動物組織蛋白提取

1、實驗一 動物組織蛋白質(zhì)的提取【目的要求】1、掌握動物組織蛋白質(zhì)的提取方法。2、了解動物組織蛋白質(zhì)提取的原理?！緦嶒炘怼?由于蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的差異很大，即或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料 不同，使用方法差別也很大， 且又處于不同的體系中， 因此不可能有一個固定的 程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部分基本手段還是共同 的，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋 白質(zhì)溶于乙醇、 丙酮及丁醇等有機溶劑中。 因此可采用不同溶劑提取、 分離及純 化蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異， 主要取決于蛋白分子中非極性疏 水基團與極性親水基團的比例， 其次取決

2、于這些基團的排列和偶極矩。 故分子結(jié) 構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白質(zhì)溶解差異的內(nèi)因。溫度、pH、離子強度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。 提取蛋白質(zhì)時常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用， 將細胞內(nèi)蛋 白質(zhì)提取出來， 并與其它不需要的物質(zhì)分開。 但動物材料中的蛋白質(zhì)有些以可溶 性的形式存在于體液 （如血漿、 消化液等）中，可以不必經(jīng)過提取直接進行分離。 蛋白質(zhì)中的角蛋白、 膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì)， 只需要適當?shù)娜軇┫慈タ扇?性的伴隨物， 如脂類、 糖類以及其他可溶性蛋白質(zhì)， 最后剩下的就是不溶性蛋白 質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)細胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出 來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取

3、液。本實驗采用CWBio公司的蛋白抽提試劑盒（該試劑盒帶有蛋白酶抑制劑混合 物，可有效避免蛋白提取過程中蛋白的降解。）提取動物組織總蛋白?！驹噭┢鞑摹縿游锝M織、蛋白提取試劑盒、1.5 ml離心管、-20C儲存的冰塊【操作步驟】1 、 動物肝臟直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少 量液氮，再研磨，如此三次。2、稱量約40mg研磨組織，加入200 ul預冷的組織蛋白抽提試劑，冰上孵育20分鐘。3、10,000耳離心15分鐘。4、收集上清，進行下一步的實驗?！咀⒁馐马棥吭谡麄€制備過程中使組織始終置于冰上，以防蛋白質(zhì)的降解實驗二蛋白質(zhì)的定量（BCA法）【目的要求】掌握BCA法測定

4、蛋白質(zhì)含量的原理和方法?！緦嶒炘怼緽CA（ Bicincho ninic Acid）蛋白定量法是目前廣泛使用的蛋白定量方法之一， 可對蛋白質(zhì)進行快速、穩(wěn)定、靈敏的濃度測定。其原理是在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分 子中的肽鏈結(jié)構(gòu)能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將 Cu2+還原成Cu+0 BCA試劑 可敏感特異地與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物。在 562 nm處有高的光 吸收值，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比， 可根據(jù)吸收值的大小來測定蛋白質(zhì)的 含量。用已知濃度的蛋白作為標準品制作標準曲線，根據(jù)標準曲線查出未知蛋白濃度。本實驗采用CWBio公司的BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。 本試劑盒含 有牛血

5、清白蛋白（BSA）溶液作為蛋白質(zhì)標準品溶液，測定范圍為202000ug/ml。【試劑器材】BCA蛋白定量試劑盒、試管及試管架、吸管、分光光度計?！静僮鞑襟E】1、制作標準曲線AvV 口呂號稀釋液用量（ul）BSA標準品用量（ul）BSA標準品最終濃度（ug/ml）101002000220020010003200200 （從2管中取）5004200200 （從3管中?。?505200200 （從4管中?。?256400100 （從5管中?。?5720000 （空白）2、 稀釋樣品溶液：樣品1:取20微升蛋白樣品加入180微升稀釋液。 樣品2:取 10微升蛋白樣品加入190微升稀釋液。3、配置BCA

6、工作液：取試劑A 20ml，加入試劑B 0.4 ml，混勻。（注意：新配制的 BCA工作液室溫密封條件下可穩(wěn)定保存 24小時。）4、 向步驟1和步驟2的試管中各加入2 ml BCA工作液，充分混勻，37C水浴中孵 育30分鐘。5、將各管冷卻至室溫。6用分光光度計測定562nm處每個樣品及BSA標準品的吸光值，同時做好記錄。 （注意：BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。因此所 有樣品的測定需在10分鐘內(nèi)完成，否則會影響蛋白定量的準確度。）7、繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。（注意：數(shù)據(jù)處理時需要去除明顯錯誤的值。未知樣品濃度可以從標準曲線中查得，實際濃度需要乘以樣品的稀釋

