蛋白質(zhì)含量測定方法匯總

1、實(shí)驗(yàn)七蛋白質(zhì)含量測定測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮腺(Biuret)法，酚試劑法 (Lowry)法及紫外吸收法。目的要求1 .掌握測定蛋白質(zhì)的含量基本方法。2 . 了解染料法、雙縮腺法、Lowry法和紫外吸收法測定原理。一、染料法實(shí)驗(yàn)原理在酸性溶液中染料考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，此時(shí)考馬斯亮藍(lán)G-250顏色從紅 色變?yōu)樗{(lán)色，吸收高峰從460nm移至595nm。利用這個(gè)原理可以測定蛋白質(zhì)含量。該法近年在某些方面有取代經(jīng)典的Lowry法趨勢，因?yàn)樗僮骱唵危磻?yīng)時(shí)間短，染 料-蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定，抗干擾性強(qiáng)。本法的缺點(diǎn)是：對于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白氨基酸組成有較大 差異的蛋白質(zhì)，

2、有一定誤差，因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)與染料的結(jié)合是不同的，故該法適合測定 與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)經(jīng)基酸組成相近的蛋白質(zhì)。器材吸量管：試管：721型分光光度計(jì)試劑1 .標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液:配成0. Img/ml的溶液。2 .待測蛋白質(zhì)溶液。3 .染料溶液：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 0. 1g溶于95%的酒精50ml,再加入85%的濃磷 酸100mL用水稀釋至1000ml,混勻備用。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：試劑(ml) 管號01234L 0標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液00.20.40.60.81.0壓01.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595nli按上表分別向各支試管內(nèi)加入各種試劑

3、，充分混勻，5min后在595nm波長處以0號 管調(diào)零，測定各管吸光度值(A) o以吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。2.樣品測定:取1ml樣品溶液(約含25250微克蛋白質(zhì))，加入染料溶液51nl混勻，5min后測 定其595nm吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。二、雙縮眼(Biuret)法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)原理在堿性溶液中，雙縮胭(HcN-CO-NH-CO-NH：)與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這 一反應(yīng)稱雙縮眼反應(yīng)。凡分子中含二個(gè)或二個(gè)以上酰胺基(一CO-NH。，或與此相似的基團(tuán) 如一CHNH：, -CS-NH:, C(NH)NH的任何化合物，無論這類基團(tuán)直接

4、相連還是通過一個(gè) 碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(T0-NH-),可發(fā)生 雙縮腺反應(yīng)，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色 法測定蛋白含量。測定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸鉉、 Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的 缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮麻法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。試劑1 .雙縮腺試劑：取CuSOt5H;0(c.P.)1.5g和酒石酸鉀鈉(c.P.) 6.0g以少量蒸馀水 溶解，再加2.5mol/L NaOH溶液300m

5、l, KI 1.0g,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光 保存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。2 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白(BSA)或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成 10g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度lg/L的A儂為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn) 蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量 配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H:0或0. 9%NaCl配制，酪蛋白用 0. 05mol/L NaOH 配制。器材1 .試管：15 X 150mm試管7只；2 . 1mL 5ml移液管；3 .坐標(biāo)紙：4 . 721分光光度計(jì)。:操作步

6、驟取試管7支，編號，按下表操作：試劑(ml) 管號空白 12345 測定管管蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(10g/L)-0. 10.20.30.40.5-生理鹽水0.50.40.30.20. 1-0.4待測樣品_（）. 1雙縮胭試劑3.03.0 3.03.03.03.0 3.0相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)（g/L）混勻，37水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計(jì)波長540nm處，用空白管調(diào) 零，讀取各管吸光度值。1-5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì) 濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測定管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。注意事項(xiàng)1 .雙縮胭試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止 CuSO.

7、5H=0不穩(wěn)定形成Cu（OH）:沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO* * 5H=0之比不低于3 ： 1,加入 KI作為抗氧化試劑。2 .雙縮胭試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。3 .本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn) 是靈敏度較低。4 .黃疸血清、嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾。思考題1 .雙縮胭法測定蛋白質(zhì)的原理是什么？其它還有什么方法測定蛋白質(zhì)的含量？2 .請用雙縮腺法，設(shè)計(jì)一個(gè)測定蛋白質(zhì)含量的定量方法（除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外）。三、酚試劑法測定血清蛋白質(zhì)含量（改良Lowry法）實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中所含肽鍵在堿性條件下與銅絡(luò)合生成復(fù)合物產(chǎn)生紫紅色化合物（雙縮腺 反應(yīng)）

