶中，溶解，制得試劑F溶液。試劑F溶液貯存于28 C , 有效期7天。貯存過(guò)程中，試劑 F溶液可能褪色或產(chǎn)生沉淀，但不影響其使用。5.1.7 FPTB瓊脂培養(yǎng)基（試齊1J G）將袋裝試劑G加入60 ml蒸儲(chǔ)水中，充分

9、混勻，加熱溶解，121c滅菌10min,冷卻至55±2C時(shí)使用。無(wú)菌試劑 G置于25c條件下貯存，有效期 4周。再次使用則需加熱 融化，冷卻至55±2C時(shí)使用，重融次數(shù)不得超過(guò)3次。5.2 其它試劑配制NALC-NaOH （或3%NaOH）消化液：見(jiàn)備注。0.067M 磷酸鹽緩沖液 pH6.8 :分別稱取 91.2g KH 2PO4（分子量136.09）, 240g Na2HPO4 12H2O（分子量358.14）,將兩者混合，溶于 2L蒸儲(chǔ)水中，使用時(shí)稀釋 10倍后高 壓滅菌。6、注意事項(xiàng)1.1 安全注意事項(xiàng)1.1.1 由于臨床標(biāo)本中可能含有病原體，如 MTB、HBV和H

10、IV ,因此所有操作及潛伏病 原體的培養(yǎng)過(guò)程必須符合相關(guān)安全操作規(guī)程，如在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作。采取相應(yīng)的安全防護(hù)措施，包括手套、生物安全罩衣、口罩等，必須按地方法律法規(guī)要求處理檢測(cè)廢棄物及 處理實(shí)驗(yàn)室事故。1.1.2 必須采取適當(dāng)措施保護(hù)破損皮膚，創(chuàng)口不得直接接觸標(biāo)本或暴露在外，避免潑濺粘液。1.1.3 實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)禁止進(jìn)食、喝水、化妝，不得貯存、烹制食品。1.1.4 禁止用口直接接觸移液儀器。1.1.5 處理臨床標(biāo)本及傳染性材料時(shí)需使用一次性手套，操作完成后要洗手。1.2 技術(shù)注意事項(xiàng)1.2.1 試驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本使用說(shuō)明，并嚴(yán)格按使用說(shuō)明操作。1.2.2 試驗(yàn)前需將所有試劑或標(biāo)本回復(fù)至室溫。1

11、.2.3 反應(yīng)管為一次性反應(yīng)管；試驗(yàn)前檢查試劑，確保所有試劑均能滿足試驗(yàn)要求，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，切勿將剩余試劑倒回試劑瓶中。1.2.4 試劑應(yīng)按相關(guān)要求貯存、運(yùn)輸，不得凍融復(fù)溶后試劑C溶液、試劑D溶液、試劑E溶液、試劑F溶液；試劑G重融不得超過(guò)三次。1.2.5 不得使用超過(guò)有效期、污染試劑，請(qǐng)勿將不同批次的試劑混合使用。1.2.6 在所有試劑準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，都必須采用無(wú)菌操作技術(shù)，測(cè)試過(guò)程不得使用任何 污染試劑及儀器。7 .操作流程7.1 標(biāo)本處理FASTPlaqueTBTM測(cè)試方法適于檢測(cè)痰液、胸腹水、尿、腦脊液等活菌標(biāo)本中的活 MTB。痰液標(biāo)本需先經(jīng)消化和去污染處理，再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。7.1.1

12、 挑取約13 ml痰液于50ml無(wú)菌有蓋離心管中， 加等體積（或根據(jù)痰液濃稀程度酌情調(diào)整）NALC-NaOH （或3%NaOH）消化液。（胸腹水同痰標(biāo)本處理；尿液 4000rpm離心15min取沉淀后同痰液標(biāo)本處理；菌株在 1 個(gè)麥?zhǔn)蠞舛然A(chǔ)上稀釋1000倍后不需再處理；腦脊液不需處理）7.1.2 漩渦振蕩，打散痰液，室溫孵育15min。7.1.3 力口 PBS緩沖?至45ml, 4000rpm離心15min,棄去上清夜；7.1.4 力口 15 ml C液，重懸下層沉淀，4000rpm離心15min,棄去上清液。7.1.5 加1 ml C液，重懸沉淀物，無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至反應(yīng)管中，將反應(yīng)管放置于

