凝膠層析法測(cè)蛋白質(zhì)分子量

1、*蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定一一凝膠層析法實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解凝膠層析的原理及其應(yīng)用。2. 通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，初步掌握凝膠層析技術(shù)。3. 了解洗脫曲線、選擇曲線的意義，并學(xué)會(huì)繪制洗脫曲線、選擇曲線。二、實(shí)驗(yàn)原理(一)蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)是生命過(guò)程中最重要的物質(zhì)之一，近年來(lái)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研 究熱點(diǎn)。分子量是蛋白質(zhì)的主要特征參數(shù)之一，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)時(shí)，首先應(yīng)準(zhǔn)確測(cè)定其分子量。蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法有多種，如滲透壓法、光 散射法、超速離心法、凝膠層析法及聚丙烯酰胺凝膠電泳等 円。(二)凝膠層析法層析法，又稱色層分析法或色譜法(Chromatography)，在 1903-1906 年由

2、俄國(guó)植物學(xué)家 M.Tswett 首先提出。雖然近年來(lái)質(zhì)譜技術(shù)日益成熟,靈敏度、精 確度也為各種方法之首， 但是目前在實(shí)驗(yàn)室中測(cè)量蛋白質(zhì)分子量應(yīng)用比較廣泛 的還是凝膠層析等方法。凝膠層析法(gel filtration )，又叫凝膠過(guò)濾法、凝膠滲透色譜法(GPC )、排阻色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法(GFC)、分子篩層析法(molecular sievechromatography )等，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開(kāi)的一 種方法。凝膠本身是一種分子篩，可以把分子按不同大小進(jìn)行分離，如同過(guò)篩可以 把大顆粒與小顆粒分開(kāi)一樣。但這種“過(guò)篩”與普通的過(guò)篩不一樣。將凝膠顆 粒在適宜的溶劑中浸泡，使充分吸

3、液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的 混合物，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝 膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致 最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。由于其分離條件溫和、樣品回收率高、 實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性高、 設(shè)備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)等 特點(diǎn)，是目前最廣泛使用的生化物質(zhì)的分離方法之一，是所有色譜技術(shù)中 最簡(jiǎn)單、條件最溫和的方法，且完全是基于樣品的分子量大小來(lái)進(jìn)行分離的。 雖然其分離效果不及高效液相色譜，但可作為一種初步的分離手段使下一步的 純化達(dá)到更好的效果。*（三）凝膠凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，其內(nèi)部具有很微細(xì)的多孔

4、 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠（agarose gel ，商品名Sepharose），人工合成凝膠是葡聚糖（dextran，商品名為 SePhadex），凝膠型號(hào)不同，孔隙度不同，但都不溶于水。這種聚合物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離物質(zhì)分子的大小 有相應(yīng)的數(shù)量級(jí)。在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高的，孔隙小，只有相應(yīng) 的小分子可以通過(guò)，適于分離小分子物質(zhì)。相反，交聯(lián)度低的孔隙大， 適于分離大分子物質(zhì)。利用這種性質(zhì)可分離不同分子量的物質(zhì)。（四）測(cè)量方法凝膠過(guò)濾層析，是一種分離不同大小分子的分配層析，被分離物質(zhì)的分子在溶劑和限定孔徑的凝膠固定相中被分配，混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)層析柱時(shí)，各種物質(zhì)同

5、時(shí)進(jìn)行著垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)定向的擴(kuò)散運(yùn) 動(dòng)，混合物中各物質(zhì)因相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同而被分離，這種方法操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用較低，重復(fù)性好。因其能像篩子一樣篩分不同大小的分 子，因此又稱為“分子篩”。其具有許多良好的性能，因此在蛋白質(zhì)的 分離分析中被廣泛采用。經(jīng)過(guò)不少人的實(shí)際應(yīng)用和完善，該方法已經(jīng)變 成一種可靠的測(cè)定高分子分子量的方法9。將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以 Vt （ total volume ）表示。Vt 由三部分組成，即Vt=Vo+Vi+Vg。Vo 稱為“孔隙體積”或“外體積” （outer volume ）又稱“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外 面空隙之間的水相體積，相當(dāng)于

6、一般層析法中柱內(nèi)流動(dòng)相的體積；Vi 為內(nèi)體積（inner volume ），又稱“內(nèi)水體積”，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相 的體積，相當(dāng)于一般層析法中的固定相的體積，它可從干凝膠顆粒重量 和吸水后的重量求得； Vg為凝膠本身的體積。而洗脫體積（Ve，elution Volume ）與 Vo 及 Vi 之間的關(guān)系為:Ve=Vo+KdViVe 是自加入樣品時(shí)起，到組分最大濃度(峰)出現(xiàn)時(shí)所流出的體積；本 實(shí)驗(yàn)?zāi)z層析柱中填充的是交聯(lián)葡聚糖，含有蛋白的溶液通過(guò)管柱時(shí)， 大分子的蛋白呈正態(tài)分布連續(xù)首*先流出，會(huì)形成一個(gè)蛋白峰10oKd 為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說(shuō)Kd 是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部

