PCR發(fā)展歷程綜述

1、PCR技術(shù)發(fā)展歷程綜述摘要：PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下。以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)。通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。本文簡(jiǎn)要敘述了PCR技術(shù)的發(fā)展歷程及現(xiàn)在所發(fā)展起來(lái)的相關(guān)技術(shù)。關(guān)鍵詞：PCR技術(shù) 變性 退火 延伸1.PCR技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史1971年Khorana等最早提出PCR理論：“DNA變性解鏈后與相應(yīng)引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。因當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟、熱穩(wěn)定DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)及寡聚核苷酸引物合成仍處于手工

2、和半自動(dòng)階段，核酸體外擴(kuò)增設(shè)想似乎不切實(shí)際，且Smith等已發(fā)現(xiàn)了DNA限制性?xún)?nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，Khorana等的早期設(shè)想被忽視。1985年Mullis等用大腸桿菌DNA聚合酶工Klenow片段體外擴(kuò)增哺乳動(dòng)物單拷貝基因成功，1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專(zhuān)利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專(zhuān)利號(hào)4,683,202 ），Mullis是第一發(fā)明人；1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者。但當(dāng)時(shí)Mullis所使用的大腸桿菌聚合酶1的片段Klenow存在一些缺陷：Klenow酶不耐熱，在對(duì)DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶的鈍

3、化，因此需要每完成一個(gè)擴(kuò)增周期增加一次酶。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，提高擴(kuò)增DNA片段的均一性，1988年Saiki等從溫泉中分離的一種水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶，使擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和效率大大提高，并簡(jiǎn)化了操作程序，最終實(shí)現(xiàn)了DNA擴(kuò)增的自動(dòng)化，迅速推動(dòng)了PCR的應(yīng)用和普及?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、植物病理學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的研究。最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟,但在隨后的幾十年里，PCR技術(shù)被不斷改進(jìn)，它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片斷。短短幾十年，該技術(shù)已經(jīng)成為最常用也最重要的

4、分子生物學(xué)技術(shù)之一，其應(yīng)用范圍從基本的基因擴(kuò)增，擴(kuò)展到基因克隆、基因改造、傳染病源分析、遺傳指紋鑒定等，甚至擴(kuò)展到許多非生物領(lǐng)域。2.PCR技術(shù)的原理PCR 技術(shù)是根據(jù)待擴(kuò)增的已知 DNA 片段序列，人工合成與該 DNA 2 條鏈末端互補(bǔ)的 2 段寡核苷酸引物，在體外將待檢 DNA 序列（模板）在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 的整個(gè)技術(shù)過(guò)程經(jīng)若干個(gè)循環(huán)組成，一個(gè)循環(huán)包括連續(xù)的 3 個(gè)步驟：第 1 步是高溫條件下的 DNA 模板變性，即模板 DNA在 9394 的條件下變性解鏈；第 2 步是退火，即人工合成的 2 個(gè)寡核苷酸引物與模板 DNA 鏈 3端經(jīng)降溫至 55 退火；第 3 步是延伸，即在

5、4 種 dNTP 底物同時(shí)存在的情況下，借助 TaqDNA 聚合酶的作用，引物鏈將沿著 5-3方向延伸與模板互補(bǔ)的新鏈。經(jīng)過(guò)這個(gè)循環(huán)后，合成了新鏈，可將其作為 DNA 模板繼續(xù)反應(yīng)，由此循環(huán)進(jìn)行。循環(huán)進(jìn)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán) 2530 次，DNA 可擴(kuò)增 l00 萬(wàn)200 萬(wàn)倍。PCR 反應(yīng)的步驟很簡(jiǎn)單，但是具體的操作是復(fù)雜的，如退火溫度的確定、延伸時(shí)間的長(zhǎng)短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，以避免假陰性或假陽(yáng)性等情況的產(chǎn)生。3.PCR技術(shù)進(jìn)步關(guān)鍵3.1熱循環(huán)儀市場(chǎng)上有眾多的產(chǎn)品, 在質(zhì)量和技術(shù)上首推 PE及MJ reasearch。

