酶工程山東師范大學(xué)ppt課件

1、第二章第二章 酶的生物合成與發(fā)酵消費(fèi)酶的生物合成與發(fā)酵消費(fèi) 提取分別法 微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 酶的消費(fèi)方法 生物合成法 植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 化學(xué)合成法 動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 第一節(jié)第一節(jié) 酶生物合成及調(diào)理酶生物合成及調(diào)理一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遺傳信息傳送的中心法那么遺傳信息傳送的中心法那么轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄傳傳送送給給RNA，再再由由RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制DNARNA 一一RNARNA的生物合成的生物合成-轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription)(transcription) 定義定義 以以DNADNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在為模板，以核苷三磷酸為底物，

2、在RNARNA聚合酶轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成聚合酶轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成RNARNA分子分子的過程。的過程。. .轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄模板啟動(dòng)子啟動(dòng)子promotor) 終止子終止子(terminator)模板鏈模板鏈template strand反意義鏈反意義鏈(antisense strand)編碼鏈編碼鏈 (coding strand)有意義鏈有意義鏈(sense strand)5533反意義鏈反意義鏈: :指點(diǎn)轉(zhuǎn)錄作用的一條指點(diǎn)轉(zhuǎn)錄作用的一條DNADNA鏈鏈有意義鏈有意義鏈: :無轉(zhuǎn)錄功能的一條無轉(zhuǎn)錄功能的一條DNADNA鏈鏈. .T C G A G T A CA G C T C A T GC G

3、A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶有意義鏈有意義鏈反意義鏈反意義鏈RNAPPi5 55 53 3GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成3 33 35 5RNA的轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄過程(三步三步)1.1.起始起始2.2.延伸延伸3.3.終止終止 原核生物的RNA聚合酶(DDRP)E. coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體 2 核心酶（core enzyme）全酶（holoenzyme）起始因子RNARNA合成過程合成過程起始起始雙鏈雙鏈DNA部分解開部分解開磷酸二酯磷酸二酯鍵構(gòu)成鍵構(gòu)成終止階段終止階段解鏈區(qū)到達(dá)解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)基因終

4、點(diǎn)延伸階段延伸階段53 RNA 啟動(dòng)子啟動(dòng)子promotor) 終止子終止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 35 3553 分開分開RNA鏈的延伸圖解鏈的延伸圖解35RNA-DNA雜交螺旋雜交螺旋聚合酶的挪動(dòng)方向聚合酶的挪動(dòng)方向新生新生RNA復(fù)鏈復(fù)鏈解鏈解鏈有義鏈有義鏈模板鏈反義鏈模板鏈反義鏈延伸部位延伸部位 定義定義 以以mRNAmRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上經(jīng)過各種體上經(jīng)過各種tRNAtRNA、酶和輔助因子的作用，合、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。成多肽鏈的過程。酪酪5 55 53 3AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪

5、氨酰- tRNA反密碼反密碼mRNA密碼與反密碼的堿基配對(duì)密碼與反密碼的堿基配對(duì)AUG ACA5 5蛋蛋蘇蘇UGUGUU3 3受受 位位(A位位)給給 位位(P位位)大亞基大亞基小亞基小亞基 蛋白質(zhì)的合成過程蛋白質(zhì)的合成過程 大腸桿菌大腸桿菌v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始v 肽鏈的延伸肽鏈的延伸v 肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放反響式：反響式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA+AMP+PPi -tRNA+AMP+PPi 對(duì)于對(duì)于E.coliE.coli而言，肽鏈合成時(shí)的

6、第一而言，肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸fMetfMet。1 1、起始階段、起始階段2 2、延伸階段、延伸階段3 3、終止階段、終止階段肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的起始階段1.mRNA1.mRNA與小亞基結(jié)合：構(gòu)成與小亞基結(jié)合：構(gòu)成30S-mRNA-IF330S-mRNA-IF3復(fù)復(fù)合物合物2.AUG2.AUG與蛋氨酰與蛋氨酰-tRNA-tRNA結(jié)合：結(jié)合： 30S-mRNA-IF330S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAmRNA的起始密碼子

