CACNA1F基因在3T3L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中表達(dá)變化的研究

1、CACNA1F基因在3T3().()5),其余各時(shí)間 段之間的表達(dá)水平差異均有顯著性(PV().()5)。結(jié)論CACNA1F基因參 與了脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控，與肥胖發(fā)生相關(guān)，其在3T3-L1細(xì)胞分化過(guò) 程中的表達(dá)變化可能有利于脂肪細(xì)胞的分化成熟和脂質(zhì)積聚?！娟P(guān)鍵詞】CACNA1F基因3T3-L1前體脂肪細(xì)胞細(xì)胞分化.Abstract Objective To investigate the changes of L-type voltagc-depcndcnt calcium channel al F(CACNA1 F)gcnc expression during 3T3-L1 preadipo

2、cyte diffcrcntiation.To explore the relationship butwexnCACNA1F gene and the etiology of obesity.Methods 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro and differentiated into the matured adipocytcs.Total RNA was extracted from adipocytes of various times and the levels of CACNA1F gene mRNA expression

3、were evaluated by RT-PCR-Rcsults In preadipocyc, the levels of CACNA1F gene mRNA expression remained at low.In the presence of inducing reagents, the CACNA1F gene mRNA expression was induced at a very early stage and remained at high levels in the mature adipocytc.Thcre was a significant difference

4、between any two detected phases in the levels of CACNA1F gene mRNA expression，except that the levels of CACNA1F gene mRNA expression did not increase obviously in day 0 to 3 day, 5th to 6th day, Sth to l()th day.Conclusion CACNA1F gene is involved in the differentiation of adipocytes and related to

5、the etiology of obesity .Thu changes in the level of CACNA1F gene mRNA expression during 3T3-L1 preadipocyte differentiation might be contributing to the differentiation and adipogcncsis of adipocytes.Key words L-typc voltage-dependent calcium channel alF gene 3T3-L1 preadipocyte cell differentiatio

6、n近年來(lái)，我國(guó)兒童肥胖的發(fā)病率逐漸上升，而且與肥胖相關(guān)的一些疾病，如高血壓、高脂血癥、2型糖尿病等越來(lái)越多地出現(xiàn)在兒童群體中，肥胖已成為危害兒童身心健康的嚴(yán)重醫(yī)學(xué)問(wèn)題；然而肥胖病 因復(fù)雜，是機(jī)體在遺傳、環(huán)境、行為、生理、社會(huì)、文化等諸多因素 相互作用下能量代謝失衡的結(jié)果，因此防治難度極大，一些傳統(tǒng)的肥 胖治療方法如控制飲食、減肥藥物等收效甚微，而且由于兒童正處于 身心發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，這些方法在兒童中的應(yīng)用受到限制，因此迫切 需要尋找安全有效的肥胖控制治療方法。鈣是飲食中一種重要的成分, 自從十多年前人們發(fā)現(xiàn)肥胖病人體內(nèi)脂肪細(xì)胞中鈣離于濃度升高以 來(lái)，鈣與肥胖的關(guān)系逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，為尋找控

7、制肥胖及其相 關(guān)疾病的治療方法開(kāi)拓了一片嶄新的視野。研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣離于 濃度在與肥胖相關(guān)的能量代謝失衡中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離于在調(diào) 控脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝和甘油三酯沉積中起著重要作用，細(xì)胞內(nèi)鈣離于 濃度的增加導(dǎo)致脂肪合成基因的表達(dá)和脂肪合成的增加、抑制脂肪分 解，最終增加脂肪積聚而導(dǎo)致肥胖。低鈣飲食可導(dǎo)致1, 25-二輕維生 素D3的產(chǎn)生增加，刺激鈣離子在細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)從而促進(jìn)肥胖的發(fā)生； 而髙鈣飲食可以減少脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積聚，增加脂質(zhì)分解，控制體重增 加1, 2。在這個(gè)過(guò)程中，鈣離于通道介導(dǎo)的鈣離子細(xì)胞內(nèi)流是一個(gè) 重要環(huán)節(jié)。因此圍繞著鈣離于通道及其調(diào)控因素開(kāi)展進(jìn)一步的研究具 有重要的意義。由于在

8、先前研究中3,應(yīng)用cDNA array技術(shù)發(fā)現(xiàn)， L 型電壓依賴(lài)鈣離于通道ocl F(L-typc voltagc-dcpcndcnt calcium channel a IF, CACNA1F)基因差異表達(dá)于肥胖和正常大鼠的脂肪組織中，肥胖 狀態(tài)下該基因表達(dá)顯著上調(diào)，提示該基因表達(dá)變化與肥胖發(fā)生密切相 關(guān)。為進(jìn)一步研究該基因與肥胖之間的關(guān)系，本研究在成功誘導(dǎo) 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化成熟的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR技術(shù)觀察CACNA1F基因在前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)水平 的變化，以探討該基因與脂肪細(xì)胞分化及肥胖之間的關(guān)系。1材料與方法1.1材料3T3-L1前體脂肪細(xì)胞株由上