13、37c培養(yǎng)1824h。（如添加NOA去污染劑，可取得更好效果）7.2 檢測(cè)過(guò)程7.2.1 按照8.1所述制備陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。7.2.2 分別加100ul試劑D溶液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及標(biāo)本中，輕輕搖晃，確保試管 內(nèi)容物位于試管底部，37c孵育60min。7.2.3 分別加100ul試劑F溶液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及標(biāo)本中，充分混勻（確保殺病毒 劑與反應(yīng)管內(nèi)壁完全接觸），置于室溫56min （嚴(yán)格控制時(shí)間）。7.2.4 分別加5 ml C液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及標(biāo)本中，顛倒混勻一次。7.2.5 分別加1 ml試劑E溶液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及標(biāo)本中。7.2.6 將標(biāo)本、陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照分別倒入

14、相應(yīng)的培養(yǎng)皿。7.2.7 立即將冷卻至55±2C的試劑 G 5ml于培養(yǎng)皿中快速混勻。置于室溫定型。7.2.8 平放于37c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1824h判讀結(jié)果。8 .結(jié)果8.1 質(zhì)量控制建議采用以下推薦程序，以確保每次試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。每次測(cè)試應(yīng)設(shè)置陰性、 陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)照的處理應(yīng)與待檢標(biāo)本一致，參見(jiàn)檢測(cè)流程（7.2）。8.1.1 陰性對(duì)照無(wú)菌條件下，取1 ml C液于反應(yīng)管內(nèi)，標(biāo)為“陰性對(duì)照”。8.1.2 陽(yáng)性對(duì)照取50ul試劑E溶液用C溶液稀釋106倍，取1ml稀釋后溶液于反應(yīng)管，標(biāo)為“陽(yáng)性 對(duì)照”。8.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)FASTPlaqueTBTM檢測(cè)質(zhì)控（對(duì)照）,噬菌斑數(shù)應(yīng)在如下范圍：

15、陽(yáng)性對(duì)照>20個(gè)噬菌斑陰性對(duì)照<10個(gè)噬菌斑FASTPlaqueTBTM檢測(cè)臨床標(biāo)本，噬菌斑數(shù)應(yīng)在如下范圍：陽(yáng)性結(jié)果R 50個(gè)噬菌斑陰性結(jié)果 19個(gè)噬菌斑可疑結(jié)果2050個(gè)噬菌斑備注:醫(yī)院如有條件推薦用以下消化液：痰液標(biāo)本的消化和去污染應(yīng)按照臨床彳生物操作手冊(cè)中所描述的N-乙酰-L-半胱氨酸氫氧化鈉法進(jìn)行。需要下列試劑：4%氫氧化鈉溶液2.9%枸檬酸鈉溶液N-乙酰-L-半胱氨酸粉末上述溶液用蒸儲(chǔ)水配制，在高壓鍋121c 15min無(wú)菌消毒后，儲(chǔ)存在 30c以下。配制好4%NaOH和2.9%枸檬酸鈉1:1的混合液。將0.5g的NALC加到100ml的溶液中（0.5%w/v）。 NAL

16、C 一旦被加進(jìn)去此溶液在 28c可穩(wěn)定保存24h （根據(jù)實(shí)際的使用情況而配制量）。在沒(méi)有50ml離心管的條件下，可用 15ml的有蓋離心管，具體步驟如下：a：取標(biāo)本12 ml于離心管中，加11.5倍體積消化液；b：旋渦振蕩打散標(biāo)本（要確保徹底打散），室溫孵育15min;c：加PBS補(bǔ)滿,4000rpm離心15min ,棄去上清夜;d:再加PBS補(bǔ)滿，混勻后4000rpm離心15min ,棄去上清夜；d:再加C液補(bǔ)滿，混勻后 4000rpm離心15min ,棄去上清夜；e：加1ml C液，打散沉淀（可用1ml的一次性槍頭輕輕的沖洗幾次，這樣打散的效果較好），無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中。9 .常見(jiàn)問(wèn)