7、上的起始密碼子上AUGAUG。3.3.大小亞基結(jié)合大小亞基結(jié)合IF130S30S起始復(fù)合物起始復(fù)合物AUG ACA5 53 3AUG ACA5 53 3UACUACAUG ACA5 53 3小亞基小亞基mRNA蛋氨酰蛋氨酰tRNA GTP大亞基大亞基GDP+Pi受位受位給位給位蛋蛋蛋蛋肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的延伸階段肽鏈合成的延伸階段1.1.進(jìn)位進(jìn)位: :氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA進(jìn)入受位進(jìn)入受位; ;2.2.轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)肽: :構(gòu)成肽鍵構(gòu)成肽鍵, ,在轉(zhuǎn)肽酶作用下在轉(zhuǎn)肽酶作用下, ,給給位與位與 受位結(jié)合受位結(jié)合; ;3.3.移位移位: :核蛋白體向核蛋白體向3 3端挪

8、動(dòng)一個(gè)密碼子端挪動(dòng)一個(gè)密碼子的的 位置位置, ,空出受位空出受位, ,不斷地進(jìn)位、不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)肽、 移位移位, ,使肽鏈延伸。使肽鏈延伸。AUG ACA5 53 3UAC蛋蛋蘇蘇UGUAUG ACA5 5UAC蛋蛋蘇蘇UGUGUUAUG ACA5 5UAC蛋蛋蘇蘇UGUGUUAUG ACA5 5蛋蛋蘇蘇UGUGUU3 33 33 3GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始復(fù)合體起始復(fù)合體進(jìn)位進(jìn)位轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)肽移位移位Mg+K+肽鏈合成的終止階段肽鏈合成的終止階段1.1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合; ;2.2.肽鍵水解肽鍵水解, ,多肽釋放多肽釋放; ;3.tR

9、NA,mRNA,3.tRNA,mRNA,大小亞基解離大小亞基解離. . AUG UAA5 5UACAUG UAA5 5UAC3 33 3終終終終AUG UAA5 5UAC3 3終終5 53 3UAC終終肽鏈肽鏈定義：經(jīng)過調(diào)理酶合成的量來控制定義：經(jīng)過調(diào)理酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)理機(jī)制，是在微生物代謝速度的調(diào)理機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄程度上進(jìn)展的?；蜣D(zhuǎn)錄程度上進(jìn)展的。意義：經(jīng)過阻止酶的過量合成，節(jié)意義：經(jīng)過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。約生物合成的原料和能量。 支配子基因表達(dá)的協(xié)同單位支配子支配子構(gòu)造基因編碼蛋白質(zhì)構(gòu)造基因編碼蛋白質(zhì), structural gene, S控制

10、部位控制部位支配基因支配基因operator gene, O啟動(dòng)子啟動(dòng)子promotor gene, P基因支配子調(diào)理系統(tǒng)表示圖基因支配子調(diào)理系統(tǒng)表示圖 調(diào)理基因 啟動(dòng)基因 支配基因 構(gòu)造基因 DNA 轉(zhuǎn)錄 - RNA聚合酶 + 轉(zhuǎn)錄 翻譯 mRNA 翻譯 阻遏蛋白 蛋白質(zhì) 誘導(dǎo)劑 控制區(qū)控制區(qū) 信息區(qū)信息區(qū)支配子支配子 調(diào)理基因(regulator gene)： 可產(chǎn)生一種組成型調(diào)理蛋白(regulatory protein) 一種變構(gòu)蛋白，經(jīng)過與效應(yīng)物(effector) 包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改動(dòng)它與支配基因的結(jié)合力。 調(diào)理基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。RPOSD

11、N AC RP-cA M P復(fù) 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP復(fù)合物的作用表示圖 啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因promotor genepromotor gene啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子： 有兩個(gè)位點(diǎn)：有兩個(gè)位點(diǎn)： 1 1RNARNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)2 2cAMP-CAPcAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。的結(jié)合位點(diǎn)。CAPCAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白catabolite catabolite gene activator proteingene activator protein，又稱環(huán)腺苷酸受，又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白體蛋白(cAMP receptor prot

