藥物QT間期延長潛在作用非臨床研究技術指導原則 (2014-05-13)

1、附件7藥物QT間期延長潛在作用非臨床研究技術指導原則一、 概述心電圖（ECG）中QT間期（從QRS波群開始到T波結束）反映心室去極化和復極化所需的時間。當心室復極化延遲和QT間期延長，尤其伴有其他風險因素（如低血鉀、結構性心臟病、心動過緩）時，患者發(fā)生室性快速心律失常的風險增加，包括尖端扭轉型室性心動過速（torsade de pointes，TdP）。本指導原則主要是關于評價受試物延遲心室復極化潛在作用的非臨床研究策略，以及對非臨床研究信息的分析和綜合風險性評估。QT間期研究結果可以和其他信息一起，用來闡明藥物作用機制，以及對人體的延遲心室復極化和延長QT間期的風險評估。本指導原則適用于中藥

2、、天然藥物和化學藥物。二、基本原則（一）試驗方法藥物安全藥理學研究技術指導原則中所述的關于研究設計的基本原則和推薦方法，也適用于本指導原則。建議采用體內和體外的方法進行研究。應基于受試物的藥效學、藥代動力學、安全性的特點對研究方法設計、風險性證據(jù)進行個體化分析。（二）執(zhí)行GLP的要求體外試驗建議執(zhí)行藥物非臨床研究質量管理規(guī)范（GLP）規(guī)范，體內試驗遵循GLP，追加研究（Follow-up studies）應在最大可行限度內遵循GLP。（三）受試物中藥、天然藥物：受試物應采用能充分代表臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。應采用工藝路線及關鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應為中試或中

3、試以上規(guī)模的樣品，否則應有充分的理由。應注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質量檢驗報告。由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，否則應提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質量穩(wěn)定性及均勻性。當給藥時間較長時，應考察配制后體積是否存在隨放置時間延長而膨脹造成終濃度不準的因素。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進行試驗。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、有效期、規(guī)格及生產(chǎn)單位?；瘜W藥物：受試物應采用工藝相對穩(wěn)定、純度和雜質含量能反映臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。受試物應注明名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及

4、配制方法等，并提供質量檢驗報告。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、有效期、規(guī)格和生產(chǎn)單位等，并符合試驗要求。在藥物研發(fā)的過程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變化，應進行相應的安全性研究?；瘜W藥物試驗過程中應進行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應進行受試物樣品分析。三、基本內容（一）試驗設計的基本要求1.生物材料應選擇合適的試驗體系和動物種屬。體外研究可采用離體心肌細胞、培養(yǎng)心肌細胞系或克隆的人離子通道的異種表達體系、離體心臟標本。用于體外研究的組織和細胞標本可來源于不同的實驗動物，包括兔、雪貂、豚鼠、犬、豬。當采用原代組織或細胞時，應考慮

5、所用標本的特點及來源，因為離子通道的分布可因組織和細胞類型而不同。用于整體研究的動物包括犬、猴、豬、兔、雪貂以及豚鼠。成年大鼠和小鼠復極化的離子機制不同于包括人在內的大動物種屬（在成年大鼠、小鼠，復極化的主要離子流是Ito），因此用這些種屬的組織或動物是不合適的。實驗動物應符合國家對相應等級動物的質量規(guī)定要求，并具有實驗動物質量合格證明。2.樣本量體外試驗：體外樣本量每組不少于4個平行樣本，一般35個組。體內試驗：試驗組的組數(shù)及每組動物數(shù)的設定，應以能夠科學合理地分析所獲得的試驗結果，恰當?shù)胤从秤猩飳W意義的作用，并符合統(tǒng)計學要求為原則。小動物每組一般不少于10只，大動物每組一般不少于6只，一

6、般雌雄各半。3.劑量體外研究中，受試物的濃度應涵蓋和超過預期臨床最大治療血藥濃度。試驗中逐步提高藥物濃度直到出現(xiàn)特征性的濃度-反應曲線或達到因受試物理化特性所限的最高濃度。除了受到細胞或組織活性的限制外，理想狀態(tài)下應有充分的藥物暴露時間以獲得穩(wěn)態(tài)電生理效應，應注明藥物暴露時間的長短。體外研究中應使用合適的陽性對照藥，以確認該體外試驗系統(tǒng)的敏感性。體外研究應確定受試物的濃度-效應關系。當體外研究無明顯作用時，應對濃度選擇的范圍進行說明。整體試驗劑量范圍應與藥物安全藥理學研究技術指導原則的原則一致。如果可能，劑量范圍應包括和超過預期的人暴露水平。當給藥劑量可能會因動物的耐受性而受到限制時，如動物出