7、和外部的分配系數(shù)，只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒孔隙的 大小分布有關(guān)，而與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)無(wú)關(guān)。Kd 可通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得：Kd= ( Ve- Vo ) /Vi上式中 Ve 為實(shí)際測(cè)得的洗脫體積；Vo 可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液(帶顏色為佳，便于觀察，如血紅蛋白、印度黑墨水等，分 子量約 200 萬(wàn)的藍(lán)色葡聚糖-2000 等)通過(guò)實(shí)際測(cè)量求出； Vi 可由 g WR 求得(g 為干凝膠重，單位為克；WR 為凝膠的“吸水量”，以毫升/克表示)。因此，對(duì)一層析柱凝膠床來(lái)說(shuō)，只要通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知某一物質(zhì) 的洗脫體積 Ve,就可算出它的Kd 值。三、實(shí)驗(yàn)器材1 試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：藍(lán)色葡聚糖-2000

8、 ( 200KD)，牛血清清蛋白(67KD),胰凝乳蛋白酶原(24.5KD )，CytC ( 13.7KD )，均為分析純。(2) 洗脫液：0.2mol/L Tris-HCI-KCI,pH7.5取 0.5M KCl 20ml,0.2M Tris 25ml,0.1M HCI40.3ml,再加 違 0 定容至 100ml(3) Sephadex G-752.器材(1)層析柱：柱管 1.2x50cm(2 )紫外分光光度計(jì)(3) 部分收集器(4)刻度試管四、實(shí)驗(yàn)步驟1.凝膠的選擇與處理：本實(shí)驗(yàn)使用 Sephadex G-75 凝膠。商品凝膠 一般是干燥的顆粒，使用前需在欲使用的洗脫液中充分溶脹。即在沸

9、水 浴中，將懸浮于洗脫液中的凝膠漿逐漸升溫至近沸，一般12h 即可完成11。根據(jù)層析柱的體積和所選用的凝膠，膨脹后床體積計(jì)算所需凝膠 干粉的重量，然后傾入過(guò)量的洗脫液中，室溫吸水膨脹。凝膠顆粒最好 大小均勻，這樣流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。2. 裝柱：本實(shí)驗(yàn)所用層析柱的規(guī)格為1.2x50cm。(1)將層析柱垂直裝好，在柱內(nèi)先注入 1/41/5 的水，出口處接上一根長(zhǎng)約 1.5m，直徑 2 mm 細(xì)塑管，塑管另一端固定在柱的上端約45cm處。然后打開(kāi)機(jī)器，排出氣泡。(2)隨著下面水的流出，上面不斷加凝膠，使形成的凝膠床面上有凝 膠的連續(xù)下降。(3)當(dāng)凝膠沉積到柱的頂端約6cm處，可停止裝柱。(4)用眼睛

10、觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有否“紋路”或氣泡。若層析柱 不均一，必須重新裝柱。3. 加樣：加樣之前先吸去柱管內(nèi)的上清液，然后加樣。等到所加的 樣與凝膠界面相平時(shí)，連接恒壓瓶、層析柱、部分收集器等裝置。4. 洗脫：待上述工作做好之后，開(kāi)始洗脫。洗脫時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制流速，以 3 4 分鐘收集 3ml 液體為宜。然后用部分收集器按每管3mL 收集洗脫流出液，各收集管于280nm 處檢測(cè) A280 值。5. 洗脫曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定(1)按上述步驟依次加入藍(lán)色葡聚糖-2000 ( 200KD)、牛血清清蛋白(67KD)、胰凝乳蛋白酶原(24.5KD )和 CytC (13.7KD )，然后用 50 mmol/

11、l 的KH2PO4-K2HPO4 緩沖液溶液洗脫。待上一個(gè)樣品在管柱中行進(jìn) 約 1/3 時(shí)再加下一個(gè)樣。用部分收集器收集流出液體，然后用紫外分光 光度計(jì)于 280nm 處測(cè)定每管 A值，以管號(hào)或者洗脫體積為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)繪出洗脫曲線。根據(jù)洗脫峰位置量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve。然后以蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)(1gM)為橫坐標(biāo)，Ve 為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了結(jié)果可靠，應(yīng)以同樣條件重復(fù)1-2 次，取 Ve 的平均值作圖。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.洗脫曲線：本實(shí)驗(yàn)共依次加入 4 種分子量已知的蛋白質(zhì)，分別為 A:藍(lán)色葡聚糖-2000 （ 200KD）、B:牛血清清蛋白（67KD）、C:胰凝乳蛋白酶原（2

12、4.5KD、和 D:CytC （13.7KD ）。每 3 4 分鐘收集 3ml 液體為一管，共收集了25 管，每管在 280nm處測(cè)得的吸光度值 A 值（即 OD 值）見(jiàn)表 1 :表 1:每管洗脫液對(duì)應(yīng)的 OD 值管號(hào)12345ODfi0.020.0370.0410.3180.14管號(hào)678910ODfi0.0360.0060.3260.0890.053管號(hào)1112131415ODfi0.0190.0240.060.2860.344管號(hào)1617181920ODfi0.220.0780.0310.0240.105管號(hào)2122232425ODfi0.1840.1340.0910.0470.023因