8、，同時(shí)使肽鏈展開，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸和組紈酸均能使鴇酸、鋁 酸同時(shí)失去1個(gè)，2個(gè)或者3個(gè)氧原子，還原成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍(lán)顏 色（最大吸收峰波長為745750nm，反應(yīng)式一）其藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)成 正比，由此可測出樣品中蛋白質(zhì)的含量。同時(shí)蛋白質(zhì)肽鍵發(fā)生烯靜化反應(yīng)（反應(yīng)式二）能 使鋁離子在PH10時(shí)螯合在肽結(jié)構(gòu)中，形成復(fù)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混合酸的顯色劑上， 大大增加了酚試劑對蛋白質(zhì)的敏感性.反應(yīng)式一3HcOP：O3 13W05 5Mo03 1 OHoO3H：0P：03* 14W05- 4Mo05- 10H：0反應(yīng)式二3Hc0P305- 13W0=*

9、5Mo03* 10H=0SHjOPA* 14W0:* 4Mo05- 10H=0烯靜化反應(yīng)烯醇化反應(yīng)后，可與Cu,絡(luò)合，絡(luò)合后，易于使肽釋放電子，使酚試劑還原。試劑器材1 .堿性銅試劑：甲液：稱取無水碳酸鈉2. 0g,溶于0. hnol/L NaOH溶液100ml中。乙液：取硫酸銅（CuS04540 ） 0.5g,溶于現(xiàn)酒石酸鉀溶液100ml中。臨用前取甲液50ml,乙液1ml混合，即為堿性銅試劑。此液需現(xiàn)用現(xiàn)配。2 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（250 ng/ml）：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白25mg,溶于 0. 9%NaCl溶液中，以容量瓶定容至100ml33 .樣品：取血清0. 1ml,置于50ml容量

10、瓶中，用0. 9%NaCl溶液稀釋至刻度處，混 勻，為待測血清樣品。4 .酚試劑:取鴇酸鈉（NaMOj2H二0） 100g和鋁酸鈉 。0,2及0） 25g,溶于700ml 蒸馀水中，再加入85$磷酸50ml和濃硫酸100ml充分混勻，置于1500ml圓底燒瓶中溫和 地回流10小時(shí)，冷卻，取下冷凝裝置，再加入硫酸鋰（Li：SOj2HO） 150g,水501nl，澳3 4滴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，驅(qū)除過量的澳，冷卻后稀釋至1000ml,過濾，溶液應(yīng)呈黃色 或金黃色（如帶綠色不能使用，應(yīng)繼續(xù)加澳煮沸），置于棕色瓶中保存。使用前，以酚配 為指示劑，用O.lmol/LNaOH溶液滴定，求出酚試劑的摩爾濃

11、度。然后根據(jù)此濃度，將酚試 劑用蒸儲(chǔ)水稀釋至最后酸度為lmol/L。（滴定時(shí)可將酚試劑稀釋，以免顏色影響）。試劑 放置過久，變成綠色時(shí)，可再加澳數(shù)滴煮15分鐘，如能恢復(fù)原有的金黃色仍可使用。5 . 721分光光度計(jì)；旋渦混合器：秒表；試管。操作步驟取試管7支，編號，按下表操作:試劑（ml） '管 號01234L O測定管標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0.20.40.60.81.0(250 ng/ml)稀釋血清 1.00. 9%NaCl1.00.80.60.40.2堿性銅試劑5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置20min酚試劑0.50.50.50.50.50.50.5混勻，室溫放置30

12、min后，以0管調(diào)零點(diǎn)，在波長650nm比色，分別讀取各管吸光 度值。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測定管吸光度值， 查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清蛋白質(zhì)含量。臨床意義1 .血清總蛋白濃度增高：（1）血清中水分減少，而使蛋白濃度相對增高。如急性失水時(shí)（嘔吐、腹瀉、高 熱）：休克時(shí)，由于毛細(xì)管通透性的變化，血漿也發(fā)生濃縮等。（2）蛋白合成增加，大多數(shù)發(fā)生多發(fā)性骨愉瘤患者中，主要是血清球蛋白增加。2 .血清蛋白合成降低：（1）合成障礙，主要為肝功能障礙，肝臟是合成蛋白質(zhì)的場所，肝功嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，蛋 白質(zhì)的合成減少，以白蛋白最為顯著。（2）蛋白質(zhì)丟失，如嚴(yán)重灼傷時(shí)，大量血漿滲出：腎病綜合

