各種表達載體介紹

1、pET 載體中，目標基因克隆到 T7 噬菌體強轉(zhuǎn)錄和翻譯信號控制之下，并通過在宿主細胞提供 T7 RNA 聚 合酶來誘導(dǎo)表達。 Novagen 的 pET 系統(tǒng)不斷擴大，提供了用于表達的新技術(shù)和選擇，目前共包括 36 種 載體類型、 15 種不同宿主菌和設(shè)計用于有效檢測和純化目標蛋白的許多其它相關(guān)產(chǎn)品。優(yōu)點是原核蛋白表達引用最多的系統(tǒng)在任何大腸桿菌表達系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達水平最低 真正的調(diào)節(jié)表達水平的“變阻器”控制 提供各種不同融合標簽和表達系統(tǒng)配置 可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌 許多載體以 LIC 載體試劑盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 產(chǎn)物 許多宿主菌株以

2、感受態(tài)細胞形式提供，可立即用于轉(zhuǎn)化陽性 pFORCE TM 克隆系統(tǒng)具有高效克隆 PCR 產(chǎn)物、陽性選擇重組體和高水平表達目標蛋白等特點。pET 系統(tǒng)概述pET 系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統(tǒng)。 根據(jù)最初由 Studier 等開發(fā)的 T7 啟動子驅(qū) 動系統(tǒng)， Novagen 的 pET 系統(tǒng)已用于表達成千上萬種不同蛋白?？刂苹A(chǔ)表達水平pET 系統(tǒng)提供 6 種載體 - 宿主菌組合，能夠調(diào)節(jié)基礎(chǔ)表達水平以優(yōu)化目標基因的表達。沒有單一策略或 條件適用于所有目標蛋白，所以進行優(yōu)化選擇是必要的。宿主菌株質(zhì)粒在非表達宿主菌中構(gòu)建完成后，通常轉(zhuǎn)化到一個帶有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌（

3、 入DE3溶原菌）中表達目標蛋白。在入DE3溶原菌中，T7 RNA聚合酶基因由lacUV5啟動子控制。未誘導(dǎo)時便有一定程度轉(zhuǎn)錄，因此適合于表達其產(chǎn)物對宿主細胞生長無毒害作用的一些基因。而宿主菌帶有pLysS 和 pLyE時調(diào)控會更嚴緊。 pLys 質(zhì)粒編碼 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未誘 導(dǎo)細胞中轉(zhuǎn)錄目標基因的能力。 pLysS 宿主菌產(chǎn)生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌產(chǎn)生更多酶，因此 是最嚴緊控制的 入DE3溶原菌。有 11 種不同 DE3 溶原化宿主菌。使用最廣泛的為 BL21 及其衍生菌株，它的優(yōu)點在于缺失 lon 和 ompT蛋白酶

4、。 B834 菌株為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高 特異活性標記。 BLR 為 recA - 衍生菌株，改善了質(zhì)粒單體產(chǎn)量，有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列的目標質(zhì)粒。 兩個硫氧還蛋白還原酶 （ trxB ） 突變菌株 （AD494,BL21 trxB ） ，有利于大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株為 trxB/gor 雙突變，這兩個酶是主要還原途徑的關(guān)鍵酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要優(yōu)點是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株補充了四種大 腸桿菌稀有密碼子的

5、 tRNA ，改善了由于密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達。其它菌株背 景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一樣為 recA - 。這些菌株可穩(wěn)定表達其產(chǎn)物可能導(dǎo)致 DE3 噬菌體丟失的某些目標基因。由于存在 F 附加體編碼的高親和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 為一 個有用的嚴緊型宿主菌。此外，Novagen提供了入DE3溶原化試劑盒，用于制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。表達高毒性基因或制備新的入DE3溶原菌的另一替代方法是通過I CE6感染提供T7 RNA聚合酶。雖然不如用IPTG誘導(dǎo) 入DE3溶原菌方便，這種策略也被優(yōu)先用于一