12、ein(cAMP receptor protein，CRPCRP。 只需只需cAMP-CRPcAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，上，RNARNA聚合酶才干結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，聚合酶才干結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才干開場(chǎng)。酶的合成才干開場(chǎng)。 支配基因支配基因Operater geneOperater gene: : 位于啟動(dòng)基因和構(gòu)造基因之間的一位于啟動(dòng)基因和構(gòu)造基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)理基因產(chǎn)段堿基順序，能特異性地與調(diào)理基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，支配酶合成的時(shí)機(jī)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，支配酶合成的時(shí)機(jī)與速度。與速度。構(gòu)造基因構(gòu)造基因Struc

13、tural geneStructural gene: : 決議某一多肽的決議某一多肽的DNADNA模板，與酶有模板，與酶有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為錄為mRNAmRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。，再翻譯為蛋白質(zhì)。( (二二) ) 酶合成調(diào)理的類型酶合成調(diào)理的類型 1.1.誘導(dǎo)誘導(dǎo) (induction) (induction) 組成酶：細(xì)胞固有的酶類。組成酶：細(xì)胞固有的酶類。 誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為順應(yīng)外來底物或誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為順應(yīng)外來底物或其構(gòu)造類似其構(gòu)造類似 物而暫時(shí)合成的一類酶。物而暫時(shí)合成的一類酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) (repr

14、ession) 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite (catabolite repression)repression) 反響阻遏反響阻遏(feedback repression)(feedback repression)3闡明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原那么：需求時(shí)才合成。調(diào)理調(diào)理基因基因支配支配基因基因乳糖構(gòu)造基因乳糖構(gòu)造基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白有活性有活性基基 因因 關(guān)關(guān) 閉閉啟啟動(dòng)動(dòng)子子ORPLacZLacYLaca調(diào)理調(diào)理基因基因支配支配基因基因乳糖構(gòu)造基因乳糖構(gòu)造基因啟啟動(dòng)動(dòng)子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白無活性無活性

15、 基基 因因 表表達(dá)達(dá)mRNAA、乳糖支配子的構(gòu)造、乳糖支配子的構(gòu)造B、乳糖酶的誘導(dǎo)、乳糖酶的誘導(dǎo) 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白有活性有活性誘導(dǎo)誘導(dǎo) 2. 2.末端產(chǎn)物阻遏末端產(chǎn)物阻遏 由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。起的阻遏。 酶合成阻遏的景象：酶合成阻遏的景象： 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)： 1 1大腸桿菌生長(zhǎng)在無機(jī)鹽和葡萄糖大腸桿菌生長(zhǎng)在無機(jī)鹽和葡萄糖的培育基上時(shí)，的培育基上時(shí)， 檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；酸合成酶的存在； 2 2在上述培育基中參與色氨酸，檢在上述培育基中參與色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸

16、合成酶的活性降低，直至消逝。直至消逝。 3 3闡明色氨酸的存在阻止了色氨酸闡明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，表達(dá)了菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)合成酶的合成，表達(dá)了菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原那么原那么: :不需求就不合成。不需求就不合成。 色氨酸支配子色氨酸支配子酶的阻遏酶的阻遏調(diào)理基因調(diào)理基因支配基因支配基因構(gòu)造基因構(gòu)造基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能與支配基因結(jié)合，阻遏蛋白不能與支配基因結(jié)合，構(gòu)造基因表達(dá)構(gòu)造基因表達(dá)調(diào)理基因調(diào)理基因支配基因支配基因構(gòu)造基因構(gòu)造基因輔阻遏物輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與支配基因結(jié)合，構(gòu)造與支配基因結(jié)合，構(gòu)

17、造基基因不能表達(dá)因不能表達(dá)酶酶的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)和和阻阻遏遏支支配配子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑支配基因支配基因啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因調(diào)理基因調(diào)理基因構(gòu)造基因構(gòu)造基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻撓支配基因阻遏蛋白阻撓支配基因構(gòu)造基因不表達(dá)構(gòu)造基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻撓支配基因的作用到阻撓支配基因的作用,構(gòu)造基因可以表達(dá)構(gòu)造基因可以表達(dá)酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟支

