金黃色葡萄球菌國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法

1、金黃色葡萄球菌國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 一、國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)辦法 參見gb 4789.10-2010食品平安國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)其次法和第三法。 1、baird-parker平板計(jì)數(shù)（其次法） 本辦法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。 1.1、檢驗(yàn)流程 1.2、試驗(yàn)步驟 (1）樣品的稀釋 固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225ml緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000-10000r/min均質(zhì)1-2min，或置盛有225ml稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打12min，制成1：10的樣品勻液。 液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品，置盛有225m

2、l磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1：10的樣品勻液。 用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無菌試管中（注重吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1ml無菌吸管反復(fù)吹打使其混合勻稱，制成1：100的樣品勻液。 按操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1ml無菌吸管或吸頭。 (2）樣品的接種按照對(duì)樣品污染情況的估量，挑選2-3個(gè)相宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在舉行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分離吸取1ml樣品勻液以0.3ml, 0.3ml,

3、0.4ml接種量分離加入三塊baird-parker平板，然后用無菌l棒涂布囫圇平板，注重不要觸及平板邊緣。用法前，如baird-parker平板表面有水珠，可放在25-50的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。 (3）培養(yǎng)在通常狀況下，涂布后，將平板靜置l0min，如樣液不易汲取，可將平板放在培養(yǎng)箱（(36±1)培養(yǎng)1h；等樣品勻液汲取后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，(36±1)培養(yǎng)，45一48h。 (4)典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn) 金黃色葡萄球菌在baird-parker平板上，直徑為2-3mm,色彩呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透亮圈。用接種針接觸菌落有似

4、奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)碰到非脂肪溶解的類似菌落；但無渾濁帶及透亮圈。長(zhǎng)久保存的冷凍或干燥食品中所分別的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。 挑選有典型金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的平板，且同一稀釋度三個(gè)平板全部菌落數(shù)合計(jì)菌落數(shù)在20-200cfu的平板，計(jì)算典型菌落數(shù)。結(jié)果如下。 a最低稀釋度平板的菌落小于20且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。 b某一稀釋度平板的菌落大于200且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)當(dāng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。 c某一稀釋度平板的菌落大于200且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數(shù)不在20-200，應(yīng)

5、當(dāng)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。 d惟獨(dú)一個(gè)稀釋度平板的菌落數(shù)均在20-200且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。以上按式（1)計(jì)算。 式中，t為樣品中菌落數(shù)；a為某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；b為某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；c為某一稀釋度用于血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)；d為稀釋因子。 e. 2個(gè)延續(xù)稀釋度平板菌落數(shù)均在20一200，按式（2)計(jì)算。 式中，t為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；a1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；a2為其次稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；b1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；b2為其次稀釋度（高稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；c1

6、為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)；c2為其次稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)；1.1為計(jì)算系數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。 從典型菌落中任選5個(gè)菌落(小于5個(gè)全選），分離接種到5ml bhi肉湯和養(yǎng)分瓊脂小斜面，(36±1)培養(yǎng)18-24h。 取新奇配制兔血漿0.5ml，放入小試管中，再加入bhi培養(yǎng)物0.2-0.3ml，振蕩搖勻，置（(36±1)恒溫培養(yǎng)箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀看1次，觀看6h，如展現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)展現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)比

7、。也可用商品化的試劑，按解釋書操作，舉行凝固酶實(shí)驗(yàn)。 (5)金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)的報(bào)告按照baird-parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數(shù)，按公式計(jì)算，報(bào)告每克（每毫升）樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)，以cfu/g (cfu/ml）表示；如t為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。 舉例1: baird-parker平板計(jì)數(shù)法中10-1三個(gè)平板計(jì)數(shù)為65; 10-2三個(gè)平板計(jì)數(shù)為6,10-1血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)b為4, 10-1用于血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)c為5，那么利用公式（1)可得： t65×4×10÷5520 舉例2 ：baird-parker平板計(jì)數(shù)法中1