6、些應(yīng)用中。高嚴緊性 T7 Iac 啟動子除了在宿主菌水平選擇三種基本的表達嚴緊性， pET 系統(tǒng)中 T7 啟動子本身提供了兩種不同的嚴緊性選 擇：普通 T7 啟動子和 T7 Iac 啟動子。 T7 Iac 啟動子在啟動子區(qū)下游 17bp 處含有一個 25bp 的 Iac 操 縱序列。該位點結(jié)合lac 阻遏蛋白能夠有效降低 T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，這樣提供了在入DE3溶原菌中抑制基礎(chǔ)表達的第二種基于 IacI 的機制（除了抑制 IacUV5 ）。含 T7 Iac 啟動子的 pET 質(zhì)粒還具有它 們自己的 lacI ，確保足夠的阻遏蛋白結(jié)合到操縱基因位點上。在實際應(yīng)用中，為了獲得最高產(chǎn)量的蛋白，

7、通常應(yīng)該測試多種不同的載體/ 宿主菌組合?？刂普T導(dǎo)的表達水平 在許多情況下，表達活性可溶性最好的蛋白依賴于宿主細胞的背景、培養(yǎng)條件和合適的載體配置。通常， 目標蛋白活性最高的條件與產(chǎn)量最高的條件不一致。除了根據(jù)載體 / 宿主菌組合控制 T7 RNA 聚合酶的基 礎(chǔ)表達提供不同嚴緊性， pET 系統(tǒng)還根據(jù)誘導(dǎo)物 （ IPTG ）濃度，對目標蛋白表達提供了真正的“變阻器” 控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突變使這種控制成為可能。選擇 pET 載體所有的 pET 載體均來自 pBR322 ，但彼此間先導(dǎo)序列、表達信號、融合標簽、相關(guān)限制性位點和其它特點 有所不同。有兩大

8、類 pET 質(zhì)粒，即轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體： 轉(zhuǎn)錄載體（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表達目標 RNA ，但不提供翻譯信號。它們用于從自身帶 有細菌翻譯信號的目標基因表達蛋白。（注意：轉(zhuǎn)錄載體通過命名后面的一個缺失字母后綴加以區(qū)分） 翻譯載體含有設(shè)計用于蛋白表達的有效翻譯起始信號。許多載體在讀碼框 a 、 b 和 c 中帶有克隆位點， 分別對應(yīng)于 BamH I 位點的 GGA 、 GAT 和 ATC 三聯(lián)體。選擇要點選擇用于表達的 pET 載體通常涉及多種因素?？紤]以下三個主要因素：所表達蛋白的用途所表達蛋白的已知信息 克隆策略pET 載體表達的蛋白用途各種各樣。例如，

9、表達量為分析級的蛋白可用于活性研究、突變體篩選和定性、 篩選配體相互作用和抗原制備。大量活性蛋白用于結(jié)構(gòu)研究、試劑或親和基質(zhì)制備。許多載體適合表達用 于篩選或抗原制備的分析量蛋白，然而只有載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合十分適宜才可能用于大量純化。 如果需要活性蛋白連續(xù)高產(chǎn)，應(yīng)該試驗多種載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合以找到最優(yōu)化結(jié)果。任何關(guān)于目標蛋白的已知信息都有助于載體選擇。例如，一些蛋白的活性要求一個或兩個末端沒有外源序 列。許多 pET 載體能夠克隆非融合序列， 然而如果特定翻譯起始序列不能在大腸桿菌中有效利用， 表達水 平可能受影響。在這些情況下，?？捎糜行П磉_的氨基末端序列構(gòu)建融合蛋白，然后在

10、純化后用位點特異 性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （連接非依賴的克?。┎呗詫@種方法特別有用，因為克隆操作通過腸 激酶和因子 Xa 能夠去除所有氨基端載體編碼序列。由于限制性位點和讀碼框相容性的需要， 克隆策略也會影響載體選擇。 由于許多 pET 載體具有共同的限制 性位點配置，通?？赡軐⒁淮沃苽涞哪繕嘶蚩寺〉綆讉€載體中。 采 PCR 克隆策略時則有不同的考慮。 LIC 載體試劑盒推薦用于此目的，可通過 PCR 制備插入片段，而不需要限制性消化載體或插入片段。溶解性和細胞定位 考慮了目標蛋白的應(yīng)用和克隆策略，還應(yīng)該確定目標蛋白的細胞定位和溶解性，這一點十分重要。在許多 實際應(yīng)用中常希望表