18、配基因結(jié)合阻遏蛋白不能跟支配基因結(jié)合, 構(gòu)造基因可以表達(dá)構(gòu)造基因可以表達(dá)阻遏蛋白阻遏蛋白(無活性無活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋從而使阻遏蛋白可以阻撓支配基因白可以阻撓支配基因,構(gòu)造基因不表達(dá)構(gòu)造基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物調(diào)控方式 阻遏蛋白 添加物 與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性阻遏物不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏支配子模型調(diào)控作用對(duì)比酶合成的誘導(dǎo)與阻遏支配子模型調(diào)控作用對(duì)比3.3.分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏n指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物碳源或氮指細(xì)胞

19、內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物碳源或氮源存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻源存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的景象。遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的景象。n分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是經(jīng)用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是經(jīng)過甲碳源或氮源等在其分解過程中所過甲碳源或氮源等在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏景象：分解代謝物阻遏景象： 實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基上生實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才

20、開場(chǎng)長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開場(chǎng)利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開一利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開一個(gè)生長(zhǎng)延滯期的個(gè)生長(zhǎng)延滯期的“二次生長(zhǎng)景象二次生長(zhǎng)景象(diauxie或或biphasic growth。02468020406080 細(xì)胞 濃 度(OD)時(shí) 間(h) 這一景象又稱葡萄糖效應(yīng)，這一景象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的緣由是由于葡萄糖降解產(chǎn)生的緣由是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)理基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸此調(diào)理基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白受體蛋白CRPCRP, ,亦稱降解物亦稱降解物基因活化蛋白基因活化蛋白CAPCAP。分解代

21、謝物阻遏分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表達(dá)達(dá)CAP基因基因構(gòu)造基因構(gòu)造基因TCAPOCAP結(jié)結(jié)合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代謝產(chǎn)物謝產(chǎn)物腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白：降解物基因活化蛋白catabolic gene activation protein降低降低cAMP濃度濃度使使CAP呈失活形狀呈失活形狀三、提高酶產(chǎn)量的戰(zhàn)略三、提高酶產(chǎn)量的戰(zhàn)略一菌種選

22、育一勞永逸一菌種選育一勞永逸 1.誘變育種誘變育種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成選育組成型突變株型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜褪棺瓒粜妥優(yōu)槿プ瓒粜?選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株解除反響阻遏解除反響阻遏 選育構(gòu)造類似物抗性突變株選育構(gòu)造類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏解除分解代謝物阻遏選育抗分解選育抗分解代謝阻遏突變株代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種基因工程育種 二條件控制二條件控制1. 添加誘導(dǎo)物添加誘導(dǎo)物 酶的底物類似物最有效。酶的底物類似物最有效。2. 降低阻遏物濃度降低阻遏物濃度 除去終產(chǎn)物除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏產(chǎn)物阻遏 添加阻止產(chǎn)物構(gòu)成的抑制劑添

23、加阻止產(chǎn)物構(gòu)成的抑制劑 防止運(yùn)用葡萄糖防止運(yùn)用葡萄糖分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏 防止培育基過于豐富防止培育基過于豐富 添加一定量的添加一定量的cAMP3.3.添加外表活性劑添加外表活性劑 離子型離子型 對(duì)對(duì)細(xì)胞有毒害作用細(xì)胞有毒害作用外表活性劑外表活性劑 TweenTween8080 非離子型非離子型 添加細(xì)胞通透性添加細(xì)胞通透性 TritonXTritonX1001004. 4. 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑n 第二節(jié) 酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué) n一、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)n 在分批培育(batch culture)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)普通要閱歷延遲期、指數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期和衰亡期5個(gè)階段。 EDCBAO細(xì)