7、現(xiàn)嘔吐、震顫、活動過度等，可采用靜脈給藥或麻醉動物進行研究。當研究用于評價延遲心室復極化程度與原藥及代謝產(chǎn)物濃度關系時，可采用持續(xù)靜脈滴注的方式控制藥物暴露水平。監(jiān)測受試物及其代謝產(chǎn)物的暴露量有助于解釋藥物的量效關系或劑量或濃度-反應，也為設計可能追加的試驗提供信息。4.對照體外離子通道和動作電位時程試驗中應采用次最大有效濃度（即藥物對通道的抑制率達70%80%時的濃度）的陽性對照藥說明試驗系統(tǒng)的反應性，并且應用于每項試驗。整體試驗研究中使用陽性對照藥則是為了驗證試驗系統(tǒng)的敏感性，但不必在每一項試驗中都使用陽性對照藥。如受試物在化學結構/藥理分類上屬于與延長人體QT間期或促心律失常有關的藥物時

8、，在體內外研究中應與現(xiàn)有同類藥物比作用強度。5.給藥途徑整體動物試驗，首先應考慮與臨床擬用途徑一致，可以考慮充分暴露的給藥途徑。對于在動物試驗中難以實施的特殊的臨床給藥途徑，可根據(jù)受試物的特點選擇，并說明理由。6.觀察時間結合受試物的藥效學和藥代動力學特性、實驗動物、臨床試驗方案等因素選擇觀察時間點和持續(xù)時間。（二） 主要研究內容1.主要研究1.1采用離體動物或人心肌細胞、培養(yǎng)心肌細胞系或克隆的人離子通道的異種表達體系測定離子流。1.2測定清醒或麻醉動物的ECG參數(shù)。1.3在離體心臟標本進行動作電位參數(shù)測定，或在麻醉動物中進行能體現(xiàn)動作電位時程的特異性電生理參數(shù)檢測。1.4在離體心臟標本或動物

9、進行致心律失常作用測定。可先進行1.1、1.2研究，再進行1.3、1.4研究。綜上所述，可采用體內外方法從4個不同方面對受試物的QT間期作用進行研究，并且相互之間有互補作用。2.追加研究當非臨床研究的結果不一致，和/或臨床研究結果與非臨床研究結果不一致時，可通過回顧性評價和追加研究進行分析。此種情況下，追加的研究結果可能成為綜合風險評估的重要組成部分。追加的研究是為了更深入地了解或提供更多的關于受試物潛在的延遲人心室復極化和延長QT間期的作用。這些研究可以提供更多有關作用強度、作用機制、劑量反應曲線的斜率或最大反應幅度的信息。追加的研究可以針對某一特殊問題設計試驗，因此各種體外或體內的研究設計

10、都可應用。在選擇和設計追加研究中，以下內容需與已有的非臨床和臨床信息一并考慮：·用離體心臟測量記錄動作電位以評價心室肌復極化；·在麻醉動物用一些能反映動作電位時程的特殊電生理參數(shù)；·動物的種類和性別的選擇；·用代謝誘導劑或抑制劑；·用目前已知陽性對照物或參比物；·未研究的對其他通道的抑制作用；·多時間點測定電生理參數(shù)；·在清醒動物難以解釋的作用，如受試物對心率、自主神經(jīng)緊張的影響，或受試物的毒性，如震顫、抽搐或嘔吐；·如藥物有蓄積、臨床長期使用，需考慮多次給藥的觀察。四、結果分析與評價綜合風險評估應該是基

11、于科學的、對受試物個性化的考慮。這種綜合風險性評估有益于臨床研究設計和其結果的分析。應結合藥效學、毒理學、藥代動力學以及其他研究資料進行綜合評價，為藥物應用于人體的安全性提出建議。風險評估應考慮受試物是否在化學結構或藥理分類上屬于可延長人QT間期作用的藥物，如某些抗精神病類藥物、組胺H1受體拮抗劑、氟喹諾酮類等。這可能會影響參比物的選擇并會納入綜合風險評估中。對QT間期影響的非臨床研究策略如下圖整體QT分析化學/藥理分類整體QT分析體外IKr及多種離體外IKr及多種離子通道等研究追加研究綜合風險性評估相關非臨床/臨床研究信息風險評估五、參考文獻1.ICH, ICH Guidance for I