7、倍數(shù)。 如果是計算機繪制得曲線，可以從計算機給出的線性方程式計算出未知樣品的濃 度。）3實驗三 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)【實驗目的】1、掌握掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的技術(shù)和原理。2、學習蛋白質(zhì)垂直板電泳技術(shù)【實驗原理】聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙 烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)進行蛋白質(zhì)或核酸分離的一種電泳方法。 聚丙烯酰胺凝 膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide,簡稱ACR）和交聯(lián)劑N, N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide簡稱BIS）在催化劑的作用下聚

8、合交聯(lián)而成的三 維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 通過改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例, 可以得到不同孔徑的凝 膠,用于分離分子量大小不同的物質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：（1）化學聚合：催化劑采用過硫酸銨,加速劑為 N,N,N,N 四甲基乙二胺（簡 稱TEMED ）。通?？刂七@二種溶液的用量，使聚合在1小時內(nèi)完成。（2）光聚合：通常用核黃素為催化劑,通過控制光照時間、強度控制聚合時間,也可加入 TEMED 加速反應。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類： 第一類為連續(xù)的凝膠 （僅有分離膠） 電泳； 第二類為不連續(xù)的凝膠（濃縮膠和分離膠）電泳。一般地,不連續(xù)聚丙烯酰胺凝 膠電泳有三種效應：電荷效應（電泳物所帶電

9、荷的差異性）； 凝膠的分子篩效應（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致）。濃縮效應（濃縮膠 與分離膠中聚丙烯酰胺的濃度及 pH 的不同,即不連續(xù)性所致） 。因此,樣品分 離效果好,分辨率高。SDS即十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate,簡稱SDS）是陰離子表面 活性劑，它能以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合，形成一種SDS-蛋白質(zhì)復合物。這時，蛋白質(zhì)即帶有大量的負電荷, 并遠遠超過了其原來的電荷, 從而使天然蛋白質(zhì)分 子間的電荷差別降低仍至消除。與此同時，蛋白質(zhì)在 SDS 作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨于一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復合物在電泳時產(chǎn)生的電泳遷移率的差異，僅僅取決于蛋

10、白質(zhì)的分 子量。另外，SDS-蛋白質(zhì)復合物在強還原劑（巰基乙醇）存在下，蛋白質(zhì)分子 內(nèi)二硫鍵被打開，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基。當分子量在15KD 到200KD 之間時，蛋 白質(zhì)的遷 移率和分子 量的對數(shù)呈 線性關(guān)系 ，符合下式： logMW=K-bX ，式中： MW 為分子量， X 為遷移率， k、 b 均為常數(shù)。因此，可 通過蛋白質(zhì)分子量標準蛋白估計目標蛋白分子量。本實驗采用化學聚合法制膠，進行不連續(xù)的凝膠電泳，并用考馬斯亮藍快速 染色，觀察動物組織中的總蛋白。【試劑與器材】（一）試劑1、30%的凝膠貯備液：ACR 30g + Bis 0.8g溶于100 mL去離子水中，用3 號新華濾

11、紙過濾至棕色瓶中，4°C避光貯存（1）。2、1.5mol/L Tris-buffer,pH8.9： Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH2O 至 200 mL）3、1mol/L Tris-HCl, pH6.8 :12.1g Tris base 溶于 40mL ddHzO 中，加 1mol/L HCl96mL, 加水補至 100mL.4、5>Tris-甘氨酸電泳 buffer （pH8.3）:（配 1L） Tris-base 15.1g + 甘氨酸 94g + 5gSDS + H2O至1L （用時稀釋5倍）。5、10% SDS:稱1

12、0克SDS溶解于100mL去離子水中，貯存于室溫中。& TEMED （四甲基乙二胺）：濃度10%，20 mL，4C保存。7、 10% AP （過硫酸銨）：10 mL，新鮮配制，分裝至1.5mL離心管中，20C 保存待用（ 2）。8、 樣品溶解液：內(nèi)含 1% SDS， 1%巰基乙醇， 40%蔗糖或 20%甘油， 0.02%溴 酚藍， 0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL 緩沖液。9、考馬斯亮藍染色液 ：0.05 g考馬斯亮藍R250溶于25 mL異丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O至110 mL，用濾紙過濾除去不溶物。10、脫色液：75 mL冰乙酸 + 50 mL甲醇+ 8