6、總的發(fā)展趨勢(shì)是 1) 無(wú)油操作, 要求的反應(yīng)體積小, PE 2400 可做小至 5uL 的反應(yīng); 2) 升降溫速度快, PE9700 可達(dá)到 3.5/ s, 溫控精度及靜態(tài)樣品溫度均衡性高, 這一點(diǎn)是通過(guò)控制反應(yīng)管內(nèi)的溫度, 而非加熱塊的溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)的; 3) 界面友好,操作靈活, 顯示直觀, 允許多用戶(hù)。此外, 還有幾種特殊用途的 PCR 儀: 大容量 PCR 儀, The Tetrad( MJResearch) 可同時(shí)做 1536 個(gè)反應(yīng), 適合于高通量實(shí)驗(yàn)室的要求; 實(shí)時(shí)定量 PCR, ABI PRISMTM5700( PE) 能對(duì)PCR 過(guò)程做到實(shí)時(shí)定量監(jiān)控, 閉管操作, 無(wú)污染, 無(wú)須

7、擴(kuò)增后處理; 梯度 PCR 儀, 例如, Eppendorf 的產(chǎn)品, 可在一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi), 一次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中快速地測(cè)定最佳變性溫度和退火溫度, 節(jié)省時(shí)間, 減輕實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度;PCR 儀的加熱部分和控制部分分離, Remote Alpha DockTMSystem( RAD MJ Research) 的這兩部分可以分開(kāi)遠(yuǎn)達(dá) 3m 節(jié)省實(shí)驗(yàn)室空間, 便于進(jìn)行自動(dòng)化操作。同時(shí)有多種形式的加熱部分可供選擇, 可以滿(mǎn)足不同的要求。3.2引物設(shè)計(jì)與合成引物的設(shè)計(jì)可通過(guò)計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)。網(wǎng)上有許多提供免費(fèi)在線引物設(shè)計(jì)服務(wù)的網(wǎng)址和軟件，例如在線版的Primer3.0，以及Primer5.0等軟件，設(shè)計(jì)好的引物則完全

8、由專(zhuān)業(yè)公司來(lái)合成, 合成的引物一般進(jìn)行 PAGE 純化,而且可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求對(duì)引物采取不同的修飾處理。3.3DNA聚合酶系已經(jīng)發(fā)展出了多種具有各種不同特性的聚合酶和酶反應(yīng)體系( 表 1) 。結(jié)合優(yōu)化的緩沖液條件,DNA 聚合酶已具有更高的特異性,敏感性,可以擴(kuò)增出更長(zhǎng)的產(chǎn)物,并且可成功地用于富含 GC 的模板的擴(kuò)增。目前已開(kāi)發(fā)出了一系列可滿(mǎn)足不同需求的DNA 聚合酶試劑盒,簡(jiǎn)化了 PCR 操作,提高了實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。4.PCR相關(guān)技術(shù)4.1常規(guī)RT-PCR技術(shù)由于目前常利用cDNA來(lái)研究基因的功能,而cDNA是由mRNA反轉(zhuǎn)錄而成。所以采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcri

9、ption-polymerase chain reaction, RT-PCR)可擴(kuò)增大量cDNA。主要包括兩個(gè)步驟,一個(gè)是反轉(zhuǎn)錄,另一個(gè)就是PCR,首先提取RNA并純化,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。然后以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。反應(yīng)過(guò)程的第一步是從細(xì)胞中提RNA,并分離出 mRNA。第二步以mRNA為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA。第三步以cDNA為模板,用PCR對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增。最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA

10、探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。4.2多重 PCR（mutiplex PCR）技術(shù) PCR 技術(shù)的一種，為同一管中加入多對(duì)特異性引物，與 PCR 管內(nèi)的多個(gè)模板反應(yīng)，在一個(gè) PCR 管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo) DNA 分子。多重 PCR技術(shù)可以擴(kuò)增一個(gè)物種的一個(gè)片段，也可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)物種的不同片段。在同一反應(yīng)體系中，多重 PCR 技術(shù)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增時(shí)，引物間的配對(duì)、引物間的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增等會(huì)對(duì)擴(kuò)增效果產(chǎn)生重要影響。一方面，如果能選擇適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可極大地提高多重 PCR 的擴(kuò)增效果。主要包括退火溫度、退火及延伸時(shí)間、PCR 緩沖液成分、dNTP 的用量、引物及模板的量等。另一方面，