12、ndustry ICH S7A：Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals, 2001. 2.ICH, ICH Guidance for Industry ICH S7B：Safety Pharmacology Studies for assessing the potential for delayed ventricular repolarization （QT interval prolongation）by Human Pharmaceuticals, 2005. 3.Liu T, Brown BS, Wu Y, Antz

13、elevitch C, Kowey PR, Yan GX.Blinded validation of the isolated arterially perfused rabbit ventricular wedge in preclinical assessment of drug-induced proarrhythmias, Heart Rhythm 2006; 3: 948-956. 六、附錄試驗方法（一）體外試驗評價藥物對離子電流的影響，主要包括IKr和其他幾種參與心肌電活動的重要離子通道。體外IKr試驗是采用原代心肌細胞或表達IKr通道蛋白（如由hERG編碼的蛋白）的細胞系評價藥物

14、對離子電流的影響。相關研究方法見參考文獻。檢測中獲得IC50的基本參數(shù)項目列于表2。表1 致心律失常作用試驗檢測的心肌離子通道通道種類陽性對照（參考）參考文獻Cav1.2 (L-type)尼非地平(Nifedipine)Shen J et al Comparison of L-type calcium channel blockade by nifedipine and/or cadmium in guinea pig ventricular myocytes JPET, 2000；294:56270 Zahradnk I, Minarovic, I and Zahradnkova A Inh

15、ibition of the cardiac L-typec calcium channel currentby antidepressant drugs JPET,2008；324:97784 hERG西沙必利(Cisapride)或特非那定(Terfenadine)Helliwell R, Recording hERG potassium currents and assessing the effects of compounds using the whole-cell patch-clamp technique Jonathan D Lippiat (ed ), Methods in

16、 Molecular Biology, Potassium Channels, 2008；491: 27995 Kamiya K et al Molecular determinants of hERG channel block by terfenadine and cisapride J Pharmacol Sci,2008；108:301-7 Gintant GA et al Utility of hERG assays as surrogate markers of delayed cardiac repolarization and QT safety ToxicolPathol,

17、2006；34:81-90 Kv1.54-氨基吡啶(4-Aminopyridine，4-AP)De Biasi M et al Open channel block of human heart hKv1 5 by the beta-subunit hKv beta 1 2 Am J Physiol 1997 272: H2932-41 Lagrutta A et al Novel, potent inhibitors of human Kv1 5 K+ channels and ultrarapidly activating delayed rectifier potassium curre

18、nt JPET,2006;317:1054-63 Kv4.3氟卡尼(又名哌氟酰胺，F(xiàn)lecainide)或4-APRadicke S et al Effects of MiRP1 and DPP6 -subunits on the blockade induced by flecainide of KV4 3/KchIP2 channels Br J Pharmacol 2008, 154: 77486 Fischer F et al Inhibition of cardiac Kv1 5 and Kv4 3 potassium channels by the class Ia anti-ar

19、rhythmic ajmaline: mode of action Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2013, online, Jul KvLQT1/minK二乙酰醇293B (Chromanol-293B)Yang WP et al KvLQT1, a voltage-gated potassium channel responsible forhuman cardiac arrhythmias PNAS, 1997; 94:4017- 4021 Seebohm G et al Molecular determinants of KCNQ1 chan

20、nel block by a benzodiazepine Mol Pharmacol, 2003, 64:70-7 Nav1.5利多卡因(Lidocaine)Wu L et al Role of late sodium current in modulating the proarrhythmic and antiarrhythmic effects of quinidine Heart Rhythm, 2008；5: 1726-34 McNulty, MM andHanck ,DA State-dependent mibefradil block of Na+ channels Mol P

21、harmacol, 2004； 66:1652-61 Kir2.1鋇(Barium)或氯喹(Chloroquine)Rodriguez-Menchaca AA et al , The molecular basis of chloroquine block of the inward rectifier Kir2 1 channel PNAS, 2008；105:1364-8 Schram G et al Barium block of Kir2 and human cardiac inward rectifier currents:evidence for subunit-heteromer

22、ic contribution to native currents Cardiovasc Res, 2003, 59: 328-38 觀察記錄上述所有離子通道的相關試驗建議在GLP實驗室進行表2 檢測阻斷離子通道IC50所需的參數(shù)項目參數(shù)項目IC50試驗平臺手動膜片鉗記錄系統(tǒng)所需濃度4種每一濃度下重復試驗例數(shù)n=3陽性對照n=2溶媒對照1個濃度，n=3檢測溫度室溫 (RT)或生理性溫度 (PT)濃度范圍通過預實驗確定試驗方案和報告GLP格式累積曲線+分析樣品收集+PDF格式的電子文檔+（二）整體研究整體QT研究主要是測定心室復極參數(shù)，如QT間期。該試驗可在安全藥理學研究中同時進行，這樣可減少