13、75 mL H2O （若只配500 mL， 各物質(zhì)減半）（二）器材電泳儀垂直板電泳槽、電泳板、微量進樣器、染色 /脫色搖床。（三）蛋白電泳1膠板模型的安裝：將玻璃板洗干凈，晾干，備用。制膠時，選擇合適的 玻璃板，組裝膠板模型。2、按下表配方配置分離膠溶液（10 ml，可供兩塊板使用），用手輕搖混勻，小 心將混合液注入準備好的玻璃板間隙中，為濃縮膠留足夠的空間（2.5cm）,輕輕在頂層加入0.5ml去離子水覆蓋，以阻止空氣中氧對凝合的抑制作用。剛加入 水時可看出水與膠液之間有界面， 后漸漸消失，不久又出現(xiàn)界面，這表明凝膠已 聚合。再靜置片刻使聚合完全，整個過程約需 30分鐘（25C室溫）o去離子

14、水30%凝膠貯備1.5mol/L10% SDS:TEMED10% AP （過液Tris-buffer,pH8.9硫酸銨）4.35 ml3 ml2.5 ml100 ul10ul40ul3、濃縮膠的制備：先把已聚合好的分離凝膠上層的水吸去，再用濾紙吸干 殘留的水液。按下列配方制備濃縮膠溶液：混合后將其注入分離膠上端，插入梳 子，小心避免氣泡的出現(xiàn)。去離子水30%凝膠貯備1mol/L10% SDS:TEMED10% AP （過液Tris-HCl,硫酸銨）pH6.83.6 ml0.67 ml0.625ml50 ul10ul40ul4、在濃縮膠聚合的同時，將蛋白樣品與 2x樣品緩沖液等體積混合，置沸水

15、或微量恒溫器（100C）中加熱5分鐘，馬上插入冰上冷卻待用。5、 濃縮膠聚合完全后，將凝膠模板放入電泳槽上固定好，上下槽均加入1X 電泳緩沖液，小心地拔出梳子，檢查有無漏，并驅(qū)除兩玻璃板間凝膠底部的氣泡。6、按次序上樣：用微量進樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液，所加樣品混合 液體積要根據(jù)樣品蛋白濃度而定（1 mg或者20ul/孔），一孔加一個樣品，同時用 已知分子量的標準蛋白作對照。7、電泳：開始時電壓為約100V,待染料濃縮成一條線開始進入分離膠后， 將電壓增到約130V，繼續(xù)電泳直到染料（溴酚藍）抵達分離膠底部，斷開電源。8、剝膠：取下膠板，從底部一側(cè)輕輕撬開玻璃板，用手術(shù)刀切去濃縮膠， 并切

16、去一小角作記號。9、固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿，用考馬斯藍染色液染色并固定， 最好放在搖床緩慢旋轉(zhuǎn) 1-2 小時。10、 脫色：先用水洗去染料，再放入脫色液中浸泡，更換脫色液3-4 次，約 4-8 小時或過夜。11、將脫色后凝膠中的蛋白質(zhì)分離色帶照相或干燥，也可無限期地用塑料袋 封閉在含 20%甘油的水中?！咀⒁馐马椗c提示】（ 1） 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性， 因此稱量時要戴手套。 兩者聚 合后即無毒性， 但為避免接觸少量可能未聚合的單體， 所以建議在配膠和 制板過程中都要帶上手套操作。 另外， 配好的溶液之所以要避光保存， 是 因為此溶液見光極易脫氨基分解為丙烯酸和雙丙烯酸

17、。（2）考馬斯亮藍R-250（三苯基甲烷）染色：每分子含有兩個S03H基團，偏酸 性，結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團上。與不同蛋白結(jié)合呈現(xiàn)基本相同的顏色。檢測靈敏度約為0.2 0.5ug。也可用銀染色：將蛋白帶上的硝酸銀還原成 金屬銀、以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。 此法比考馬斯亮藍靈敏兩個數(shù)量級， 但步驟較復雜。（ 3） 制備聚丙烯酰胺凝膠時， 倒膠后常漏出膠液， 那是因為二塊玻璃板與塑料 條之間沒封緊， 留有空隙， 所以這步要特別留心操作。 有些型號的電泳板 可在模型中直接安裝， 免去了封邊和拆邊的麻煩， 還可以同時制備多塊凝 膠。（ 4） AP 和 TEMED 是催化劑，加入的量要合適，過少則凝膠聚合慢甚至不聚 合，過多則聚合過快，影響倒膠。為避免過快聚合，可將加了催化劑的凝 膠先放在冰中。（ 5） 加熱使蛋白質(zhì)充分變性。（ 6） 兩玻璃板間凝膠底部的大氣泡可阻斷電流，因此必須除去。(7)總量一般不超過20卩