11、達可溶的活性蛋白。特定目標蛋白的溶解性取決于多種因素， 包括各自的蛋白序列。 在許多情況下， 溶解性不是有或無的現(xiàn)象，載體、宿主菌和培養(yǎng)條件可被用來增加或減少獲得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 載體系列使目標 序列與通常能夠增加可溶性蛋白比例的硫氧還蛋白 （Trx.Tag ） 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通過 大量系統(tǒng)篩選而得到的一種過量表達時具有極高溶解性的大腸桿菌蛋白-Nus.Tag 融合伴侶，從而進一步提高了目標蛋白的可溶性。此外， trxB 突變株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在

12、胞漿中形成許多真核蛋白正確折迭和活性所要求的二硫鍵。低溫誘導(dǎo)（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目標蛋白的比例。獲得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周質(zhì)中，為折迭和二硫鍵形成有更適宜的環(huán)境。為了 達到這一目的，通常使用帶信號肽的載體。一些純化策略可以優(yōu)化胞質(zhì)中不溶性包涵體的產(chǎn)量。抽提包涵體并溶解，然后目標蛋白在體外重新折迭（ 如使用 Novagen 的蛋白折迭試劑盒 ） 。該過程通常產(chǎn)生高產(chǎn)量初始蛋白并防止宿主細胞中的蛋白降解。 然而，重新折迭成活性蛋白的效率隨不同蛋白變化很大，可能相當?shù)汀?pET-31b （ + ）載體專為產(chǎn)生不 可溶融合蛋白而設(shè)計，提供了生產(chǎn)小蛋

13、白和多肽的有效方法。滿足不同需要的融合標簽如果融合序列不影響應(yīng)用，生產(chǎn)帶有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白會很方 便后續(xù)操作，并易于通過蛋白雜交檢測。這些多肽（融合序列很?。鼈兊臋z測試劑極特異和靈敏。通 過使用相應(yīng)樹脂和緩沖液試劑盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于親和純化。使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析試劑盒可對粗提或純化的融合蛋白準確定量。采用一種新穎底物的FRETWorks S.Tag 分析試劑盒可通過熒光檢測到少于 1fmol 的融合蛋白。His.Tag a 序列作為純化蛋白的融

14、合伴侶非常有用，尤其對那些以包涵體形式表達的蛋白來說，它可以使 親和純化可在溶解蛋白的完全變性條件下進行。CBD.Tag a 在低費用親和純化中非常有用。它們也特別適用于重新折迭（特別是帶有CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ）。因為只有正確重新折迭的 CBDs 結(jié)合到纖維素基質(zhì)上， CBIND 親 和純化步驟能夠從制備物中去除不正確折迭的分子。 任何標簽可用于固定目標蛋白， 但由于 CBD.Tag 序列 的低非特異性結(jié)合以及與纖維素基質(zhì)的生物相容性，使它更適合用于這一目的。Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用來增加其

15、融合伴侶的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 載體與利于 在胞漿中形成二硫鍵的 Origami 宿主菌相容。各種融合標簽和相應(yīng) pET 載體見列表。 一些 pET 載體帶有數(shù)個 * 的融合標簽， 作為 5' 融合伴侶。 此外， 許多載體通過目標基因序列符合讀碼框的通讀而表達末端帶有不同多肽標簽的融合蛋白。使用在 5' 標簽 和目標序列之間含有蛋白酶切割位點(凝血酶、因子 Xa 和腸激酶)的載體，可以在純化后選擇性去除一 個或多個標簽。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是細胞定位

16、和 親和標簽配置良好的代表。 pET Ek/LIC 載體 Combo 試劑盒包括所有 4 種即用型載體，可直接用于構(gòu)建 數(shù)種目標基因構(gòu)型。pET NusA 融合系統(tǒng) 43.1在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性活性蛋白新推出的 pET NusA 融合系統(tǒng)設(shè)計用于克隆和高水平表達與495aa NusA ( Nus.Tag )蛋白融合的多肽序列。對數(shù)據(jù)庫中 4000 個以上蛋白進行可溶性建模， NusA 蛋白被確認為具有最高的可溶性。在用四種不 同 NusA 融合蛋白進行的試驗中，大于 85% 的表達蛋白都是可溶的。 pET-43.1 載體含有 Nus.Tag 融合伴侶并與 trx/gor突變體 Origami