11、DNA 的抽提質(zhì)量也影響多重 PCR 擴(kuò)增效率，如 DNA 抽提不干凈或降解都將影響PCR 擴(kuò)增效果。4.3反向PCR技術(shù)反向PCR(reverse PCR)，又稱(chēng)為染色體緩移(chrornosme walking)，它是指利用在已知序列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)此段DNA進(jìn)行酶切，在DNA連接酶作用下自連形成環(huán)狀DNA分子，然后利用方向合適并與已知序列兩端互補(bǔ)的引物，以連接成環(huán)的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到已知序列的旁側(cè)DNA片段。與常規(guī)PCR技術(shù)相比。反向PCR優(yōu)勢(shì)突出，但它需要從許多酶中選擇限制酶?；蛘哒f(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切。另外，由于大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序

12、列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)存在這些序列。從而導(dǎo)致反向PCR得到的探針與多個(gè)基因序列雜交，影響擴(kuò)增效果。4.4巢式PCR(嵌套PCR)技術(shù)這是一種對(duì)PCR的優(yōu)化模式,不受平臺(tái)效應(yīng)的限制,而且比單一的一對(duì)引物PCR擴(kuò)增靈敏度特異性高1000倍。由兩輪PCR擴(kuò)增和利用兩對(duì)引物組成,其中第二對(duì)引物是在第一對(duì)引物的內(nèi)部,第一輪PCR的產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板,增強(qiáng)了產(chǎn)物的特異性。反應(yīng)過(guò)程的第一步是引物的設(shè)計(jì),原則與常規(guī)PCR相同,只不過(guò)是設(shè)計(jì)兩對(duì)嵌套式引物。第二步所用的模板通常都是反轉(zhuǎn)錄而來(lái)的cDNA,經(jīng)過(guò)兩次PCR。第三步檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。此反應(yīng)大多應(yīng)用在當(dāng)模板DNA較少時(shí)

13、,用一次PCR難以得到滿(mǎn)意的結(jié)果,用巢式PCR能得到很好的效果。4.5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)1996 年，學(xué)者經(jīng)過(guò)研究，在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，首創(chuàng)了實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)和其他基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)基于傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，還具有實(shí)時(shí)性、準(zhǔn)確性、無(wú)污染，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作和多重反應(yīng)，是 PCR 技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍。熒光定量 PCR 技術(shù)最大的特點(diǎn)是能將熒光基團(tuán)加入到PCR 反應(yīng)體系中，借助于熒光信號(hào)，累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)這一特點(diǎn)是常規(guī) PCR 技術(shù)所不具有的，因

14、為其對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)不能進(jìn)行隨時(shí)的檢測(cè)。常規(guī) PCR 技術(shù)的擴(kuò)增終產(chǎn)物需要在凝膠電泳等條件下才能進(jìn)行，無(wú)法對(duì)起始模板進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，而熒光定量 PCR 技術(shù)的反應(yīng)進(jìn)程可以根據(jù)熒光信號(hào)的變化做出準(zhǔn)確的判斷。一個(gè) PCR 循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，定量 PCR 儀可以收集 1 個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化可以反映產(chǎn)物量的變化情況，這樣就可以得到 1 條熒光擴(kuò)增曲線。熒光信號(hào)在指數(shù)擴(kuò)增階段 ，PCR 產(chǎn)物熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，然后進(jìn)行定量分析。另外還有多種PCR相關(guān)的技術(shù),如不對(duì)稱(chēng)PCR,MSP甲基化特異PCR,免疫PCR,錨定PCR,PACE-cDNA末端的快速擴(kuò)增可根據(jù)研究目

15、的不同作相應(yīng)的選擇。5.展望PCR作為一項(xiàng)“革命性的技術(shù)”，不僅推動(dòng)了遺傳與分子生物學(xué)的發(fā)展而且，在其它領(lǐng)域科學(xué)家的努力與創(chuàng)新下。其不斷與該領(lǐng)域的核心技術(shù)相結(jié)合，極大地推動(dòng)了此領(lǐng)域的發(fā)展。傳統(tǒng) PCR 技術(shù)以及衍生出來(lái)的新型 PCR 技術(shù)自面世以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)與完善，熒光定量 PCR 技術(shù)將會(huì)逐漸完善并廣泛應(yīng)用。多重 PCR 技術(shù)在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)微生物檢測(cè)中具有重要作用；未來(lái)的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進(jìn)樣品前處理技術(shù)等方面，總之，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步PCR技術(shù)必將得到新的發(fā)展，以之為基礎(chǔ)的新技術(shù)將不斷出現(xiàn)。參考文獻(xiàn)

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