24、 胞濃度 (g/L)培 養(yǎng) 時(shí) 間 (h ) 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 O-A 延遲期 A-B指數(shù)生長(zhǎng)期 B-C減速期 C-D 靜止期 D-E 衰亡期 n 營(yíng)養(yǎng)物濃度生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度和生長(zhǎng)速率之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型n:比生長(zhǎng)速率1/h specific growth ratenmax：最大比生長(zhǎng)速率1/hnS：營(yíng)養(yǎng)物濃度生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度 克/LnKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù) 克/L，或 mol/LSKSXdtdXsm1 二、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)二、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) 一一 酶生物合成的方式酶生物合成的方式 根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為的關(guān)系，可將酶

25、的生物合成分為3 3種種方式，即：方式，即： 同步合成同步合成型型 生長(zhǎng)偶聯(lián)型生長(zhǎng)偶聯(lián)型 中期合成中期合成型型 部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型延續(xù)合成延續(xù)合成型型 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 滯后合成滯后合成型型1. 1. 生長(zhǎng)偶聯(lián)型又稱同步合成型生長(zhǎng)偶聯(lián)型又稱同步合成型 酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反響產(chǎn)物阻遏。代謝物阻遏和反響產(chǎn)物阻遏。 當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立刻停頓，闡明這類酶所對(duì)應(yīng)酶的合成立刻停頓，闡明這類酶所對(duì)應(yīng)的的mRNAmRNA

26、很不穩(wěn)定。很不穩(wěn)定。a 酶細(xì) 胞細(xì)胞 或酶濃 度時(shí)間生長(zhǎng)偶聯(lián)型中的特殊方式生長(zhǎng)偶聯(lián)型中的特殊方式中期合成型中期合成型 酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開場(chǎng)，而在細(xì)胞生出息入平衡期以后，酶的場(chǎng)，而在細(xì)胞生出息入平衡期以后，酶的合成也隨著停頓。合成也隨著停頓。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反響阻遏或分解特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反響阻遏或分解代謝物阻遏。代謝物阻遏。 所對(duì)應(yīng)的所對(duì)應(yīng)的mRNAmRNA是不穩(wěn)定的。是不穩(wěn)定的。02468100.00.10.20.30.40.5 細(xì) 胞濃度 酶 濃度細(xì)胞 濃 度 (OD500)酶濃 度(U/mL)時(shí)間 (h) 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

27、 2.2.部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型又稱延續(xù)合成型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型又稱延續(xù)合成型 酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開場(chǎng)，在酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開場(chǎng)，在細(xì)胞生出息入平衡期后，酶還可以延續(xù)合細(xì)胞生出息入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，普通不受分解代謝物和特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，普通不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。產(chǎn)物阻遏。 所對(duì)應(yīng)的所對(duì)應(yīng)的mRNAmRNA相當(dāng)穩(wěn)定。相當(dāng)穩(wěn)定。b酶細(xì)胞 細(xì)胞 或酶濃 度時(shí) 間040801200204060 細(xì) 胞濃度 酶濃度酶濃度(單位/ml)時(shí) 間 (h)0.012.525.037.550.0細(xì) 胞濃度(g/L) 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線黑曲霉聚半乳糖

28、醛酸酶合成曲線3. 3. 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型又稱滯后合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型又稱滯后合成型 只需當(dāng)細(xì)胞生出息入平衡期以后，酶只需當(dāng)細(xì)胞生出息入平衡期以后，酶才開場(chǎng)所成并大量積累。許多水解酶的生才開場(chǎng)所成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。 所對(duì)應(yīng)的所對(duì)應(yīng)的mRNAmRNA穩(wěn)定性高。穩(wěn)定性高。c酶細(xì)胞細(xì)胞 或酶濃 度時(shí) 間02040608001020304050 酶濃 度 細(xì)胞 濃 度細(xì)胞 濃 度 (g/L)時(shí) 間 (h)01020304050酶濃 度 (U) 黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 總結(jié)