17、 和 OrigamiB 菌株相容， 有利于在胞漿中形成二硫鍵。 使用 pET-43.1載體和這些 trx/gor宿主菌組合可能獲得二硫鍵結(jié)合的蛋白。優(yōu)點 高可溶性的 N-末端 Nus.Tag 融合伴侶 上游 His.Tag a、 S.Tag 和可選擇的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合標簽?zāi)负湍c激酶切割位點多克隆位點位于所有讀碼框中 與 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促進表達蛋白的正確折迭pET 宿主菌株感受態(tài)細胞所有 pET 系統(tǒng)宿主菌以預(yù)測試的感受態(tài)細胞形式提供，可立即用于轉(zhuǎn)化。(DE3 )指宿主為 入DE3溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由lac

18、UV5啟動子控制的T7 RNA聚合酶基因。這類菌株適用于從克隆到 pET 載體的目標基因生產(chǎn)蛋白。 命名為 pLysS 和 pLysE 的宿主菌帶有編碼 T7 溶菌酶(為 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物)的 pET 相容性質(zhì)粒。帶有 pLysS 的細胞產(chǎn)生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌產(chǎn)生更大量酶。這些菌株用于在誘導(dǎo)前抑制 T7 RNA 聚合酶的基礎(chǔ)表達，這樣可以穩(wěn)定編碼影響細胞生長和活力的目標蛋白的pET 重組體。帶有 pLacI 的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制 pETBlue 和pTriEx 載體基礎(chǔ)表達的 lac 阻遏蛋白。入DE3溶原化試劑盒用于制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。AD494

19、 菌株為硫氧還蛋白還原酶 ( trxB )突變菌株，能夠在胞漿內(nèi)形成二硫鍵，提供了生產(chǎn)正確折迭的活性蛋白的潛力。 TrxB 突變可用卡那霉素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的質(zhì)粒。B834 為 BL21 的親本菌株。這些蛋白酶缺陷宿主菌為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代 甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記，從而用于結(jié)晶學研究。BL21 應(yīng)用最廣的宿主菌來源，具有 lon和 ompT 蛋白酶缺陷的優(yōu)點。BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有與 AD494 菌株相同的硫氧還蛋白還原酶突變 ( trxB )。由于 trxB 宿主有利于胞漿內(nèi)二

20、硫鍵形成，它們的使用可增加正確折迭的蛋白組分。TrxB 突變可用卡那霉素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的質(zhì)粒。BLR 為 BL21 的 recA - 衍生菌株，能夠改善質(zhì)粒單體產(chǎn)量，有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列或其產(chǎn)物能夠引起DE3 噬菌體丟失的目標質(zhì)粒。HMS174菌株在K-12背景上提供了 recA突變。與BLR 一樣，這些菌株能夠穩(wěn)定其產(chǎn)物能夠引起DE3噬菌體丟失的某些目標基因。NovaBlue 適合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高轉(zhuǎn)化效率、藍 / 白斑篩選能力(與合適質(zhì)粒)和導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒 DNA 高產(chǎn)的 recA endA 突變。由于存在 F 附加體編碼的 l

21、acI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的DE3 溶原菌是一個非常有用的嚴緊型宿主菌。Origami為K-12衍生的宿主菌，硫氧還蛋白還原酶突變 （trxB ） 和谷胱甘肽還原酶（gor ） 基因均為 突變，能夠大大增強胞漿內(nèi)二硫鍵的形成。研究表明即使總體表達水平相似，Origami （ DE3 ）表達的活性蛋白比其它宿主菌高 10倍以上。Origami宿主菌與氨芐抗性質(zhì)粒相容， 可用于pET-32載體，硫氧 還蛋白標簽?zāi)軌蜻M一步增強在胞漿內(nèi)形成二硫鍵。TrxB和gor突變可分別用卡那霉素和四環(huán)素選擇， 因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla的pET質(zhì)粒。Origami B 宿主菌來源于

22、BL21 lacZY 突變株，還帶有與原始 Origami菌株相同的TrxB / gor 突變。Origami B菌株集BL21、Tuner和Origami宿主菌的優(yōu)點于一體。TrxB 和gor突變可分別用卡那霉素和四環(huán)素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記bla的pET質(zhì)粒。Rosetta宿主菌從BL21衍生而來，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補充密碼子 AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。這樣Rosetta 菌株提供了“萬能”的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導(dǎo)致的表達限制。tRNA基因由它們的天然啟動子驅(qū)動