9、海中科院生物化學(xué)與細(xì)胞 生物學(xué)研究所廖侃教授饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代留種，OMEM培養(yǎng)基、胰 蛋白酶、TRIzol購(gòu)自美國(guó)liwitrogun公司,胎牛血清(任切bovine scrum, FES)購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰島素、地塞米松、1- 甲基-3-異丁基黃瞟吟(MIX). DEPC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，油紅()(oil wd-()染料購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠。dNTP、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、 ()ligo(dT)18 Ex-Taq酶等分于生物學(xué)試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司，PCR Marker購(gòu)自華美生物工程公司，引物由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司 合成。1.2方法1.2.1 3T3-

10、L1前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化根據(jù)3T3-L1細(xì)胞培 養(yǎng)和誘導(dǎo)分化方案4,用完全培養(yǎng)液(DMEM+l()%FBS+l()()u/ml 鏈霉素)，在37C孵箱(5%二氧化碳，95%空氣中培養(yǎng)細(xì)胞，每2天換 液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后2天(第()天)，開(kāi)始誘導(dǎo)分化，具體 步驟為：將培養(yǎng)液換成含().5mmol/L MIX. lmol/L地塞米松和5mg/L 胰島素的完全培養(yǎng)液；48h后，撤去MIX和地塞米松，使完全培養(yǎng)液 中只含有5mg/L胰島素；2天后換液，撤去胰島素，使用不含有任何 誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基；以后每2天換液1次，直至第1（）天95%以上細(xì) 胞已分化為成熟的脂肪細(xì)胞。收集分化不同時(shí)

11、間段（0-10天）的細(xì)胞， 置-7（）C凍存?zhèn)溆谩?.2.2 3T3-L1細(xì)胞鑒定油紅（）染料經(jīng)異丙醇溶解后過(guò)濾，置4C 備用。取分化不同時(shí)間段（010天）的細(xì)胞,先用0.01 M PBS洗2遍， 加入3.7%甲醛固定2min,再用清水洗凈，加入油紅（）染液染lh,水 洗至背景透明。經(jīng)油紅（）染色、蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察結(jié)果，細(xì) 胞質(zhì)中脂滴呈亮紅色、細(xì)胞核呈藍(lán)色。拍照，記錄細(xì)胞的分化情況。1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)3T3-L1細(xì)胞中CACNA1F基因mRNA的 表達(dá)水平 取細(xì)胞20（1（4X105個(gè)細(xì)胞），TRizol法提取3T3-L1細(xì)胞 的總RNA,定量后取gg,以O(shè)ligo（dI

12、018為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體 系20ulo取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1卩1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系20。 小鼠CACNA1F基因的上游引物序列：5 -ATC ATC ATC TTC TCC CTG CT-3,下游引物序列：5 -CAC CAC ATG CTT GAG TCC CT-3, 產(chǎn)物長(zhǎng)度987bp;內(nèi)參照小鼠GAPDH基因的上游引物序列：5 -ACC ACAGTCCATGCC ATC AC-3,下游弓 | 物序列：5 -TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3,產(chǎn)物長(zhǎng)度432bp。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95C 2min,變性 94C 30s,退火 52C 3（）s（G

13、APDH 基因：52C 30s）,延伸 72C 3()s,共3()個(gè)循環(huán)(GAPDH基因：3()個(gè)循環(huán))，終末延伸72C 5mino 所選用PCR反應(yīng)的模板量及循環(huán)數(shù)均使PCR產(chǎn)物量位于反應(yīng)曲線(xiàn)的 線(xiàn)性范圍內(nèi)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用UVP凝膠密度 掃描儀對(duì)CACNA1F基因和CAPDH特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行 密度掃描，用Labwork 3.()軟件測(cè)定電泳條帶密度值，CACNA1F基因 mRNA的表達(dá)水平以該基因條帶密度占GAPDH基因條帶密度的百分 比()表示。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x 土 s)表示，用Excel統(tǒng) 計(jì)軟件和SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件

14、進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)。多組間均數(shù)比較采 用方差分析F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，PV0.05示結(jié)果具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞染色鑒定結(jié)果誘導(dǎo)分化前，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞呈梭 形成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)亮紅色顆粒；細(xì)胞 生長(zhǎng)至完全融合后2天(第()天)開(kāi)始誘導(dǎo)分化，第2天到第6天細(xì)胞形 態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞逐漸由梭形變?yōu)閳A形，胞體變大變圓，細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)被油紅()染成亮紅色的脂滴逐漸增多增大；第6天時(shí)，約6()%的細(xì) 胞已分化成熟；第1()天時(shí)，可見(jiàn)含有亮紅色脂滴的成熟脂肪細(xì)胞在視 野中占95%以上，細(xì)胞體積大、形態(tài)圓。2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中CACNA1F基因表達(dá)水平的 變化 見(jiàn)圖1、圖2、表1。由圖表可見(jiàn)，CACNA1F基因在脂肪前體細(xì) 胞中表達(dá)水平較低，隨著脂肪細(xì)胞的分化成熟該基因表達(dá)水平逐漸升 髙，至分化第81()天達(dá)到高峰。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，CACNA1F 基因的表達(dá)水平在細(xì)胞分化第()3天、56天、81()天3個(gè)時(shí)間段 內(nèi)無(wú)明顯變化外(P0.05),其余各時(shí)間段之間的表達(dá)水平差異均有顯 著性(PV0.O5)。圖1 3T3-L1脂肪細(xì)胞分化中CACNA1F基因表達(dá)水平的檢測(cè)(M：PCRMarkers, 010：細(xì)胞分化時(shí)間)圖2 3T3-L1脂肪細(xì)胞