8、0-1三個(gè)平板計(jì)數(shù)為185; 10-2中三個(gè)平板計(jì)數(shù)為21, 10-1血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)b為3，用于血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)c為5, 10-2血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)b為4，用于血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的菌落數(shù)c為5，那么利用公式(2)可得： t(183×3÷5+21×4÷5)÷1.1×10=1151 2、mpn計(jì)數(shù)（第三法） 本辦法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。 2.1檢驗(yàn)流程 2.2操作步驟 (1)接種和培養(yǎng)按照對(duì)樣品污染情況的估量舉行樣品的稀釋，挑選3個(gè)相宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），

9、在舉行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分離吸取1ml樣品勻液接種到10%氯化鈉胰酪陳大豆肉湯管，每個(gè)稀釋度接種3管，將上述接種物（36±1)培養(yǎng)45-48h（樣品的最高稀釋度必需達(dá)到能獲得陰性盡頭）。 用接種環(huán)從有細(xì)菌生長(zhǎng)的各管中移取一環(huán)，分離接種于baird-parker平板，(36±1)培養(yǎng)45一48h。 (2）典型菌落確認(rèn)金黃色葡萄球菌在baird-parker平板上直徑為2-3mm,色彩呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透亮圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)碰到非脂肪溶解的類似菌落；但無渾濁帶及透亮圈。長(zhǎng)久保存的冷凍或干燥食品中所分別

10、的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。 從典型菌落中起碼挑取1個(gè)菌落接種到bhi肉湯和養(yǎng)分瓊脂斜面，(36±1)培養(yǎng)18-24h。舉行血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。 取新奇配制的兔血漿0.5ml放入小試管內(nèi)，再加入bhi培養(yǎng)物0.2-0.3ml，振搖勻稱置（36±1)溫箱或水浴箱內(nèi)培養(yǎng)，每半小時(shí)觀看1次，觀看6h，如浮現(xiàn)凝固（將試管傾斜或倒置時(shí)有凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物對(duì)比。結(jié)果若可疑，挑取養(yǎng)分瓊脂小斜面的菌落到5ml bhi, (36±1)培養(yǎng)18-24h，重復(fù)試驗(yàn)。 (3)結(jié)

11、果計(jì)算計(jì)算血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)陽性菌落對(duì)應(yīng)的管數(shù) 。 (4）金黃色葡萄球菌最可能數(shù)（mpn）的報(bào)告按照檢索表的數(shù)值，報(bào)告每克（每毫升）樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數(shù)，以mpn/g (mpn/ml)表示。 二、iso 6888-3:2003法 目前國際標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)辦法有：iso 6888-3:2003食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)，凝血酶陽性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌及其他種）計(jì)數(shù)的水平辦法第3部分：低數(shù)值探測(cè)和mpn技術(shù)。其檢驗(yàn)流程見圖4-22 。 在改良giolitti-cantobi肉湯接種培養(yǎng)時(shí)，接種10ml于10ml雙料肉湯，接種iml于9ml單料肉湯，并當(dāng)心地于接種管中培養(yǎng)基頂部?jī)A注一定量的水瓊脂，使其凝固形成密封塞。 確證實(shí)驗(yàn)為凝固酶實(shí)驗(yàn)。凝固酶實(shí)驗(yàn)浮現(xiàn)凝固，陽性者判定為金黃色葡萄球菌。 三、fdaibam金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)mpn法 1、檢驗(yàn)程序 2、檢驗(yàn)操作 胰蛋白陳大豆肉湯（tsb)中含1丙酮酸鈉。在金黃色葡萄球菌確證實(shí)驗(yàn)中主要包括以下內(nèi)容。 (1)凝固酶實(shí)驗(yàn) 辦法：從平板上起碼挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到tsb/bhi肉湯中，置35培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物0.3ml同0.5ml凝固酶實(shí)驗(yàn)兔血漿充分混合，置35培養(yǎng)，定時(shí)觀看是否有凝塊形成，起碼觀看6h。實(shí)驗(yàn)中需同時(shí)做已知陽性和陰性對(duì)比。 結(jié)果判定：以