23、。在 Rosetta （ DE3） pLysS 和Rosetta （ DE3） pLacI 中，稀有tRNA 基因存在 于分別帶有T7溶菌酶和lac 阻遏基因的同一質(zhì)粒上。Tuner菌株為BL21的lacZY 缺失突變株，能夠調(diào)整培養(yǎng)物中所有細胞的蛋白表達水平。lac通透酶（lacY ）突變使得IPTG均勻進入群體所有細胞，從而具有濃度依賴、水平均一的誘導(dǎo)表達。通過調(diào)整IPTG濃度，表達可從極低水平調(diào)節(jié)到極強、完全誘導(dǎo)的表達水平（通常與pET載體相關(guān)）。低水平表達有時可能增強難表達蛋白的溶解性和活性。Tuner （ DE3）pLacI菌株與pETBlue和pTriEx 載體的表達相容。建議兄弟

24、首先學習本版以前的帖子。搬出老帖子，我們共同學習一下：eeflying:原核表達系統(tǒng)中，哪種載體最好？原核表達沒有最好，可以說一般都是在碰，和你要表達蛋白的性質(zhì)有關(guān)，也和你表達后的用途，及因此而選擇的表達策略有關(guān)。比如，1。你是否介意有親和標簽，親和純化當然純化相對容易，但有時親和標簽的存在會影響蛋白的功能，2。如果用親和標簽，用什么親和純化策略，his或GSH還是染料抑或是IgG-ProteinA 親和，LAB的IMPAC-TWIN還是別的如轉(zhuǎn)鐵蛋白等，親和層析的策略也有很多，3。最終產(chǎn)物是否有必要將親和標簽去掉，如用蛋白酶切掉標簽，或IMPAC-TWIN會自己切掉，用因子 X切掉HIS,4

25、。表達的部位，是可溶性表達還是包涵體表達，是周質(zhì)表達還是分泌表達還是分泌表達。5。是否加入開關(guān)誘導(dǎo)、或是加入IPTG誘導(dǎo)噬菌體T7系統(tǒng)。6。你表達的蛋白質(zhì)是否會與細菌內(nèi)某些蛋白相互作用而致表達失敗。7。如果不用親和標簽，純化用什么方法純化？8。即使都考慮全了，表達也未必成功，換載體是很常見的是。9。載體選好后，表達條件的優(yōu)化，如培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間，IPTG濃度 等，我們一般在這部用正交設(shè)計或析因設(shè)計決定。10。蛋白純化條件的優(yōu)化，用均勻設(shè)計或球面設(shè)計或正交設(shè)計作曲線擬合，通過導(dǎo)數(shù)求極值的方法優(yōu)化 蛋白純化條件。這些問題是相互關(guān)聯(lián)的，在實踐中可得有一段時間去摸索了。YONG: 原核表達系統(tǒng)中，哪

26、種載體最好？載體沒有最好，看哪一種最合適你的實驗?zāi)康?。這幾年新發(fā)展的載體一般具有下列特點的一個或多個：1）更多的融合標簽選擇（提供多種親和純化方便）2）嚴緊的表達調(diào)控，更低的滲漏表達3）分子伴侶蛋白，促進折疊和可溶性表達 此外，具有更好的質(zhì)粒穩(wěn)定性并能夠糾正遺傳密碼偏愛的新的蛋白酶缺陷的宿主細胞也是一個很好的工具。最新的不一定是最好的，PBV220經(jīng)?？梢越o出不錯的表達，雖然多半是包含體。YONG: 關(guān)于表達載體不同的載體的特點不同，主要的差別有啟動子類型，質(zhì)?？截悢?shù)等，基因本身的因素基因5'非編碼區(qū)的二極結(jié)構(gòu)，密碼子的偏愛性等，宿主菌的特點也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合

27、表達策略也有利于順利表達外源蛋白。這些就決定了對某一個特定的基因而言，并非所有的表達載體都適合?，F(xiàn)在還沒 有誰可以用大腸桿菌成功表達每一個基因，尤其是使用指定的表達系統(tǒng)更是不可能。根據(jù)研究的目的以及 基因和載體的特點選擇表達系統(tǒng)，說說容易，做起來很難。SDS-PAG所顯示的不表達很多情況下是低表達，尤其是當目的蛋白遷移率與菌體中某種豐富蛋白一致時， 不高的表達帶常被遮蓋。 Western blotting 的靈敏度高，可以用來檢測很低的表達。對于某些研究來說，表達是為了在細胞內(nèi)提供某種功能，不需要高表達；更多的情況是把大腸桿菌作為制 備重組蛋白的細胞工廠，此時表達量具有重要意義，低表達為蛋白純