17、題解答為更有效地說(shuō)明FASTPlaqueTB試劑盒檢測(cè)結(jié)果，質(zhì)量控制噬菌斑數(shù)量必須預(yù)設(shè)范 圍內(nèi)。下表為一般情況下，檢測(cè)結(jié)果不在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)的主要原因。常見(jiàn)錯(cuò)誤原因采取措施?陰性對(duì)照噬菌斑數(shù) 大于10個(gè)汆病毒劑不足攪拌不充分，未殺 火所有未感染的噬菌 體?請(qǐng)參閱檢測(cè)過(guò)程(7.2)培養(yǎng)基或儀器設(shè)備被MTB、敏感細(xì) 胞污染或分枝桿菌噬 菌體污染?檢查污染源?棄用所有可疑污染 試齊?對(duì)所后可以儀器設(shè)備重金1九菌化處理?陽(yáng)性對(duì)照噬菌斑數(shù)少于20個(gè)陽(yáng)性對(duì)照制備過(guò) 程中，敏感細(xì)胞稀釋 倍數(shù)太高?請(qǐng)參考質(zhì)量控制(8.1)使用過(guò)期的敏感 細(xì)胞制備陽(yáng)性對(duì)照?請(qǐng)參考貯藏條件和 有效期(4.3.2)過(guò)量使用殺病毒 劑或

18、殺病毒劑處理時(shí) 間過(guò)長(zhǎng)?在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用 正確濃度的殺病毒劑(7.2)噬菌體過(guò)期?請(qǐng)參考貯藏條件和有效期(4.3.2)噬菌體加入量不 足?請(qǐng)參考檢測(cè)流程(7.2)?雜菌生長(zhǎng)，平皿中 敏感細(xì)胞模糊不 清，噬菌斑不清晰標(biāo)本消毒處理不 夠?請(qǐng)參考樣品準(zhǔn)備(6.1)標(biāo)本從采集到檢 測(cè)時(shí)間間隔較長(zhǎng)，導(dǎo) 致微生物過(guò)度生長(zhǎng)?請(qǐng)參考當(dāng)?shù)貥?biāo)本采 集和運(yùn)送相關(guān)規(guī)定?陽(yáng)性率比預(yù)期值過(guò) 低標(biāo)本處理過(guò)程太 粗糙，如NaOH濃度 過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 等?請(qǐng)參考標(biāo)本處理(7.1),嚴(yán)格按要求處理標(biāo)本?瓊脂凝結(jié)性不好 C液未回復(fù)到室溫瓊脂溫度過(guò)低?按操作說(shuō)明進(jìn)行(7.2)10 .試劑盒的局限性實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，存在某些非人力控

19、制的影響因素，因而檢測(cè)結(jié)果并非絕對(duì)準(zhǔn)確。10.1 FASTPlaqueTB試劑盒檢測(cè)MTB結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于所采集標(biāo)本的質(zhì)量、數(shù)量、標(biāo)本的貯存方法及標(biāo)本中活MTB的數(shù)量，嚴(yán)格遵循測(cè)試程序?qū)y(cè)試結(jié)果的正確性起關(guān)鍵作用。10.2 檢測(cè)MTB含量很少的標(biāo)本時(shí)，細(xì)菌聚集可能影響檢測(cè)的靈敏性。10.3 建議使用 NALC-NaOH(或3% NaOH)方法消化痰標(biāo)本。其它消化方法未經(jīng)本公司充 分評(píng)估。其它某些去污染試劑可能對(duì)檢測(cè)效率有負(fù)面影響。10.4 抗跨治療可能影響削弱本試劑盒的檢測(cè)效率，對(duì)此類病例的臨床結(jié)論請(qǐng)參照有關(guān)臨 床資料。10.5 痰標(biāo)本含血量過(guò)大(大于 10%)可能削弱本試劑盒的檢測(cè)效率。10.6 FASTPlaqueTBTM檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中可能包含結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌非洲分枝桿菌或田鼠分枝桿菌；有關(guān)未去污染直接培養(yǎng)標(biāo)本的研究表明，某些非結(jié)核分枝桿菌也可能產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。10.7 與所有診斷測(cè)試方法