13、癥時(shí)，尿液中長期丟失蛋 白質(zhì)等。（3）營養(yǎng)不良或長期消耗性疾病，如嚴(yán)重結(jié)核或長期消耗性疾病。（4）血液中水分增加，血漿被稀釋，因各種原因引起的水鈉潴留或輸注過多低滲溶 液。注意事項(xiàng)1 .酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)相互作用，所 以當(dāng)加入酚試劑后，應(yīng)迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鋁酸-磷鴇酸試劑 被破壞之前。2 .堿性銅試劑必須臨用前配制。3 .磷鋁酸、磷鴇酸的顯色反應(yīng)是由于和還原物質(zhì)的還原反應(yīng)而引起的，因此本法可受 很多還原性物質(zhì)的干擾，如帶有-SH的化合物，糖類、酚類等甚至有些緩沖劑（如Tris） 也能干擾測定。但如控制在低濃度范闈內(nèi)，則不影響測

14、定，Lowry法很靈敏，可以對5 100 ng蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行很好的顯色反應(yīng)，而如此低的蛋白質(zhì)濃度常常已把干擾物質(zhì)的濃度 稀釋到一個(gè)不起作用的水平。4 .所有器材必須清洗干凈，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5 .血清稀釋的倍數(shù)應(yīng)使蛋白質(zhì)含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范闈內(nèi)，若超過此范闈需要將血清酌情 稀釋。6 .本法操作簡便、靈敏度高，缺點(diǎn)是試劑只與蛋白質(zhì)中半胱氨酸、色氨酸等起反應(yīng)， 因此可因各種蛋白質(zhì)中含這幾種氨基酸的量不同使顯色強(qiáng)度稍有不同。思考題1 .用酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量有哪些優(yōu)點(diǎn)？2 .用酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量有哪些干擾作用？應(yīng)如何注意？四、紫外吸收法實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有

15、共匏雙鍵，使蛋白質(zhì) 具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成 正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白 質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽， 例如生化制備中常用的（NH：）等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫 液的快速連續(xù)檢測，因?yàn)榇藭r(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測 定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪額酸和色氨酸

16、含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的 誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)級基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有噂吟、啼 噬及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn) 行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的， 雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此 要注意溶液的pH值，測定樣品時(shí)的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。試劑器材1 .蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（lmg/ml）：準(zhǔn)確稱量經(jīng)微量凱氏定氮法校正的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制。2 .紫外分光光度計(jì)。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8

17、支試管，按下表編號并加入試劑:試劑（ml） '管號0123467蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液00.51.01.52.02.53.04.0(lmg/ml)4.03.53.02.52.01.51.00蒸儲(chǔ)水混勻。在280nm處測定各管溶液的吸光度值。以。號管調(diào)零，以蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.蛋白質(zhì)樣品溶液，在280nm處測得吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。注意事項(xiàng)1 .蛋白質(zhì)的最高吸收峰可因pH的改變而發(fā)生變化，因此要注意保持待測蛋白質(zhì)溶液 的pH值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液一致。2 .測定液必須澄清，以免造成結(jié)果誤差。1 / 13 .本法需用石英比色杯。思考題1 .為什

18、么紫外吸收法可作為蛋白質(zhì)定量測定方法？其理論依據(jù)是什么？2 .此法測定蛋白質(zhì)具有什么特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)二十一紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度目的和要求了解紫外吸收法測定蛋白質(zhì)濃度的原理。熟悉紫外分光光度計(jì)的使 用。原理蛋白質(zhì)組成中長含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm波長處有最大吸收峰，一定濃度范圍內(nèi)其濃度與吸光度成正 比，故可用紫外分光光度計(jì)通過比色來測定蛋白質(zhì)的含量。由于核酸在280nm波長處也有光吸收，對蛋白質(zhì)測定有一定的干擾作 用，但核酸的最大吸收峰在260nm處。如同時(shí)測定260nm的光吸收， 通過計(jì)算可以消除其對蛋白質(zhì)測定的影響。因此如溶中存在核酸時(shí)必 須同時(shí)測定280nm及2

19、60nm的吸光度，方可通過計(jì)算測得溶液中的蛋 白質(zhì)濃度。操作步驟一.直接測定法 在紫外分光光度計(jì)上，將未知的蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中, 以生理鹽水為對照，測得280nm和260nm兩種波長的吸光度（A280nm 及 A260nm）。將A280nm及A260nm波長處測得的吸光度按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃 度。C= 1.45A280nm 0.744260nm式中C：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ml）；A280nm：蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度；A260nm：蛋白質(zhì)溶液在260nm處測得的吸光本法對微量蛋白質(zhì)的測定既快又方便，它還適用于硫酸鏤或其他鹽類 混雜的情況，這時(shí)用其他方法測定往往較困難。為方便起見對于混合蛋白質(zhì)溶液，可用A280nm乘以0.75來代表其中 蛋白質(zhì)的大致含量（mg/ml）