28、化帶來困難，對于某些研究或開發(fā)來 說，低表達意義不大。 當然，通過 western blotting 檢測可以排除一些基因表達中的不確定或待確定因 素，而且某些時候即使是高表達， western blotting 也是蛋白定性的重要指標。YONG: 請教 -PET 表達我試著說一下：1 ）如何獲得非融合高效表達？ 高效的非融合表達很多情況下是大腸桿菌表達最愿意看到的結(jié)果，如果是可溶性的，可能會讓大部分研究 者更加興奮。但理想和現(xiàn)實是有差距的。憑心而論，你做的還是不錯的，畢竟看到了高效表達，雖然是包 含體，雖然信號肽的切割情況不明，畢竟你可以拿到東西了?？梢栽囈幌掳w的復(fù)性和純化，測測活吧！

29、否定一個信心苦苦得出的結(jié)果要慎重呀！ 下面討論一下如何實現(xiàn)更高的追求：首先是老生長談，影響大腸桿菌表達的因素：遺傳密碼偏愛性、mRNA5S級結(jié)構(gòu)、第二密碼子等，參見各種綜述和論壇中的帖子。融合表達優(yōu)化了上述影響表達的因素，所以更容易成功。很多藥用蛋白的表達也采用了融合表達策略，可 能是無奈的選擇，也可能是為了獲得可溶性表達或為了獲得有利于初步純化的性質(zhì)并成功的解決了酶切或 化學切割融合頭后目的蛋白的純化。 IL-11 就是這樣的例子。所以非融合表達并不是一無是處，關(guān)鍵看有 沒有辦法達到最后的目的。如果是藥用蛋白，準備申報臨床，最好保持天然的N-末端，所以蛋白酶或化學切割要非常特異，不要再 N端

30、引入新的氨基酸或?qū)е履康牡鞍?N端不整齊。非融合表達的 N 端的 Met 一般是報批容許的，雖然這不是天然的形式。非融合表達省略了切割融合頭的步 驟和切割后的純化步驟，具有成本優(yōu)勢。非融合表達的實現(xiàn)首先需要分析，其次看運氣，有時運氣因素更 多。盡可能把影響基因表達的因素都考慮到并逐個優(yōu)化要花費很大的精力，但這并不能保證這種優(yōu)化一定 會得到理想的結(jié)果，未知的因素和因素之間的作用使得完美的優(yōu)化方案非常難實現(xiàn)，而且基因本身的因素 也不允許隨心所欲的優(yōu)化（比如氨基酸序列不能任意改變）。原核表達的特點就是時間短、花錢少，所以 多方案的嘗試和理性的分析結(jié)合是大多數(shù)研究者采用的基本策略。具體到你的實驗來說，

31、如果你是要做藥 用蛋白，在融合表達成功后可以 a.純化一點蛋白，看看 N-末端；b.在你的融合頭后面引入一個切割位點， 切割后產(chǎn)生天然N-末端。選擇策略看你們實驗室的傳統(tǒng)，怎么方便怎么做。有的實驗室純化能力強，有得 上游強。不管如何，建立有效的測活方法很關(guān)鍵，這可以為表達策略和純化策略提供指引。 至于可溶性表達，看情況吧！如果你的包含體復(fù)性很成功，不必強求可溶性。降低誘導(dǎo)溫度，降低菌生長 速度和基因表達速度，降低總表達量，把蛋白導(dǎo)入周質(zhì)空間和使用具有分子伴侶功能的融合等策略有助于 實現(xiàn)可溶性表達，但都沒有把握。如果你的蛋白的二硫鍵非常多，可溶性表達難度會較大。這些一般的原 則很多綜述或研究論文