13、此，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制的洗脫曲線見(jiàn)圖1 :由表 1 算得 4 種樣品的洗脫體積分別為：Ve（A:藍(lán)色葡聚糖）=（3+0.5）x3=10.5mlVe（B:牛血清清蛋白） =（8-3-0.5）x3=13.5mlVe（C:胰凝乳蛋白酶原） =（15-7-0.5）x3=22.5mlVe（D:CytC）=（21-11-0.5）x3=28.5ml2.標(biāo)準(zhǔn)曲線：以蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)（1gM）為橫坐標(biāo)，Ve 為縱坐標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線表 2:各樣品洗脫體積和 IgM 值樣品MIgMVeA2000005.30110.5B670004.82613.5C245004.35122.5D137003.87

14、628.50D值圖 1 1 洗脫曲線圖 1:加入的 4 種分子量已知的蛋白質(zhì)的洗脫曲線，由上圖可 知：分別在第 4、8、15 和 21 管時(shí)出現(xiàn)峰值。*圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖圖 2 2:加入的 4 種分子量已知的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線六、分析討論蛋白質(zhì)是生命過(guò)程中最重要的物質(zhì)之一，早已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱 點(diǎn)。而分子量是蛋白質(zhì)的主要特征參數(shù)之一，故準(zhǔn)確測(cè)定其分子量意義重大。凝膠層析法在蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方面，雖然不及聚丙烯酰氨凝膠 電泳的靈敏度及準(zhǔn)確度高，但因其操作簡(jiǎn)便、試劑價(jià)格較為便宜等優(yōu)勢(shì) 而受到人們歡迎。影響分子量測(cè)定準(zhǔn)確性的因素眾多，有一定的局限性。如緩沖液的 pH 值、凝膠的型號(hào)、加樣時(shí)間間隔

15、、順序，以及收集洗脫液的操作等等 都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。緩沖液的 pH 值在 6-8 時(shí)，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較為良好，本實(shí) 驗(yàn)所用的緩沖液的pH 值為 7.5，在該范圍之內(nèi)，故在其他操作良好的情況下所得的線性較為良好。凝膠的型號(hào)對(duì)分離的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。比如Sephadex G-100 和Sephadex G-50 葡聚糖凝膠柱,前者可在前期去除相對(duì)分子質(zhì)量較大的 雜蛋白，而后者的分離范圍只有1000-30000。我們的目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量在 10000-200000 左右，故用 Sephadex G-100 或者 Sephadex G-75 可得到較好的分辨率。線性（辰）*加樣時(shí)間間隔、順

16、序?qū)Y(jié)果準(zhǔn)確性的影響。本實(shí)驗(yàn)采取加入單一樣 品的方法，按分子量由大到小加入，并且待上一個(gè)樣品基本上快要走出 柱管時(shí)才加下一個(gè)樣。分子量大的樣品不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，在凝膠顆粒 之間的縫隙流出，因此速度最快。從大到小加樣，可以保證前一個(gè)樣品 基本上被分離出來(lái)，確保了會(huì)出現(xiàn)峰值，能得出較為準(zhǔn)確的洗脫體積。分光光度計(jì)使用波長(zhǎng)為280nm 時(shí)，是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)。故本實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì) 的分子量使用280nm。七、注意事項(xiàng)1. 加樣時(shí)按分子量由大到小加入，以便于出現(xiàn)峰值和計(jì)算洗脫體積。2. 洗脫液的 pH 值應(yīng)在 6-8 得范圍內(nèi)，以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的良好

17、線性。3. 加樣之前應(yīng)趕出管柱內(nèi)的氣泡，并在整個(gè)操作過(guò)程中都要保證不產(chǎn)生 氣泡，否則洗脫速度很慢并且結(jié)果也不準(zhǔn)確。4. 收集洗脫液的速度應(yīng)嚴(yán)格控制在每3 4 分鐘收集一管液體(約3m)。5. 分光光度計(jì)使用波長(zhǎng)為280nm。6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，及時(shí)清洗整理實(shí)驗(yàn)用品，經(jīng)指導(dǎo)老師同意后才能離開(kāi)實(shí)驗(yàn) 室。參考文獻(xiàn):1石磊，季怡萍，蛋白質(zhì)分子量測(cè)定過(guò)程中的酸效應(yīng)J.分析化學(xué)，2002 (8) : 9389412孔毅，吳梧桐，吳如金，蛋白質(zhì)分子量測(cè)定方法比較研究J.分析儀器，2003 (2):44 463王雅，蛋白質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)的研究J.實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2005(4):58594王玉賢，相玉紅，強(qiáng)洪，儀器法測(cè)定蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究J.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2006(6):3132Fenn JB,Mann M, Meng CK, Wong SF,Whitehouse CM ， Electrospray ionization formass spectrometry of large biomoleculesJ. Scienee, 1 989,246( 4926): 6471*黃明智，明膠化學(xué)基礎(chǔ)講座一一凝膠層析法J.明膠科學(xué)與技術(shù)，1982 (3): 148- 1547 于志鵬，趙文竹，于一丁