23、動物和其他資源的使用。QT間期和心率是相反的、非線性的關系，且二者之間的關系在不同的種屬和動物甚至同一種屬之間都不相同。因此心率改變會影響QT間期，這會干擾對受試物影響心室復極化和QT間期的評價。故在QT間期分析時，應采用心率校正QT間期（QTc）來進行，常用的有Bazett和Fridericia法；心率校正公式的選擇須根據(jù)試驗系統(tǒng)得來的數(shù)據(jù)加以判斷，如果給藥組和對照組心率差異較大，可能校正公式對于評價QT間期延長風險是無效的，此時可改用心臟起搏器來獲得固定的心率。對QT/RR（心電圖中R波與R波的距離）關系進行分析可能更合適，包括用公式對個體動物QT間期數(shù)據(jù)進行校正。在犬或猴等大動物記錄EC

24、G，是安全性評價的基本組成。藥物引起QT間期顯著延長將使致命性心律失常TdP發(fā)生的風險顯著增加，因而ECG的QT間期被作為預測新化合物引起TdP的重要風險因素。鑒于犬、猴和小型豬等大動物在心肌離子通道構成和功能方面與人類具有高度相似性，通常用于整體QT分析研究中。整體QT分析試驗可在麻醉和清醒動物進行，具體方法參見表3所列文獻。表3 整體QT研究試驗常用動物動物參考文獻試驗參數(shù)麻醉動物犬Ollerstam, A et al Comparison of the QT interval response during sinus andpaced rhythm in conscious and a

25、nesthetized beagle dogs J PharmacolToxicol Methods, 2007;56: 131-44 Chiba K, et al In vivo experimental approach for the risk assessment of fluoroquinolone antibacterial agents-induced long QT syndrome Eur J Pharmacol, 2004;486:189-200 ECG相關參數(shù), 包括（形態(tài)、心率、節(jié)律、P波電壓、R波電壓、T波電壓、PR間期、RR間期、 QRS時間、QT間期、QTc間期）

26、猴Ishizaka T et al Evaluation of drug-induced QT prolongation in a halothane-anesthetized monkey model: effects of sotalol J PharmacolToxicol Methods, 2009;59:86-93 豬Authier S et al Cardiovascular and respiratory safety pharmacology in Göttingenminipigs: Pharmacological characterization Jpharmac

27、olToxicol Methods, 2011;64:53-9 遙測動物犬Batey AJ, Doe PA A method for QT correction based on beat-to-beat analysis of the QT/RR interval relationship in conscious telemetred beagle dogs J PharmacolToxicol Methods,2002;48: 11-9 Fossa AA Assessing QT prolongation in conscious dogs: validation of a beat-t

28、o-beat method PharmacolTher, 2008;118:231-8 猴Ando K et al QT PRODACT: In vivo QT assay with a consciousmonkey for assessment of the potential for drug-induced Qtinterval prolongation J Pharmacol Sci,2005;99: 487-500 Haushalter TM et al The cardiovascular and pharmacokineticprofile of dofetilide in c

29、onscious telemetered beagle dogs andcynomolgus monkeys Br J Pharmacology,2008;154: 1457-64 豬Stubhan et al Evaluation of cardiovascular and ECG parameters in the normal, freely moving GöttingenMinipig J Pharmacol Toxicological Methods,2008, 57: 20211 KanoM et al QT PRODACT: Usabilityof miniature

30、 pigs in safety pharmacology studies: Assessment for drug-inducedQT interval prolongation J Pharmacol Sci,2005, 99:50111 麻醉動物犬Takahara A et al Effects of mexiletine on the canine model of sparfloxacin-induced long QT syndrome Eur J Pharmacol,2003,476:115-22 Chiba K et al Proarrhythmic effects of flu

31、oroquinolone antibacterial agents: in vivo effects as physiologic substrate for Torsades ToxicolApplPharmacol, 2000, 169:8-16 Kimura K et al Hemodynamic and electrophysiological effects of mitemcinal (GM-611), a novel prokinetic agent derived from erythromycin in a halothane-anesthetized canine mode