32、都有不同角度的表述，關(guān)鍵是結(jié)合自己的研究目的和實驗室的條件靈活運用。 2）基因往表達載體中克隆失敗。 可能是克隆的操作問題， 也可能是這種表達方式導(dǎo)致的表達對細胞生長有 不利影響或重組后的質(zhì)粒不穩(wěn)定。驗證克隆操作可以通過載體自連對照解決， 如果載體自連后的轉(zhuǎn)化子沒有或很少， 說明酶切操作沒有問題。 如果表達產(chǎn)物對細胞有毒或質(zhì)粒不穩(wěn)定就不容易解決了，也許憑經(jīng)驗可以判斷原因，但更換載體、宿主或 表達方式可能是最常用的方法。YONG: 淺論基因表達系統(tǒng)的選擇因表達是基因工程的重要內(nèi)容，是工業(yè)、醫(yī)療和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。 基因表達系統(tǒng)按照基因表達宿主的性質(zhì)分為原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)兩類，前者主

33、要包括大腸桿菌表 達系統(tǒng)和枯草桿菌表達系統(tǒng)等，后者主要包括酵母表達系統(tǒng)、絲狀真菌表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 等。原核表達系統(tǒng)以大腸桿菌表達系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相 對簡單等優(yōu)點，缺點主要是蛋白質(zhì)翻譯后加工機制的缺乏，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊。 簡單單細胞真核生物表達系統(tǒng)以酵母表達系統(tǒng)為代表，其中甲醇酵母具有較大優(yōu)勢（主要包括畢赤酵母 Pichia pastoris 和漢森酵母 Hansenula ploymorpha ）。甲醇酵母表達系統(tǒng)主要優(yōu)點有：表達量高，表達 可誘導(dǎo)，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，容易實現(xiàn)高密發(fā)酵等。

34、缺點是并非所有基因都 可以獲得高表達，當然，這是幾乎所有表達系統(tǒng)的共同問題。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)主要優(yōu)點是蛋白翻譯后加工機制最接近體內(nèi)的天然形式，缺點是表達量通常較低， 生產(chǎn)成本高。表達系統(tǒng)選擇的根據(jù)是研究和開發(fā)的目的。具體考慮以下幾個方面： 目的基因的來源，如果是大腸桿菌來源的基因，選擇大腸桿菌作為表達系統(tǒng)較好，這主要是考慮到與目的 基因來源相同的宿主對于保證蛋白的活性較有利且基因遺傳密碼的偏愛性較一致。 生產(chǎn)的成本和工藝放大要求。大腸桿菌和畢赤酵母系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的成本低，生產(chǎn)工藝較簡單，用于規(guī) ?；a(chǎn)較有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考慮目的蛋白的活性和小規(guī)模純化制備的方便。 研究周

35、期和可操作性。在這一點上，大腸桿菌優(yōu)于酵母，酵母優(yōu)于細胞。 蛋白的用途和用量。對于藥品開發(fā)，這三種宿主都可以選擇，但要考慮到報批的要求。如果是體內(nèi)用，天 然的氨基酸序列較重要，最好不要因為基因表達和蛋白純化的便利引入融合伴侶，如果是制備抗原用于純 化和體外的活性研究則不必太嚴格。某些蛋白體內(nèi)活性需要的劑量并不大，如 angiostatin ，但是，大腸 桿菌或酵母表達的蛋白體內(nèi)半衰期短，所以蛋白用量較大。蛋白的天然性質(zhì)。 如果目的蛋白本身是分泌蛋白， 則選擇分泌表達較好， 畢赤酵母分泌表達優(yōu)勢非常顯著。 對于大腸桿菌系統(tǒng)來說，其蛋白的分泌機制復(fù)雜，除了信號肽之外，有些蛋白的分泌和與成熟蛋白的序

36、列 有關(guān)，而且大腸桿菌的分泌很難進入培養(yǎng)基，通常是在周質(zhì)空間積累。根據(jù)蛋白活性的要求，結(jié)合其天然 的性質(zhì)，選擇表達系統(tǒng)是非常重要的。知識產(chǎn)權(quán)的考慮。如果是研究工作，選擇商品化的載體較好，因為同行對這些載體也很了解，對于用這些 載體做出來的結(jié)果容易比較。如果是開發(fā)工作，選擇表達系統(tǒng)時最好是把載體的知識產(chǎn)權(quán)問題考慮進去， 否則可能會受制于人?？傊?，選擇一種合適的表達系統(tǒng)是開始基因表達工作前的重要步驟，選擇的主要依據(jù)是研究的目的，結(jié)合 各種其他參數(shù)的綜合考慮。這種選擇可以充分體現(xiàn)出研究者智慧和風格。YONG: 尋找載體1) pThioHisA,B,C Trc 啟動子， Thioredoxin 融合，

