細(xì)胞線粒體跨膜電位的檢測

1、細(xì)胞線粒體跨膜電位的檢測那么細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn) .JC- 15,5 ,6,6 -tetrachloro-1,1 ,3,3 -tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide是一種陽離子脂質(zhì)熒光染料 , 可作為檢測線粒體跨膜電位指示劑 .JC-1 有單體和多聚體兩種存在狀態(tài) , 在低濃度時以單體的形式存在 高濃度時以多聚體形式存在 ,兩者的發(fā)射光譜不同 , 但均可在流式細(xì)胞儀綠色 FL-1 通道 檢測出綠色熒光 ,JC-1 可透過正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi) , 正常健康線粒體的膜電位 y具有極性，JC-1依賴于的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體 內(nèi)

2、形成多聚體,多聚體發(fā)射光為紅色熒光；可被流式細(xì)胞儀的紅色FL-2通道檢測到，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時 ,線粒體跨膜電位被去極化,JC-1 從線粒體內(nèi)釋放 , 紅光強度減弱 , 以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光 . 根椐這 一特征檢測線粒體膜電位的變化 .載玻片、蓋玻片熒光顯微鏡觀察需用、PBS滅菌去離子水使用考前須知1 微量試劑取用前請離心集液 .2 JC-1 避光保存及使用 .4 .對PH變化過于敏感的細(xì)胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌,或延長觀測時間 5流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化受到多種因素的影響 , 因誘導(dǎo)劑、細(xì)胞株 類型,作用時間的不同而熒光強度比例都有不同 ,因此沒有通用

3、標(biāo)準(zhǔn)的補償設(shè)門指南 ,因此 每個試驗需設(shè)陰性及陽性對照組進(jìn)行熒光補償及設(shè)門 .6 組織需先制備單細(xì)胞懸液或提取純化線粒體前方可進(jìn)行檢測 , 可選用凱基細(xì)胞懸 液制備試劑盒KGA829或線粒體提取試劑盒KGA827. 操作方法素, stau rosporine ,誘導(dǎo)適當(dāng)時間后經(jīng)其它檢測如 AnnexinV 或 Caspase 3 活性 證實確有凋亡產(chǎn)生】，收集細(xì)胞；2 .用PBS洗滌細(xì)胞二次離心 2000rpm,5min ,收集 不多于1X 106的細(xì)胞；3 . 取 100 口 L 10 x Incubation Buffer力口 900 口 L 滅菌去離子水稀釋成 1 xIncubation

4、 Buffer,混勻并預(yù)熱至 37C；4 . 吸取 500 口 L 1 x Incubation Buffer, 參加 1 口 L JC-1,渦旋混勻配成 JC-1 工作液； 【因 JC-1 在水中的溶解度很小 , 所以可以通過離心的方法( 10,000rpm,1min )去除 不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾】5 .取500 口 L JC-1工作液將細(xì)胞均 勻懸浮,37 C ,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1520min；6 室溫離心( 2000rpm,5min )收集細(xì)胞 , 用 1x Incubation Buffer 洗兩次；7 . 吸取 500 口 L 1 x Incubati

5、on Buffer重新懸浮細(xì)胞；8 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀分析 .羅丹明 123 染色檢測線粒體膜電位外觀：紅棕色粉末化學(xué)名： Rh123 羅丹明 123別名： Rhodamine 123; Rh123分子式： C21H17CLN2O3分子量： 380.82配制：羅丹明123粉劑用甲醇配成1mg/mlde儲藏液，染色時用 DPBS緩沖液將其稀釋 為所需濃度 保存：冰箱 -20 度避光一、檢測原理：羅丹明 123(Rhodamine 123)是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體 跨膜電位的指示劑。其在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì), 熒光強度減弱或消失。而在凋亡發(fā)

6、生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起 線粒體跨膜電位(AWm)的崩潰，Rh123重新釋放出線粒體，從而發(fā)出強黃綠色熒光，可 用熒光顯微鏡、熒光光度計或流式細(xì)胞儀檢測，通過熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位 的變化和凋亡的發(fā)生，可用于培養(yǎng)的細(xì)胞或從組織中提取出的線粒體的膜電位檢測。二、使用方法：1 細(xì)胞染色及分析(1) 培養(yǎng)細(xì)胞 1x 106/mL 重懸于培養(yǎng)基中；(2) 參加羅丹明123染液0.1 口 g/mL50 口 g/mL (根椐細(xì)胞種類不同而濃度不同， 一般 3 10 口 g/mL)；(3) 37C, 5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育130 min (根椐細(xì)胞種類不同而不同

7、，一般10 min；(4) 離心以培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次；2 組織提取的線粒體染色及分析(1) 按常規(guī)方法提取的線粒體，用適量的1 xAssays Buffer (將5XAssays Buffer 用水稀釋 5倍)重懸；(2) 常規(guī)方法進(jìn)行蛋白含量測定后，用1 x Assays Buffer調(diào)配成3mg/mL的線粒體 溶液；(3) 取 2mL lx Assays Buffer 和 1mL線粒體溶液；(4) 參加適量待測化合物(同時設(shè)空白對照組)，250C保溫min;(5) 參加羅丹明123染液10 口 L;(6) 熒光光度計檢測：上述混合液全部參加石英比色皿中，置于250C下測定，激發(fā) 波長488505nm 發(fā)射波長530nm 連續(xù)