29、：影響酶生物合成方式的主要要素 高：可在細(xì)胞停頓生長(zhǎng)后繼 1mRNA的穩(wěn)定性 續(xù)合成酶 差：隨著細(xì)胞停頓生長(zhǎng)而終 止酶的合成 2培育基中阻遏物的存在 不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開場(chǎng)酶的合成。 受阻遏：細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或平衡期后，酶才開場(chǎng) 合成。 酶消費(fèi)中最理想的合成方式：酶消費(fèi)中最理想的合成方式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開場(chǎng)生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直的明顯差別。細(xì)胞開場(chǎng)生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生出息入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成至細(xì)胞生出息入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。一段時(shí)間。 對(duì)于：對(duì)于：同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的同步合

30、成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNAmRNA的穩(wěn)定性，如降的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵低發(fā)酵 溫度溫度 。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使遏，使 酶的合成提早開場(chǎng)。酶的合成提早開場(chǎng)。中期合成型：要在提高中期合成型：要在提高mRNAmRNA穩(wěn)定性以及解除阻穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方遏兩方 面努力。面努力。( (二二) ) 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)普通產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：普通產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：XdtdE式中式中 X X細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度(g /L)(g /L) 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1)(h-1) 生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)(

31、IU/g) 非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(g(IU/(g h)h) E E酶濃度酶濃度(IU/L)(IU/L) t t時(shí)間時(shí)間(h)(h)生長(zhǎng)偶聯(lián)型生長(zhǎng)偶聯(lián)型XdtdE部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型 XXdtdE非生長(zhǎng)偶聯(lián)型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 XdtdE 第三節(jié)第三節(jié) 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶 一、產(chǎn)酶微生物的分別和選育一、產(chǎn)酶微生物的分別和選育 1.1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件 1 1酶產(chǎn)量高酶產(chǎn)量高 2 2易培育生長(zhǎng)速率高、營(yíng)養(yǎng)易培育生長(zhǎng)速率高、營(yíng)養(yǎng)要求低要求低 3 3遺傳性能穩(wěn)定，不易退化遺傳性能穩(wěn)定，不易退化 4 4易分別提純易分別提純 5

32、5平安可靠不是致病菌平安可靠不是致病菌2.2.常用的產(chǎn)酶微生物常用的產(chǎn)酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAspergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida 3. 3. 產(chǎn)酶微生物的分別和挑選產(chǎn)酶微生物的分別和挑選 1)1)樣品的采集樣品的采集: :從富含該酶作用底

33、物的場(chǎng)所采從富含該酶作用底物的場(chǎng)所采集樣品集樣品 2)2)富集培育富集培育: : 投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分別獲得微生物的純培育分別獲得微生物的純培育pure culturepure culture。 4)4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶程度相對(duì)較高的菌株，以質(zhì)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶程度相對(duì)較高的菌株，以質(zhì)為主。為主。 -淀粉酶的挑選蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法運(yùn)用含酪蛋白的培育基運(yùn)用含酪蛋白的培育基4.4.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育 誘變育種誘變育種 原生質(zhì)體交融育種原生質(zhì)體交融育種

34、基因工程育種基因工程育種 二二. .微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法 1.1.固體培育固體培育: :特別適宜于霉菌培育特別適宜于霉菌培育 2.2.液體培育液體培育: :目前酶發(fā)酵消費(fèi)的主要目前酶發(fā)酵消費(fèi)的主要方式方式 3.3.固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 : :需求特殊的固定化細(xì)需求特殊的固定化細(xì)胞反響器胞反響器 三三. .微生物酶的類型微生物酶的類型 1.1.胞外酶：大多是水解酶如淀粉酶、胞外酶：大多是水解酶如淀粉酶、蛋白酶、蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶，是微纖維素酶、果膠酶，是微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也細(xì)胞外的，即使胞

35、外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低程度，遭到的調(diào)理控制少。能維持較低程度，遭到的調(diào)理控制少。 2.2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揚(yáng)作用的酶，酶活性和濃度遭到中間產(chǎn)揚(yáng)作用的酶，酶活性和濃度遭到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。物和終產(chǎn)物的調(diào)控。試管菌種培養(yǎng)茄瓶菌種培養(yǎng)搖瓶菌種培養(yǎng)孢子（菌體）懸液制備種子罐菌種培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理酶的分離純化精制酶發(fā)酵消費(fèi)的普通工藝流程酶發(fā)酵消費(fèi)的普通工藝流程 第四節(jié)第四節(jié) 動(dòng)、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶動(dòng)、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶 與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培