37、 IPTG 誘導(dǎo)，也可以用 NdeI 進行非融合表達 2) pBV220PLPR*啟動子，42度熱誘導(dǎo)，EcoRI克隆，非融合表達。 病毒所張智清、候云德等構(gòu)建，國內(nèi)很多實驗室有。3) pET系列T7啟動子，IPTG誘導(dǎo)，一般為融合表達，Ndel或Ncol非融合表達4) pQE系列載體T5啟動子,IPTG誘導(dǎo)，融合表達 原核表達載體種類非常多，下表不一定全 Features of E.coli Expression Vectors Vector NamePromoter Selection marker Tag or Fusion Partener Protease Cleavage Repl

38、icon Provider pALTER-Ex1 T7 Tet none none Promega pALTER-Ex2 T7 Tet none none PromegapBAD/His araBAD Amp N-His EK pUC Invitrogen pBAD/Myc-His araBAD Amp C-His none pUC Invitrogen pBAD/gIII araBAD Amp C-His none ColE1 Invitrogen pCal-n T7-lac Amp N-CBP Thr ColE1 Stratagene pCal-n-EK T7-lac Amp N-CBP

39、Thr ， EK ColE1 Stratagene pCal-c T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene pCal-Kc T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene pcDNA 2.1 T7 Amp none none pUC Invitrogen pDUAL T7-lac Kan C-CBP Thr ColE1 Stratagene pET-3a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen pET-9a-d T7 Kan none none pBR322 Novagen pET-11a-d T7-la

40、c Amp none none pBR322 Novagen pET-12a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen pET-14b T7 Amp N-His Thr pBR322 Novagen pET-15b T7-lac Amp N-His Thr pBR322 Novagen pET-16b T7-lac Amp N-His Xa pBR322 Novagen pET-17b T7 Amp none none pBR322 Novagen pET-19b T7-lac Amp N-His EK pBR322 Novagen pET-20b(+) T7 Amp

41、 signal sequence C-His none pBR322 Novagen pET-21a-d(+) T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen pET-22b(+) T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen pET-23a-d(+) T7 Amp C-His none pBR322 Novagen pET-24a-d(+) T7-lac Kan C-His none pBR322 Novagen pET-25b(+) T7-lac Amp signal sequence C-His non

42、e pBR322 Novagen pET-26b(+) T7-lac Kan Signal sequence C-His none pBR322 Novagen pET-27b(+) T7-lac Kan signal sequence C-His none pBR322 Novagen pET-28a-c(+) T7-lac Kan N-His C-His Thr pBR322 Novagen pET-29a-c(+) T7-lac Kan C-His Thr pBR322 Novagen pET-30a-c(+) T7-lac Kan N-His C-His Thr EK pBR322 N

43、ovagen pET-31b(+) T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen pET-32a-c(+) T7-lac Amp internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-33b(+) T7-lac Kan internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-34b(+) T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-35b(+) T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr Xa pBR322 Novag

44、en pET-36b(+) T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-37b(+) T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr Xa pBR322 Novagen pET-38b(+) T7-lac Kan signal sequence C-CBDcex C-His Thr pBR322 Novagen pET-39b(+) T7-lac Kan (signal sequence) DsbA N-His C-His Thr EK pBR322 No

45、vagen pET-40b(+) T7-lac Kan (signal sequence) DsbC N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-41a-c(+) T7-lac Kan GST N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-42a-c(+) T7-lac Kan GST N-His C-His Thr Xa pBR322 Novagen pET-43a-c(+) T7-lac Kan NusA C-His N-His Thr EK pBR322 Novagen pETBlue-1 T7-lac Amp C-His n

46、one pUC Novagen pETBlue-2 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen pETBlue-3 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen pGEMEX-1 T7 Amp T7 gene 10 none Promega pGEMEX-2 T7 Amp T7 gene 10 none Promega pGEX-1lT tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia pGEX-2T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia pGEX-2TK tac Amp GST Thr EK pBR322 Pharmacia pGEX-3X t