32、l J ToxicolSci, 2007,32:231-9 血流動力學檢測，包括MAP、SBP、 DBP、HR、 ECG、單相動作電位(MAP)等注：Göttingen minipigs:哥根廷小型豬。上述整體QT研究相關試驗建議在GLP實驗室進行（三）追加的研究藥物對心肌動作電位（Action potential，AP）的影響：心臟的正常功能依賴于心肌細胞動作電位的產(chǎn)生和傳導。藥物引起細胞膜離子通道表達或功能異常是其導致心律失常的重要病理生理基礎。因此，在離體心臟標本進行動作電位參數(shù)測定，是ICH 推薦的QT間期延長藥物安全性評價體系中的重要組成之一。常用于動作電位參數(shù)測定的動物離

33、體心臟標本及試驗方法見表4，試驗中重要的參數(shù)項目見表5。表4 記錄心肌AP的離體心肌標本動物標本參考文獻犬蒲肯野纖維Terrar, DA et al Comparison of guinea-pig ventricular myocytes and dog Purkinje fibres for in vitro assessment of drug-induced delayed repolarization J Pharmacol Toxicol Methods, 2007; 56: 171-85 Lightbown ID et al Towards automation of a val

34、uable preclinical cardiac safety pharmacology assay: Evaluation of the effects of cardiac ion channel blockers on cardiac repolarisation in vitro J Pharmacol Toxicol Methods, 2007;56:194-202 Limberis JT et al The effects of plasma proteins on delayed repolarization in vitro with cisapride, risperido

35、ne, and D, L-sotalol J Pharmacol Toxicol Methods, 2007; 56:11-7 兔蒲肯野纖維Himmel HM Suitability of commonly used excipients for electrophysiological in-vitrosafety pharmacology assessment of effects on hERG potassiumcurrent and on rabbit Purkinje fiber action potential J Pharmacol Toxicol Methods, 2007;

36、 56: 145-58 Ducroq J et al Action potential experiments complete hERG assay and QT-interval measurements in cardiac preclinical studies J Pharmacol Toxicol Methods, 2007; 159-70 豚鼠心室肌細胞Hagiwara T et al A comparative study of the fluoroquinolone antibacterial agents on the action potential duration i

37、n guinea pig ventricular myocardia Jpn J Pharmacol, 2001; 87: 23134Shuba LM et al Action potentials, contraction, and membrane currents in guinea pig ventricular preparations treated with the antispasmodic agent terodiline JPET, 1999; 290:1417-26 豚鼠心室乳頭肌Hayashi S et al QT PRODACT: a multi-site study

38、 of in vitro action potential assays on 21 compounds in isolated guinea-pig papillary muscles J PharmacolSci,2005; 99:423-37 Langendorff離體心臟Milberg P et al Proarrhythmia as a class effect of quinolones: increased dispersion of repolarization and triangulation of action potential predict torsades de

39、pointes J Cardiovasc Electrophysiol, 2007; 18:647-54 Clements-Jewery H et al Actions of flecainide on susceptibility to phase-2 ventricular arrhythmias during infarct evolution in rat isolated perfused hearts British J Pharmacol, 2006; 147: 46875 ChengHC and Incardona J Models of torsades de pointes

40、: effects of FPL64176, DPI201106, dofetilide, and chromanol 293B in isolated rabbit and guinea pig hearts J Pharmacol Toxicol Methods, 2009; 60: 174-84 冠狀動脈灌注兔左心室肌楔形標本ChenX et al Use of arterially perfused rabbit ventricular wedge inpredicting arrhythmogenic potentials of drugs J Pharmacol Toxicol M

41、ethods, 2006;54: 261-72 Liu T, Brown BS, Wu Y, Antzelevitch C, Kowey PR, Yan GX.Blinded validation of the isolated arterially perfused rabbit ventricular wedge in preclinical assessment of drug-induced proarrhythmias Heart Rhythm 2006; 3: 948-956 上述研究相關試驗建議最大可能執(zhí)行GLP表5 心肌動作電位試驗中的重要參數(shù)項目三濃度檢測參數(shù)項目測試測試濃度

42、數(shù)3檢測每一個受試物所需的蒲肯野纖維數(shù)或心肌細胞數(shù)4用于對照品的蒲肯野纖維數(shù)或心肌細胞數(shù)4累積曲線+在生理溫度 (37º±1º C) 下進行試驗+統(tǒng)計學分析+如果系GLP實驗室，收集樣本的分析+報告+如果是GLP實驗室，要求有質量保證部門(Quality Assurence Unit, QAU)的檢查，包括同步、數(shù)據(jù)和報告的檢查+可參考的文獻1. De Clerck F et al, In vivo measurement of QT prolongation, dispersion and arrhythmogenesis: application to the preclinical cardiovascular safety pharmacology of a new chemical entity, FundamClinPharmacol, 2002;16:125-40. 2. Sanguinetti