36、育工藝。性，需采用各自不同的培育工藝。 動(dòng)物細(xì)胞方式圖植物細(xì)胞構(gòu)造 植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類細(xì)胞種類植物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小細(xì)胞大小/um20030011010100倍增時(shí)間倍增時(shí)間/h120.3-615營(yíng)養(yǎng)要求營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜光照要求光照要求大多數(shù)要求大多數(shù)要求不要求不要求不要求不要求對(duì)剪切力對(duì)剪切力敏感敏感大多數(shù)不敏感大多數(shù)不敏感非常敏感非常敏感主要產(chǎn)物主要產(chǎn)物色素、藥物、色素、藥物、香精、酶等香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫苗、激

37、素、疫苗、激素、單克隆抗體、單克隆抗體、酶等酶等三者之間的差別主要有：三者之間的差別主要有：植物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞。微生物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的消費(fèi)周期比微生動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的消費(fèi)周期比微生物長(zhǎng)。物長(zhǎng)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單。單。植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的消費(fèi)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的消費(fèi)要求一定的光照。要求一定的光照。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不一樣。物各不一樣。一、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶一、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶

38、 1.1.植物細(xì)胞培育的特點(diǎn)植物細(xì)胞培育的特點(diǎn) 2.2.培育基特點(diǎn)培育基特點(diǎn) 運(yùn)用最廣的是運(yùn)用最廣的是MSMS培育基和培育基和LSLS培育基培育基 MSMS培育基是培育基是19621962年由年由MurashingeMurashinge和和SkoogSkoog為煙草細(xì)胞培育而設(shè)計(jì)的培育基。為煙草細(xì)胞培育而設(shè)計(jì)的培育基。LSLS培育基是在其根底上演化而來的。培育基是在其根底上演化而來的。3.3.培育方法：培育方法：懸浮細(xì)胞培育懸浮細(xì)胞培育細(xì)胞株的建立；外植體與愈傷組織細(xì)胞株的建立；外植體與愈傷組織擴(kuò)展培育；擴(kuò)展培育；大罐培育；大罐培育；外植體：外植體： 從植株取出，經(jīng)過預(yù)處置后，用于植從植株取出

39、，經(jīng)過預(yù)處置后，用于植物組織培育的植物組織包括根、莖、葉、物組織培育的植物組織包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等的片段或小塊。芽、花、果實(shí)、種子等的片段或小塊。愈傷組織：愈傷組織： 將上述外植體植入誘導(dǎo)培育基中，于將上述外植體植入誘導(dǎo)培育基中，于2525左右培育一段時(shí)間，從外植體的切口左右培育一段時(shí)間，從外植體的切口部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。水稻的外植體幼水稻的外植體幼胚和愈傷組織胚和愈傷組織外植體外植體愈傷組織愈傷組織4. 4. 培育條件的影響與控制培育條件的影響與控制1 1溫度溫度2 2pHpH3 3通氣與攪拌通氣與攪拌4 4光照的控制光照的控制5 5前體的添加飼喂前體的添加飼

40、喂6 6誘導(dǎo)子誘導(dǎo)子elicitorselicitors的運(yùn)用的運(yùn)用5.5.植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶實(shí)例植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶實(shí)例 以大蒜細(xì)胞培育消費(fèi)超氧化物歧以大蒜細(xì)胞培育消費(fèi)超氧化物歧化酶化酶SODSOD為例為例(1)(1)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實(shí)、豐滿、無病蟲害的大選取結(jié)實(shí)、豐滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%70%乙醇消乙醇消毒毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然，然后無菌水漂洗后無菌水漂洗3 3次。次。 在無菌條件下，切成在無菌條件下，切成0.5cm30.5cm3的小的小塊，植入含有塊，植入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 的半固體的半固體MSMS培育基中，在培育基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照條件下培育光照條件下培育18d18d，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每